Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2020, T. 56, № 2, стр. 158-161

Многоядерные синие медьсодержащие оксидазы (MCO) – обширное семейство ферментов, встречающихся в клетках архей, прокариотов и эукариотов. Несмотря на огромные “эволюционные расстояния” между отдельными представителями этого семейства, все они характеризуются высококонсервативным набором Сu-центров, которые обеспечивают окисление разнообразных субстратов, сопровождаемое 4-х электронным восстановлением молекулы кислорода до воды. Сu-центры в этих белках принято подразделять на три типа. Центр типа 1 (T1Cu) содержит один ион меди, связанный (в подавляющем большинстве случаев) с двумя остатками гистидина, одним остатком цистеина и одним остатком метионина. Центр типа 2 (Т2Cu) также содержит единственный ион меди, лигандами которого служат два остатка гистидина. Центр типа 3 (Т3Cu) – биядерный центр, включающий два иона меди, каждый из которых связан с тремя остатками гистидина. Этот центр сближен с Т2Cu, образуя триядерный комплекс Т3Cu + Т2Cu.

В ходе каталитического акта происходит перенос электронов от восстановленной молекулы субстрата вначале на центр Т1Cu, а затем на триядерный центр Т3Cu + Т2Cu. Эта реакция осуществляется в две двухэлектронные стадии. На первой из них во взаимодействии О₂ с полностью восстановленной формой фермента формируется так называемый пероксидный интермедиат (ПИ). На второй стадии происходит восстановительное расщепление связи О–О с формированием так называемого нативного интермедиата (НИ). В нем один атом О связан с двумя ионами Cu центра Т3Cu, а второй атом О в составе гидроксильной группы ОН связан с ионом Cu центра Т2Cu [1]. НИ изучен достаточно подробно [2, 3], чего нельзя сказать о ПИ. Следует отметить, что все опубликованные до настоящего времени работы касались наиболее простых многоядерных синих оксидаз – лакказ (Lc), CotA, Fet3 и др. В настоящей работе проведено квантово-химическое исследование интермедиата ПИ гораздо более сложной оксидазы – церулоплазмина (ЦП, КФ 1.16.3.1, Fe(II):кислород оксидоредуктаза) плазмы крови человека [4].

Моделирование геометрии триядерного медного центра ЦП проводилось неограниченным по спину методом теории функционала плотности с функционалом CAM-B3LYP, учитывающим поправки на дальнодействие. В качестве базисного набора при оптимизации геометрии использовался базис def2SVP с улучшенной параметризацией. Особенностью проведения квантово-химических расчетов промежуточной ПИ структуры являлось использование подхода «нарушенной симметрии» (the broken symmetry approach, BS [5]), при этом отдельно проверялась стабильность волновой функции основного состояния. Электронные спектры поглощения рассчитывались в рамках нестационарной теории функционала плотности (TDDFT) с гибридным обменно-корреляционным функционалом B3LYP и базисом def2SVP. Для оценки зарядового распределения и электронной конфигурации атомов применялся NBO-подход. Все расчеты проводились посредством квантово-химического пакета Gaussian 16 (Revision A.03, M.J. Frisch, G.W. Trucks, H.B. Schlegel et al., Gaussian, Inc., Wallingford CT, 2016.), установленного на Huawai-кластере Вычислительного Центра СПбГУ http://www.cc.spbu.ru/.

Особенности моделирования электронной структуры. Рассматриваемый нами триядерный медный центр Т3Cu + Т2Cu содержит три иона меди, которые могут находиться в восстановленном, Cu(I), или окисленном, Cu(II), состоянии. Состояние Cu(I) характеризуется замкнутой электронной оболочкой 3d¹⁰, в то время как состояние Cu(II) подразумевает конфигурацию 3d ⁹ и наличие одного неспаренного электрона. В полностью восстановленной форме (Fully Reduced, FR) триядерного центра все три иона находятся в состоянии Cu(I). Эта форма хорошо описывается в рамках ограниченного по спину однодетерминантного подхода. Однако промежуточные структуры ПИ и НИ содержат несколько ионов Cu(II) с локализованными на них электронами, между которыми может возникать сильное спин-обменное взаимодействие. Поэтому описание электронной структуры таких комплексов требует разделения электронной плотности для α- и β-электронов, что реализуется в неограниченном по спину методе функционала плотности.

