Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2019, T. 55, № 5, стр. 331-338

ВВЕДЕНИЕ

Старение – биологический процесс, характеризующийся прогрессивным снижением физиологических функций, повышением оксидативного стресса, снижением возможности организма адекватно отвечать на предъявляемый стресс и увеличением риска возникновения связанных с возрастом болезней [1]. Одним из важнейших аспектов физиологии человека является естественный 24‑часовой цикл биологических процессов, особенность, присущая жизни на Земле [2]. Несмотря на связь с внешними стимулами, циркадные ритмы имеют эндогенное происхождение, представляя таким образом биологические часы организма, основными компонентами которых являются зрительный анализатор [3], эпифиз и супрахиазматическое ядро (СХЯ) гипоталамуса [4]. Годовая цикличность длины дня синхронизирует сезонные ритмы, которые у млекопитающих опосредуются ночной секрецией гормона эпифиза, мелатонина, пропорциональной длине ночи [5]. Мелатонин, эндогенный индоламин, продуцируется из триптофана и играет ключевую роль в регуляции циркадных ритмов, генерируемых СХЯ [4]. Мелатонин выполняет множество функций, включая хронобиотическую, антиоксидантную и нейропротекторную, оказывает противовоспалительный эффект, уменьшает повреждения, вызванные оксидативным стрессом [6]. Это особенно важно при старении, когда отмечается нарушение свободнорадикальных процессов.

Различные заболевания, в том числе нейродегенеративные, а также снижение продолжительности жизни, связаны с функцией циркадных часов. Так, в исследованиях с Drosophila melanogaster продолжительность жизни была снижена у трех аритмических мутантов, включающих ClkAR, cyc0 и tim0. У мутантных фенотипов отмечалось увеличение окислительного стресса, что коррелировало с потерей дофаминергических нейронов [7]. Было обнаружено нарушение ритмического метилирования BMAL1 у пациентов с болезнью Альцгеймера в нейронах мозга, т.е. очевидно, что изменения в метилировании ДНК часовых генов могут способствовать снижению когнитивной способности и изменению поведения у больных [8]. На моделях животных (болезнь Паркинсона) при использовании препарата леводопа также наблюдаются уменьшение уровней экспрессии часовых генов BMAL1 и RORα, что свидетельствует о нарушении функции циркадного ритма при долгосрочном лечении данным препаратом [9]. Старение приводит к нарушению циркадных ритмов, повышению экспрессии провоспалительных цитокинов и нарушению иммунореактивности [10]. Таким образом, исследования различных авторов свидетельствуют о значительной роли биологических часов и органов, их представляющих (СХЯ, эпифиз), в развитии заболеваний, адаптационных и инволюционных изменений, в том числе связанных с оксидативным стрессом. Нейроиммунное взаимодействие выявлено в различных органах млекопитающих, таких как передняя доля гипофиза, кожа, костный мозг, центральные (тимус) и периферические лимфатические органы и т.д. Показано наличие в гипоталамусе рецепторов к интерферону-альфа [11], что позволяет обоснованно говорить о влиянии иммуномодуляторов на деятельность нейросекреторной системы. Участие витамина Е (α‑токоферол-ацетата (α-ТФ)) в регуляции деятельности ЦНС и возможность прохождения его через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) выявлено ранее [12, 13]. В связи с этим целью нашей работы было изучение динамики и механизмов апоптоза пинеалоцитов и нейросекреторных клеток (НСК) СХЯ гипоталамуса, а также определение возможности фармакологической коррекции данных процессов (антиоксидант α-ТФ, иммуномодулятор циклоферон – индуктор эндогенного интерферона) в физиологических условиях и при стрессе у молодых и старых животных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В настоящем исследовании использованы крысы-самцы линии Wistar, молодые и старые (2–4 и 30 мес). Животных содержали по 6 особей в клетке в стандартных условиях вивария при температуре воздуха 18–22^оС и относительной влажности воздуха 50–65%. В ходе эксперимента обеспечивался свободный доступ к воде и корму. Все эксперименты выполняли в соответствии с Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р-53434-2009 “Принципы надлежащей лабораторной практики”, Приказом Минздрава РФ от 01.04.16 г. № 199н “Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики”.

