Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2020, T. 56, № 5, стр. 368-375

ВВЕДЕНИЕ

Дыхание сжатым (гипербарическим) кислородом имеет широкое практическое применение в медицине, при подводных погружениях, кессонных работах, в любительском и спортивном подводном плавании. Вместе с тем безопасность использования гипербарического кислорода (ГБО₂) относительна из-за риска его токсического действия на ЦНС, проявляющегося на финальной стадии в виде мышечных тонических и клонических судорог, аналогичных генерализованному эпилептическому припадку [1–5]. Несмотря на многолетние исследования судорог в ГБО₂, получивших название “кислородная эпилепсия” [2], их патогенез до сих пор остается малоизученным. Кислородная эпилепсия сопровождается гиперактивацией симпатического отдела вегетативной нервной системы, проявляющейся в нарушениях деятельности сердца и легких, что позволяет использовать показатели внешнего дыхания и частоты сердечных сокращений как продромальные маркеры судорог в ГБО₂ [6–8]. Ранее для изучения механизмов сердечно-сосудистых реакций и развития судорог в токсической гипероксии использовалось системное блокирование α- и β-адренорецепторов у крыс путем внутрибрюшинного введения их антагонистов: фентоламина, празозина, пропранолола и атенолола [9]. Исследования показали, что каждый из указанных препаратов ослаблял реакции легких и сердца на гипероксический стимул, но только фентоламин и пропранолол достоверно увеличивали латентный период появления кислородных судорог. Поскольку адренолитики вводились внутрибрюшинно, а некоторые из них, например, атенолол, не проникают через гематоэнцефалический барьер [10], остается открытым вопрос об участии адренергической системы головного мозга в развитии судорожного синдрома при гипербарической гипероксии. Важнейшим структурным элементом центральной адренергической системы являются α- и β-адренорецепторы, медиаторами для которых являются адреналин и норадреналин. В ЦНС обнаружены α₁-, α₂-, β₁-, β₂, β₃-адренорецепторы, различающиеся по локализации, сродству к медиаторам и опосредуемым эффектам [11, 12]. Адренорецепторы неравномерно распределены по головному мозгу и в отдельных его структурах могут преобладать разные типы рецепторов. Так, на нейронах голубого пятна присутствуют α- и β-адренорецепторы. Во фронтальной коре из β-адренорецепторов преобладает β₁-, а в мозжечке – β₂-подтип. Кроме того, в головном мозге экспрессируются гены трех подтипов α₂-адренорецепторов, в частности в коре, гипоталамусе и голубом пятне ствола мозга преобладает α₂А, в полосатом теле – α₂С, а α₂В-подтип преобладает в таламусе [13–15]. Функциональное значение α- и β-адренорецепторов в головном мозге остается до сих пор малоизученным, а их роль в физиологических и патологических реакциях на гипероксию ранее не исследовалась.

Целью настоящей работы являлось изучение участия α- и β-адренорецепторов головного мозга крыс в развитии эпилептиформных судорог при токсической гипероксии. Впервые в одном исследовании сравнивалось влияние α- и β-адренорецепторов на развитие кислородной эпилепсии путем их блокирования с помощью селективных и неселективных антагонистов, вводимых непосредственно в желудочки мозга. Данный способ блокирования адренорецепторов позволяет исключить эффекты периферийных рецепторов, активация которых затрудняет анализ роли центральных адренергических механизмов в развитии кислородных судорог.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследования выполнены на бодрствующих крысах-самцах Вистар весом 286–348 г в барокамере под действием повышенного давления кислорода 5 АТА. Протокол опытов одобрен Комиссией по этике ИЭФБ РАН в соответствии с “Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных” (CIOMS, Женева, 1985). За 5–7 дней до проведения экспериментов каждому животному под наркозом (нембутал 50 мг/кг, внутрибрюшинно) согласно стереотаксическим координатам АР = –1.0 мм, LM = +/–1.5 мм, V = 3.5 мм в боковой желудочек мозга вживляли металлическую канюлю с наружным диаметром 0.24 мм, а в стриатум (координаты АР = +1.0 мм, LM = +/–2.5 мм, V = 5.5 мм) вводили парные игольчатые электроды из платиновой проволоки диаметром 0.15 мм. В теменную кость черепа билатерально ввинчивали 2 стальных винта, которые вместе с канюлей и электродами фиксировали на кости зубопротезным цементом. В день опыта животному под эфирным наркозом на груди устанавливали дисковые металлические электроды и в бедренную артерию вводили полиэтиленовый катетер. Парные платиновые электроды, изолированные по всей длине, за исключением кончика 1–2 мм, использовали для измерения кровотока в стриатуме методом клиренса водорода [16]. Стальные винты в черепе использовали для непрерывной регистрации биоэлектрической активности головного мозга (ЭЭГ), а дисковые электроды на груди – для мониторинга электрокардиограммы (ЭКГ). Катетеры в бедренной артерии использовались для измерений артериального давления (АД). Через канюли в желудочек мозга вводили празозин (селективный блокатор α₁-адренорецепторов), фентоламин (неселективный блокатор α₁ и α₂-адренорецепторов), атенолол (селективный блокатор β₁-адренорецепторов) и пропранолол (неселективный блокатор β₁ и β₂ – адренорецепторов). Препараты (Sigma Aldrich, Германия) растворяли в искусственном ликворе (ИЛ) и инъецировали в боковой желудочек мозга через введенную в канюлю иглу, соединенную с микрошприцем (Hamilton, 50 мкл). Доза вводимых препаратов составляла 20 мкг/10 мкл искусственного ликвора с продолжительностью введения 2 мин. Контрольной группе крыс вводили искусственный ликвор в объеме 10 мкл.