Кроме того, для таких систем с успехом применяется так называемый подход “нарушенной симметрии”. Он обеспечивает в расчетах более низкую энергию для основного синглетного состояния (BS), которое в таких молекулярных системах часто бывает спин-загрязненным более высокими спиновыми состояниями. Также BS-подход успешно используется для определения константы обменного взаимодействия J в молекулярных системах, имеющих возможные магнитные обменные взаимодействия.

Константа обменного взаимодействия J может быть рассчитана через синглет (S)-триплетное (T) расщепление, которое в простейшем случае, – для двух неспаренных электронов, выражается формулой [6]:

Здесь J – константа обменного взаимодействия (параметр Гейзенберга в гамильтониане вида $\hat {H} = - ~J{{\hat {S}}_{1}}{{\hat {S}}_{2}}$). Если J < 0, то это означает, что синглетное состояние системы ниже триплетного, и указывает на антиферромагнитный характер связывания между магнитными центрами. Если J > 0, то триплетное состояние располагается ниже синглетного, что указывает на ферромагнитный характер спин-обменного взаимодействия.

Экспериментально установлено, что в триядерном медном центре МСО наблюдается сильное антиферромагнитное связывание между медными центрами Cu(II) [3]. Поэтому мы использовали BS-подход для определения геометрии нижнего синглетного состояния и оценки константы спинового взаимодействия изучаемых структур.

Моделирование структуры пероксидного интермедиата обнаружило, что реакция восстановления O₂ до Н₂О начинается с захвата полностью восстановленным триядерным центром T3Cu(I) + T2Cu(I) молекулярного кислорода, который находится в триплетном состоянии [3]. Затем происходит передача двух электронов от двух ионов меди на молекулярный кислород с образованием пероксида (О₂)^2–. В качестве исходной для моделирования пероксидного интермедиата бралась геометрия триядерного медного центра из рентгеноструктурных данных для ЦП [4], где молекула О₂ была связана внутри медного кластера, а молекула Н₂О была выбрана в качестве лиганда на T2Cu центре.

Квантово-химические исследования модельных ПИ структур многоядерных медьсодержащих оксидаз (Lc, Fet3p, CotA) показали [2, 3], что из двух возможных ПИ структур с боковой µ-η²:η²-О$_{2}^{{2 - }}$ и мостиковой µ₃-1,2,2-${\text{O}}_{2}^{{2 - }}$ геометрией спектроскопически значимой оказалась вторая структура. Это подтвердилось спектроскопическим исследованием пероксидного аддукта (РА) от T1HgLc, кристаллографическим исследованием РА от CotA и квантово-химическими QM/MM расчетами ПИ и PA [3].

Поскольку в случае ЦП нам не удалось найти в литературе экспериментальных данных в пользу того или иного зарядового распределения на ионах меди триядерного центра, то были проведены uCAM-B3LYP/def2SVP расчеты ПИ-структуры в синглетном состоянии c тремя возможными вариантами распределения зарядов: Сu65(II)–Cu66(I)–Cu67(II), Сu65(I)–Cu66(II)–Cu67(II), Сu65(II)–Cu66(II)–Cu67(I). Здесь и далее номер при атоме меди соответствует нумерации работы [4]. При оптимизации геометрии этих структур фиксировались ионы меди и учитывалось дисперсионное взаимодействие в рамках эмпирической поправки GD3. В результате была получена только одна мостиковая µ₃-1,2,2-О$_{2}^{{2 - }}$ структура c зарядовым распределением на ионах меди Сu65(II)–Cu66(I)–Cu67(II), геометрия которой представлена в табл. 1а. Однако анализ геометрии показал, что расстояние между атомами кислорода R(O–O) = 1.31 Å, что соответствует анионной ${\text{O}}_{2}^{{1 - }}$ (R(O–O) = 1.34 Å), а не пероксидной ${\text{O}}_{2}^{{2 - }}$ форме молекулярного кислорода (R(O–O) = 1.42 Å). Поэтому дальнейшие расчеты ПИ проводились в рамках BS-метода с “загрязненной” синглетной волновой функцией. В результате полной оптимизации геометрии в состоянии с нарушенной спиновой симметрией (M_S = 0, 〈S²〉 ≈ 1) была получена мостиковая µ₃-1,2,2-${\text{O}}_{2}^{{2 - }}$ структура пероксидного интермедиата ПИ (см. рис. 1а, табл. 1b). Расстояние между атомами кислорода в этом случае оказалось равным R(O–O) = 1.392 Å, что значительно лучше соответствует пероксидной форме молекулы О₂. По всей видимости, часть электронной плотности в связанном состоянии молекулы O₂ перераспределяется по всей структуре ПИ. В таблице для сравнения также представлены некоторые расстояния модельной ПИ структуры из работы [2] и рентгеноструктурные данные для Т3Cu + Т2Cu центра ЦП [4].