В эксперименте использован один из наиболее характерных видов эмоционального стресса – иммобилизация. Животные были разделены на следующие группы 2–4-мес. (n = 6) и 30-мес. крыс (n = = 6): 1. интактные крысы (контроль); 2. крысы, получавшие масляный 10% раствор α-токоферол-ацетата (α-ТФ); 3. крысы, получавшие циклоферон (ЦФ); 4. крысы, получавшие совместно 10% масляный раствор α-ТФ и ЦФ; 5. крысы, подвергшиеся иммобилизационному стрессу в пластиковых цилиндрах по 1 часу в день в течение двух недель; 6. стрессированные крысы, получавшие предварительно 10% масляный раствор α-ТФ в тех же дозах в течение двух недель; 7. стрессированные крысы, получавшие предварительно ЦФ в тех же дозах в течение двух недель; 8. стрессированные крысы, получавшие предварительно раствор α-ТФ и ЦФ в тех же дозах в течение двух недель. Препараты вводились ежедневно per os один раз в сутки в течение 14 дней в дозах: масляный 10% раствор α‑ТФ – в дозе 0.5 мг на 100 гр. массы тела; ЦФ per os (0.77 мг. на 100 гр. массы тела – 10-месячным и 1.19 мг на 100 гр. массы тела – 30-месячным) (α-токоферол-ацетат (НИЖФАРМ, Нижний Новгород, Россия) 10% масляный раствор, циклоферон (ПОЛИСАН, Санкт-Петербург, Россия) таблетки для приема внутрь (150 мг активного вещества). Дозы препаратов рассчитывали, исходя из действующих терапевтических доз. Выведение животных из эксперимента проводилось под золетиловым наркозом (золетил 4 мг/кг массы) методом декапитации через сутки после окончания воздействия. Материал для исследования – гипоталамическая область мозга, содержащая супрахиазматическое ядро (СХЯ) и эпифиз.

Для оценки уровня апоптоза нейросекреторных клеток (НСК) СХЯ и пинеалоцитов эпифиза применен метод детекции апоптоза TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling) (нерадиоактивное мечение биотином, выявление диаминобензидином) с использованием терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазы для выявления разрывов ДНК (кит для TUNEL Sileks, Россия) (http://www.cmmr.ca/protocols/tunel_labeling.pdf). Определяли экспрессию проапоптотического белка р53 на срезах гипоталамуса, содержащих СХЯ, и эпифиза методом иммуногистохимии (ИГХ) [14] с использованием немеченных моноклональных антител (Abcam, USA) и вторичных биотинилированных антимышиных антител (Vector Lab, USA). Изображения срезов гипоталамуса, содержащих СХЯ, и эпифиза после выполнения ИГХ реакций и TUNEL были получены с помощью микроскопа PFM (WPI, USA) и видеокамеры Leika DFC 300 FX (Germany), разрешение 1392 × 1040 пикселей (увеличение × 40). Для оценки интенсивности экспрессии изучаемых белков и уровня апоптоза использовалась программа VideoTest Software (ИГУ, TUNEL). Количество апоптотических клеток (темноокрашенных, TUNEL-позитивных) подсчитывали на 4–5 срезах СХЯ и эпифиза у каждой крысы с последующим определением среднего количества TUNEL-позитивных клеток на группу.

Оптическую плотность иммунореактивного (ИР) вещества в p53-ИР клетках определяли на 5–6 срезах гипоталамуса (СХЯ) и эпифиза для каждого животного. На основании этого высчитывали среднюю оптическую плотность (выражена в относительных единицах, представляющих отношение яркости фона к яркости объекта) изучаемого белка для группы крыс.