В работе использовано 47 крыс, разделенных на 5 групп по числу применяемых адреноблокаторов и одной контрольной. В состав каждой группы входило 8–11 животных, на которых проводили однократные опыты. Порядок проведения опытов был следующим. За 30 мин до кислородной экспозиции животным через имплантированные канюли в желудочки мозга вводили антагонисты адренорецепторов или искусственный ликвор. Каждое животное, оснащенное мозговой канюлей, электродами и катетером, размещали в барокамере в специально изготовленной матерчатой жилетке, мягко фиксирующей крысу в подвешенном горизонтальном положении. К такому положению животное приучали в процессе предварительной тренировки. После 10-минутной стабилизации измеряли контрольные значения физиологических параметров при дыхании атмосферным воздухом, а затем давление в барокамере повышали чистым кислородом до 5 АТА. Животное дышало сжатым кислородом до появления генерализованных судорог или максимально 90 мин. При введении ликвора (контроль) или прозазина продолжительность кислородной экспозиции составляла 60 мин, так как у всех этих животных судороги появлялись в течение часового пребывания в барокамере. В период ГБО₂-экспозиции осуществляли непрерывное видеонаблюдение за животным и фиксировали время появления нарушений двигательной активности, а также начало генерализованных судорог. Физиологические параметры (АД, ЭЭГ и ЭКГ) регистрировали непрерывно, а кривые клиренса водорода – каждые 10 мин. После опытов проводили расчет абсолютных величин мозгового кровотока по кривым клиренса водорода, оценивали активность симпатической и парасимпатической нервной системы на основании коэффициента вагосимпатического баланса (LF/HF) как отношение мощности волн низкой частоты (LF) к мощности волн высокой частоты (HF) спектра сердечного ритма. По записям АД и ЭКГ рассчитывали коэффициент чувствительности барорефлекса [17] и определяли время появления судорожной активности на ЭЭГ. Респираторная функция у крыс оценивалась по числу дыхательных волн на записях артериального давления. Сбор экспериментальных данных и расчеты указанных параметров физиологических реакций осуществляли с помощью специализированных программ (WINDAQ, OH, USA и iWORK, CA, США). Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием программного обеспечения StatView (StatView, version 3, Triange Park, NC, США). Достоверные различия оценивали по парному t-критерию. Данные представлены как M ± SEM, при этом значения p < 0.05 принимались статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

У крыс контрольной группы, которым в желудочки мозга вводился искусственный ликвор, в период ГБО₂-экспозиции были выявлены характерные двигательные нарушения, развивающиеся в определенной стадийной последовательности (табл. 1).