Электронная структура ПИ характеризуется появлением в энергетической щели вакантных орбиталей α-НСМО (352а) и β-НСМО (352b) с энергиями –7.464 эВ и –6.814 эВ, которые представляют собой две магнитные орбитали, участвующие в обменном взаимодействии (см. рис. 1b). Обе эти орбитали содержат значительные вклады $\pi _{\sigma }^{*}$(${\text{O}}_{2}^{{2 - }}$)-орбитали и 3d–АО Cu67(II) и Сu65(II) соответственно. Более высокие НСМО локализованы преимущественно на группах C=O гистидиновых остатков и имеют энергию от –6.02 эВ и выше. Высшие занятые МО локализованы преимущественно на ионах Cu66(I) и имеют характер 3d AO; они лежат в узкой области от –11.9 эВ до –12.8 эВ. Энергетическая щель для α-МО составляет Δ_α = 5.930 эВ и для β‑МО – Δ_β = 5.868 эВ.

Электронный спектр поглощения ПИ. Характерной спектральной особенностью ПИ ЦП является полоса при 350 нм (f = 0.023). Два малоинтенсивных пика с энергиями при 345.6 нм (f = 0.010) и 352.4 нм (f = 0.011) обусловлены одноэлектронными переходами на вакантные α-НСМО (352а) и β‑НСМО (352b). Донорными орбиталями выступают дважды занятые $\pi _{\sigma }^{*}$(${\text{O}}_{2}^{{2 - }}$)-орбитали, взаимодействующие с 3d-орбиталями ионов Cu67(II) и Сu65(II). Вторая полоса при 490 нм (f = 0.066) образована несколькими состояниями с переносом заряда с π-His остатков и 3d–АО Cu67(II) и Сu65(II) на $\pi _{\sigma }^{*}$(${\text{O}}_{2}^{{2 - }}$)-орбитали. Третья широкая полоса 670 нм (f = 0.072) обусловлена многочисленными переходами преимущественно c металлических 3d-орбиталей ионов Cu66(I) на α-НСМО (352а) и β-НСМО (352b). Мы не обнаружили в литературе экспериментальные спектры поглощения ПИ ЦП, однако наши расчеты хорошо согласуются с качественным описанием экспериментального спектра поглощения ПИ T1HgLc [3], основанном на анализе последовательности НСМО и ВЗМО. В частности, авторы связывают первую высокоэнергетическую полосу 31   000–27   500 см^–1 (290–365 нм) с ${\text{O}}_{2}^{{2 - }}$($\pi _{\sigma }^{*}$) → Cu(II) ПЗ-переходами на α-НСМО на T2 Cu(II) и β-НСМО на Т3 Cu(II).

Оценка константы обменного взаимодействия. Согласно формуле (1), константа обменного взаимодействия в нашем случае оказалась равной J = = ‒99.21 см^–1. Отрицательное значение J указывает на антиферромагнитный характер спин-обменного взаимодействия между магнитными центрами Cu65(II) и Cu67(II) в пероксидном интермедиате ЦП, что согласуется с аналогичными данными для других медьсодержащих оксидаз (–2J > 200 см^–1) [3].