Полученные данные были обработаны с использованием критерия Стьюдента с помощью программы Microsoft Excel 5.0a. Значимость различий при нормальном распределении количественных признаков оценивали с помощью t-критерия Стьюдента (для независимых выборок). Статистическую значимость изменений показателей в динамике у животных одной и той же группы оценивали, применяя критерий Вилкоксона для связанных выборок. Определяли статистическую достоверность различия величины изучаемых показателей в сопоставляемых группах при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Уровень апоптоза НСК СХЯ. Как известно, СХЯ играет важную роль в организации циркадных ритмов позвоночных [15], в связи с чем его морфофункциональная сохранность на всех этапах онтогенеза приобретает немаловажное значение. Мы показали, что уровень апоптоза НСК СХЯ молодых крыс невысок и увеличивается при старении (рис. 1а). Как известно, α-ТФ, как фенольный антиоксидант, обладает значительным антирадикальным действием и является универсальным протектором клеточных мембран. Модуляция концентраций внутриклеточных антиоксидантов представляет большой интерес, поскольку любое изменение приводит к цепи связанных друг с другом событий, особенно при старении и в условиях стресса. В то же время антиоксидант-активируемые молекулярные пути могут быть критическими для дизайна новых терапевтических стратегий, в том числе для борьбы с раком [16]. Введение α-ТФ и совместное действие α-ТФ и  ЦФ снижают долю апоптотических клеток в  СХЯ, тогда как использование только ЦФ не влияет на данный показатель. Иммобилизация является разновидностью психоэмоционального стресс-воздействия. При использовании иммобилизации возникают фазные изменения, характерные для психоэмоционального стресса, происходит активация симпатоадреналовой системы, изменения в системе крови, надпочечников, ЦНС, изменяется синтез белков [17]. Стандартность изменений, отсутствие дополнительных повреждающих факторов и доступность технического осуществления делают иммобилизацию целесообразной моделью стрессового воздействия. При стрессе апоптоз НСК у молодых животных несколько повышается, но введение изученных препаратов и их комбинации снижают данный показатель, приводя его к базовому уровню (рис. 1а).

Рис. 1.

Уровень апоптоза клеток в СХЯ молодых (а) и старых (б) крыс. Примечание. Здесь и везде далее: * – достоверность различий в сравнении с контрольной группой животных, p < 0.05; # – достоверность различий между группой “стресс” и группами “стресс + α-ТФ”, “стресс + ЦФ”, “стресс + α-ТФ + ЦФ” в своей возрастной группе животных, p < 0.05; о – достоверность различий между молодыми и старыми животными, p < 0.05. Группы животных: контроль – интактные крысы; α-ТФ – крысы, получавшие α-ТФ; ЦФ – крысы, получавшие циклоферон; α-ТФ+ЦФ – крысы, получавшие α-ТФ и ЦФ; стресс – крысы, подвергшиеся иммобилизационному стрессу в пластиковых цилиндрах по 1 ч в день в течение 2 нед; α-ТФ + стресс – стрессированные крысы, получавшие предварительно α-ТФ в тех же дозах в течение 2 нед; ЦФ + стресс – стрессированные крысы, получавшие предварительно ЦФ в тех же дозах в течение 2 нед; ЦФ + α-ТФ + + стресс – стрессированные крысы, получавшие предварительно α-ТФ и ЦФ в тех же дозах в течение 2 нед. Далее обозначения те же.

У старых крыс уровень апоптоза НСК СХЯ значительно выше, чем у молодых, и снижается в группе крыс, получавших α-ТФ (рис. 1б). Как известно, способность α-ТФ ингибировать свободные радикалы играет важную роль в поддержании структурно-функциональной целостности и стабильности мембран нейронов. При исследовании механизмов позитивного действия токоферола на синаптосомы показано, что он ингибирует избыточное перекисное окисление липидов (ПОЛ) и стабилизирует трансмембранный потенциал, что определяется структурирующим влиянием токоферола на бислой синаптосом. Дефицит витамина Е приводит к нарушению процесса спонтанного освобождения нейромедиаторов в регенерирующих нервных окончаниях и развитию неврологических нарушений [18]. Усиление ПОЛ служит условием для возникновения качественного нарушения ферментативной инактивации медиаторов.