Стадия 1 характеризовалась появлением интенсивного груминга и одиночных миоклоний мышц головы и передних лап. На стадии 2 наблюдались повторяющиеся локальные сокращения мышц мордочки, головы и передних конечностей продолжительностью до 10 сек с повторением через 1–3 мин. На стадии 3 у животных появлялись ритмические сокращения мышц всего тела продолжительностью до 5 сек и встряхивания типа эффекта “мокрой собаки” с характерными вращательными движениями хвоста. Стадия 4 характеризовалась генерализованными клоническими или тоническими конвульсиями, отчетливо заметными у животных даже в мягкой тканевой жилетке. У крыс, которым вводились антагонисты адренорецепторов, стадийное развитие судорожного синдрома сохранялось, но противосудорожная эффективность препаратов заметно различалась. Статистически достоверная задержка в появлении каждой стадии судорожного синдрома по отношению к контрольным значениям наблюдалась у животных, которым предварительно вводили в мозг пропранолол или фентоламин (табл. 1). Наибольший противосудорожный эффект вызывал пропранолол, при введении которого 4-я стадия двигательных нарушений в ГБО₂ проявилась только у 2 из 11 крыс.

Во время кислородной компрессии у контрольных животных АД повышалось на 19–32% и оставалось на таком уровне 20–30 мин ГБО₂-экспозиции, но на стадии 4 двигательных расстройств среднее артериальное давление повторно возрастало на 37–52% по отношению к уровню до кислородной экспозиции. Блокада адренорецепторов перед компрессией кислородом не влияла на первый подъем давления, но достоверно ослабляла его последующее повышение после введения пропранолола (p < 0.008), атенолола (p < 0.05) и фентоламина (p < 0.05), которые предотвращали острую гипертензию и судороги, наблюдаемые у контрольных животных (рис. 1).

Рис. 1.

Динамика артериального давления у крыс во время ГБО₂-экспозиции при давлении кислорода 5 АТА после введения адреноблокаторов в мозговой желудочек. При введении ликвора или прозазина продолжительность экспозиции 60 мин. По оси абсцисс: время ГБО₂-экспозиции, мин. По оси ординат: изменение артериального давления в % к значениям при дыхании воздухом.

Fig. 1. Time course of blood pressure in rats during HBO₂ at 5 ATA after blockade of cerebral adrenergic receptors. During injection of cerebrospinal fluid (control) or prazosin, HBO₂ exposure time was 60 min. Abscissa: oxygen breathing time, min. Ordinate: changes in arterial pressure, % vs. initial values during breathing atmospheric air.

Частота сердечных сокращений в экстремальной гипероксической среде у крыс контрольной группы менялась двухфазно: брадикардия в начале экспозиции с последующим развитием тахикардии (рис. 2). Генерализованный судорожный припадок всегда сопровождался тахикардией и гипервентиляцией. Значение коэффициента вагосимпатического баланса (LF/HF) при дыхании воздухом (контроль) составило 0.24 ± 0.05, через 30 мин ГБО₂   увеличилось до 0.36 ± 0.06 (p < 0.05), а в конце кислородной экспозиции понизилось до 0.17 ± 0.02 (p < 0.05). Эти данные свидетельствуют о преобладании парасимпатической активности в начальный период ГБО₂ и о выраженном влиянии симпатического отдела вегетативной нервной системы на сердечный ритм. Из четырех адреноблокаторов пропранолол в большей степени (p < 0.001) предотвращал тахикардию, развивающуюся после 30 мин ГБО₂-экспозиции (рис. 2).

Рис. 2.

Частота сердечных сокращений у крыс во время ГБО₂-экспозиции при давлении кислорода 5 АТА после блокады адренорецепторов головного мозга. По оси абсцисс: время ГБО₂-экспозиции, мин. По оси ординат: изменение частоты сердечных сокращений в % к значениям при дыхании воздухом.

Fig. 2. Heart rate in rats during HBO₂ exposure at 5 ATA after blockade of adrenergic receptors. Abscissa: oxygen breathing time, min. Ordinate: changes in heart rate, % vs. initial values during breathing atmospheric air.

Мозговой кровоток в стриатуме у контрольных крыс в ГБО₂ менялся разнонаправленно: снижался в начале экспозиции и увеличивался через 30–40 мин экстремальной гипероксии. Среди антагонистов адренорецепторов только пропранолол достоверно (p < 0.001) предотвращал увеличение кровотока в ходе экспозиции ГБО₂ (рис. 3). Неселективный блокатор β₁- и β₂-рецепторов пропранолол наиболее эффективно предотвращал также нарушение сердечного ритма, изменения артериального давления и мозгового кровотока при дыхании сжатым кислородом под давлением 5 АТА, а также купировал появление эпилептиформных разрядов на ЭЭГ и моторных судорог.

Рис. 3.

Кровоток в стриатуме головного мозга крыс во время ГБО₂-экспозиции при давлении кислорода 5 АТА после введения в мозговой желудочек блокаторов адренорецепторов. По оси абсцисс: время ГБО₂-экспозиции, мин. По оси ординат: изменение кровотока в % к значениям при дыхании воздухом.

Fig. 3. Blood flow in the striatum during HBО₂ exposure at 5 ATA after the administration of adrenergic receptor blockers into the cerebral ventricle. Abscissa: oxygen breathing time, min. Ordinate: changes in blood flow, % vs. initial values during breathing atmospheric air.

Эффективность барорефлекса в ГБО₂ менялась также двухфазно: повышалась в первые 30 мин и полностью утрачивалась на четвертой стадии развития кислородных судорог (рис. 4).

Рис. 4.

Изменение чувствительности барорефлекса (ЧБР) крыс во время ГБО₂-экспозиции при давлении кислорода 5 АТА после блокады адренорецепторов мозга. По оси абсцисс: время ГБО₂-экспозиции, мин. По оси ординат: изменение ЧБР. * p < 0.05 к значениям при введении ликвора.

Fig. 4. Changes in baroreflex sensitivity (BRS) during HBO₂ at 5 ATA after blockade of brain adrenergic receptors. Abscissa: oxygen breathing time, min. Ordinate: changes in baroreflex sensitivity, ms/mm Hg. *p < 0.05 vs. control.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящих исследованиях установлено, что развитие судорожного синдрома в ГБО₂ сопровождалось высокой активностью симпатического отдела вегетативной нервной системы, которая проявлялась в виде гипервентиляции, тахикардии и острой гипертензии. Мы предположили, что адренорецепторы головного мозга принимают участие в реализации вегетативных реакций и в развитии кислородных судорог. Для проверки этой гипотезы в опытах на крысах мы блокировали α- и β-адренорецепторы путем внутрижелудочкового введения их селективных и неселективных антагонистов. Последующий анализ реакций ЦНС и вегетативной нервной системы на токсическое действие кислорода под давлением показал, что: (а) у животных с интактными адренорецепторами судорожный синдром развивался последовательно от локальных миоклоний до генерализованных конвульсий, а реакции дыхательной и сердечно-сосудистой систем носили фазный характер, (б) блокада α- и β-адренорецепторов задерживала развитие судорожного синдрома и ослабляла сердечно-сосудистые реакции.

Выявленные вегетативные реакции крыс при дыхании чистым кислородом под давлением 5 АТА носили двухфазный характер. В первые 20–30 мин гипероксии отмечались гиповентиляция легких, умеренная брадикардия и церебральная вазоконстрикция, а продолжение ГБО₂-экспозиции приводило к развитию гипервентиляции, тахикардии и острой артериальной гипертензии. Первая фаза реакций является проявлением гипероксического барорефлекса [17, 18], который реализуются путем уменьшения симпатических и увеличения парасимпатических влияний на сердце и сосуды. В физиологическом значении такие реакции ограничивают доставку токсической дозы кислорода к органам и тканям. Существенный вклад в ограничение избыточной доставки кислорода к мозгу вносит также церебральная вазоконстрикция, выявленная в данной работе в виде понижения мозгового кровотока в первые 15–20 мин ГБО₂-экспозиции. Важно отметить, что гипероксическая вазоконстрикция не связана с функцией адренорецепторов, так как в наших опытах снижение мозгового кровотока в период компрессии кислородом сохранялось после введения каждого из используемых антагонистов. Как ранее было показано, вазоконстрикция в мозге осуществляется за счет блокирования выделения оксида азота (NO) из эритроцитов при повышенном Ро₂ в крови [19] и связывания NO супероксидными анионами в эндотелии сосудов с последующей утратой NО-опосредованного вазодилататорного тонуса [20–22].

Пролонгирование ГБО₂-экспозиции приводило к развитию второй фазы сердечно-сосудистых реакций. Анализ частотного спектра сердечного ритма выявил повышение активности симпатического отдела автономной нервной системы. Чувствительность барорефлекса резко снижалась и полностью утрачивалась на фоне высокой активации симпатического отдела вегетативной нервной системы. В других исследованиях в этот период наблюдались положительные хронотропный и инотропный эффекты работы сердца, высокая активность почечного симпатического нерва и значительное увеличение содержания в плазме крови адреналина и норадреналина [18, 23].