ЦФ (активное вещество – акридонуксусная кислота) – лекарственный препарат, экзогенный низкомолекулярный индуктор эндогенных альфа-, бета-, гамма-интерферонов, продуцируемых лейкоцитами, макрофагами, эпителиальными клетками, тканями селезенки, печени, легких, мозга. ЦФ проникает в цитоплазму и ядерные структуры клетки, стимулирует стволовые клетки костного мозга на выработку иммунных клеток, является активатором системы естественных клеток-киллеров, стимулирует распознавание и лизис дефектных клеток, быстро проникает в плазму крови, где взаимодействует с иммунокомпетентными клетками. ЦФ отличается низкой токсичностью, отсутствием мутагенных, тератогенных, эмбриотоксических, канцерогенных эффектов, и широко применяется в клинической практике [19]. В наших экспериментах при введении ЦФ и комбинации препаратов наблюдается тенденция к снижению количества гибнущих клеток. При иммобилизационном стрессе отмечено значительное возрастание программированной клеточной гибели НСК в изучаемом центре. В группах крыс, получавших перед стрессом α-ТФ, ЦФ и их комбинацию, доля апоптотических клеток снижается (рис. 1б).

Экспрессия р53 в НСК СХЯ. Исследование экспрессии транскрипционного фактора р53, участвующего в индукции апоптоза при различных воздействиях, показало следующее. У молодых животных, получавших комбинацию антиоксиданта α‑ТФ и иммуномодулятора ЦФ, синтез р53 усиливается (рис. 2а). Иммобилизационный стресс не оказывает влияния на экспрессию р53, однако введение ЦФ и сочетания α-ТФ и ЦФ индуцирует синтез данного фактора (рис. 2а).

Рис. 2.

Содержание р53-иммунореактивного материала в клетках СХЯ молодых (а) и старых (б) крыс исследуемых групп.

У интактных старых крыс уровень экспрессии р53 в НСК СХЯ не отличается от такового у молодых (рис. 2б). Введение изучаемых препаратов и их комбинации приводит к активации синтеза р53, так же как и воздействие стресс-фактора (рис. 2б). Использование α-ТФ с последующим стрессированием не влияет на уровень р53 в НСК гипоталамуса, тогда как введение ЦФ перед стрессом приводит к повышению данного показателя (рис. 2б). Сочетанное действие препаратов на крыс, подвергшихся стрессу, снижает экспрессию р53 (рис. 2б).

Уровень апоптоза пинеалоцитов эпифиза. Многочисленные работы сообщают об участии мелатонина в регуляции апоптоза клеток различных органов [20], однако практически нет исследований динамики клеточной гибели пинеалоцитов в онтогенезе. Мы показали, что у молодых крыс невысокий изначально уровень апоптоза клеток эпифиза снижается при введении α-ТФ, ЦФ и их комбинации (рис. 3а). Стресс-индуцированное возрастание апоптоза пинеалоцитов уменьшается в случае предварительного введения изученных препаратов и их сочетания (рис. 3а).

Рис. 3.

Уровень апоптоза клеток в эпифизе молодых (а) и старых (б) крыс.

Доля апоптотических клеток в эпифизе старых крыс значительно превышает таковую у молодых (рис. 3б). Большинство авторов указывают на антиапоптотические эффекты витамина Е [21], но в последнее время появляются работы, характеризующие данный витамин как проапоптозный агент [22]. В нашей работе введение α-ТФ, ЦФ и их комбинации приводит к уменьшению количества гибнущих пинеалоцитов у старых животных. Процент апоптоза в группах старых крыс, получавших α‑ТФ и ЦФ, больше, чем в аналогичных группах молодых крыс. Уровень апоптоза у животных старшей возрастной группы так же высок, как и в контроле. Предварительное введение изученных препаратов – антиоксиданта, иммуномодулятора и их сочетания – снижает уровень программированной клеточной гибели в эпифизе на поздних этапах онтогенеза (рис. 3б).

Изменение уровня витамина Е в организме может оказывать значительное модифицирующее действие на мембранные компоненты ГЭБ и функциональное состояние мозговых структур [23], токоферол способствует усилению защитных функций ГЭБ. По данным литературы, комплексное действие препаратов α-ТФ и ЦФ приводит к нивелированию продуктов ПОЛ и окислительной модификации белков в крови и гомогенатах головного мозга, образованных в результате стресс-индуцированных процессов [23]. Таким образом, уменьшается цитоповреждающее, дестабилизирующее действие продуктов окисления на мембранные структуры ГЭБ.

Итак, выявлено антиапоптотическое действие α-ТФ на НСК СХЯ гипоталамуса как при физиологических условиях, так и при стрессе в группах молодых и старых крыс. Те же эффекты обнаружены в отношении пинеалоцитов. По данным литературы, витамин Е (α-ТФ) способен оказывать влияние на Erk1/2-киназный путь, обеспечивающий выживание клетки [24], а также индуцировать синтез антиапоптотического белка Bcl-2 [25], очевидно, это и происходит в наших экспериментах. Аналогичное влияние (снижение апоптоза НСК и пинеалоцитов), более выраженное у старых животных в контроле и при стрессе и у молодых стрессированных крыс, показано при введении иммуномодулятора ЦФ, а также комбинации исследуемых препаратов. Ранее в экспериментах нами было показано активное участие ЦФ в регуляции апоптоза НСК супраоптического и паравентрикулярного ядер, выявлена супрессия клеточной гибели, связанная со снижением уровня проапоптотического белка Вах, у молодых и старых мышей, и при стрессе – у старых животных [26].

Экспрессия р53 в эпифизе. Как известно, онкосупрессор р53 играет важную роль в контроле пролиферации и индукции апоптоза в нормальных клетках, кроме того, в экспериментах с десинхронозом показано вовлечение фактора р53 в регуляцию циркадных ритмов [27]. В наших экспериментах уровень р53 в эпифизе у молодых крыс повышается при введении α-ТФ и комбинации α-ТФ с ЦФ и значительно снижается у крыс, получавших ЦФ (рис. 4а). Уровень р53 у стрессированных животных не отличается от базового, но предварительное введение α-ТФ и ЦФ подавляет экспрессию данного белка. По некоторым данным, α-ТФ не влияет на экспрессию р53 [28], другие исследователи показали, что α-ТФ способен снижать экспрессию мутантных форм р53 [29], возможно, это и происходит в нашем эксперименте. Сочетанное применение изученных препаратов индуцирует синтез транскрипционного фактора р53 (рис. 4а). Экспрессия р53 в клетках эпифиза у интактных старых крыс не отличается от таковой у молодых, и α-ТФ не изменяет значение данного показателя (рис. 4б). Комбинация его с ЦФ снижает экспрессию р53, тогда как введение ЦФ индуцирует синтез данного белка в эпифизе, как и иммобилизационный стресс. Применение изученных препаратов перед стрессом как отдельно, так и в комбинации, снижает экспрессию р53, что коррелирует с уровнем апоптоза пинеалоцитов у старых животных (рис. 3б, 4б).

Рис. 4.

Содержание р53-иммунореактивного материала в эпифизе молодых (а) и старых (б) крыс исследуемых групп.

Сравнительный анализ действия препаратов показал, что в большинстве случаев эффект изучаемых антиоксиданта и иммуномодулятора был сходным, как при влиянии на уровень апоптоза, так и на экспрессию р53. Можно отметить более выраженное стимулирующее влияние ЦФ на экспрессию р53 как в СХЯ, так и в эпифизе.

Таким образом, в исследовании влияния иммобилизационного стресса на индукцию и механизмы программированной клеточной смерти показано, что стресс-индуцируемый апоптоз в СХЯ и эпифизе идет по р53-зависимому пути, и введение α-ТФ и ЦФ, а также их комбинации, снижает уровень апоптоза пинеалоцитов, подавляя экспрессию р53 у молодых и старых животных. В СХЯ не выявлено взаимосвязи между уровнем апоптоза и экспрессией р53 после введения изученных препаратов при стрессе, очевидно, здесь реализуются иные механизмы.