Блокада α- и β-адренорецепторов в головном мозге изменяла реакции ЦНС и вегетативной нервной системы на экстремальную гипероксию в зависимости от типа использованных антагонистов. После селективного блокирования α₁-рецепторов с помощью празозина время появления двигательных нарушений в ГБО₂ и последовательность их появления, равно как и параметры фазных висцеральных реакций, достоверно не отличались от аналогичных ответов, наблюдаемых у контрольной группы животных. Фентоламин, неселективный блокатор группы α-адренорецепторов, оказывал более выраженное противосудорожное действие, чем празозин, но параметры первой фазы висцеральных реакций достоверно не отличались от контрольных значений. Селективный антагонист β₁-рецепторов, атенолол, не ослаблял реакций первой фазы, но задерживал развитие второй фазы сердечно-сосудистых реакций и увеличение кровотока в стриатуме. Противосудорожные эффекты внутримозговой инъекции атенолола были более выраженными, чем при внутрибрюшинном введении этого препарата [9]. Выявленное различие является подтверждением того, что атенолол не проникает через гематоэнцефалический барьер и, в случае внутрибрюшинного введения, его эффекты распространяются только на периферические β₁-адренорецепторы. Среди использованных нами адреноблокаторов наиболее выраженная способность в ослаблении симпатической активности и в предупреждении кислородных судорог выявлена у пропранолола. Этот неселективный блокатор β₁- и β₂-адренорецепторов эффективно противодействовал развитию судорожной активности у животных в ГБО₂, начиная с предупреждения начальных стадий двигательных нарушений.

Сравнивая эффекты адреноблокаторов, следует отметить, что все использованные адренолитики не ослабляли первую стадию сердечно-сосудистых реакций и, за исключением празозина, задерживали вторую фазу реакций кровообращения и развитие судорожного синдрома. Эффекты пропранолола заметно отличались от действия других адреноблокаторов. Выключение двух подтипов β‑адренорецепторов стабилизировало деятельность легких, сердца и сосудов, предотвращало гиперемию в мозге и защищало от ГБО₂-вызванных судорожных приступов в течение 90 мин экспозиции. Поскольку селективная блокада β₁-адренорецепторов с помощью атенолола в наших опытах не предотвращала кислородные судороги, можно заключить, что противосудорожный эффект пропранолола связан с блокированием β₂-адренорецепторов. Эти рецепторы обнаружены на сосудах мозга, нервных и глиальных клетках [12, 24]. Их различная локализация в мозге затрудняет анализ механизма противосудорожного действия пропранолола в ГБО₂. Ряд исследователей полагают, что способность пропранолола предотвращать судороги не связана с блокадой β-адренорецепторов. Так, противосудорожная эффективность пропранолола показана на моделях электрошоковых [25, 26], пентилентетразоловых [27] и киндлинговых [28] судорог. Существуют также данные о применении пропранолола для лечения эпилепсии [28] и других неврологических расстройств различной этиологии [29, 30]. Противосудорожный эффект пропранолола связывают с блокированием натриевых каналов, что ограничивает распространение нейронального возбуждения за счет стабилизации мембран тела нервной клетки и аксонов в области синапса по типу действия фенитоина или карбамазепина [28]. Следует также отметить способность пропранолола уменьшать мозговой кровоток, видимо, через блокирование β₂-адренорецепторов сосудов [31]. В наших экспериментах такой “сосудистый” механизм действия пропранолола проявлялся как устранение гиперемии в стриатуме у крыс в ГБО₂ после неселективного блокирования β-рецепторов.

Таким образом, выполненные исследования позволяют заключить, что предвестником эпилептиформных кислородных судорог является чрезмерная центральная адренергическая медиация. Активация адренорецепторов при токсической гипероксии может приводить к возбуждению клеток-мишеней во многих структурах мозга и облегчать развитие генерализованного гипервозбуждения, проявляющегося в виде эпилептиформной ЭЭГ-активности и моторных конвульсий. Блокирование β-адренорецепторов посредством внутримозгового введения пропранолола предотвращает чрезмерную симпатическую активность в ГБО₂ и купирует развитие судорожного синдрома. Полученные результаты могут быть использованы для разработки методов предупреждения судорог при дыхании кислородом под давлением с целью более эффективного и безопасного использования гипербарического кислорода в медицине и при подводных погружениях.