Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2022, T. 58, № 1, стр. 51-60

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для экспериментов были взяты трехмесячные самцы крыс Wistar, которых содержали на стандартном рационе со свободным доступом к пище и воде. Все процедуры проводили в соответствии с правилами, разработанными и утвержденными Комитетом по биоэтике ИЭФБ РАН (15.02.2018 г.), и требованиями, изложенными в документах “European Communities Council Directive 1986” (86/609/EEC) и “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”.

Синтез TP03 осуществляли путем ацилирования 5-амино-4-(3-аминофенил)-N-трет-бутил-2-(метилсульфанил)тиено[2,3-d]-пиримидин-6-карбоксамида, как описано ранее [11]. Для этого 1.0 эквивалент ацилируемого агента смешивали с 1.1 эквивалента никотиновой кислоты, 1.1 эквивалента гексафторфосфата 1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний 3-оксида и 1.2 эквивалента N,N-диизопропилэтиламина в сухом N,N-диметилформамиде. Реакцию проводили в течение 5 ч при комнатной температуре, целевые продукты очищали с помощью перекристаллизации из этанола и адсорбционной колоночной хроматографии. Структуру TP03 подтверждали с помощью ¹H-ЯМР и ¹³С-ЯМР спектроскопии, используя спектрометр Bruker Avance III 400 (“Bruker”, Германия), и данных масс-спектрометрии, используя спектрометр micrOTOF (“Bruker”, Германия). Молекулярная масса TP03 составила 515.1301 (рассчитанная масса для иона [M+Na⁺] составила 515.1294).

Для оценки стероидогенного эффекта самцам крыс однократно или в течение 5 дней вводили TP03 в диметилсульфоксиде (ДМСО) и ХГЧ (“Московский эндокринологический завод”, Россия) в физиологическом растворе. Препараты вводили ежедневно в 11.00 в/б, п/к (в область левой лопатки), в случае TP03 также перорально. Контрольным животным вместо препаратов в те же сроки и в тех же объемах в/б, п/к или перорально вводили ДМСО или физиологический раствор. Поскольку по результатам предварительных экспериментов оба растворителя при различных способах введения не оказывали значимого влияния на уровни тестостерона, то в основных экспериментах в качестве контрольных групп использовали крыс с в/б введением ДМСО (обработка TP03) и п/к введением физиологического раствора (обработка ХГЧ). В основном эксперименте в каждой группе было по пять животных. При этом сначала крысам ТП03, ХГЧ и их растворители вводили однократно, а через неделю отдыха соответствующим группам животных те же препараты вводили в течение пяти дней. Тем самым, в общей сложности в экспериментах использовали 35 животных, которых распределили на 7 групп.

Для исследования были выбраны дозы TP03 и ХГЧ, при которых, по результатам предварительных экспериментов по изучению зависимости “доза-эффект” (табл. 1), повышение уровня тестостерона составило 65–75% от максимального. При однократном введении концентрацию тестостерона в крови оценивали до (10.00) и через 1 ч (11.00), 3 ч (13.00) и 5 ч (15.00) после введения препаратов, при пятидневном введении за день до введения препаратов (13.00) и ежедневно через 3 ч после введения (13.00). Образцы крови забирали из хвостовой вены с предварительной местной анестезией крыс с помощью 2%-ного раствора лидокаина из расчета 2–4 мг/кг. Уровень тестостерона определяли с помощью набора “Тестостерон-ИФА” (“Алкор-Био”, Россия) и спектрофотометра “Anthos Absorbance Reader 2020” (Австрия). В конце эксперимента (на 5-й день через 3 ч после введения препарата) крыс наркотизировали, используя ингаляцию 4–5%-ным (v/v) изофлураном, и забирали у них семенники для оценки экспрессии генов.

Экспрессию мРНК для гена Lhr, кодирующего рецептор ЛГ, и для генов Star, Cyp11a1, Cyp17a1, Hsd3b и Hsd17b, кодирующих холестерин-транспортирующий белок StAR, цитохромы Р450_scc и Р450-17α и 3β-гидростероиддегидрогеназы 3β и 17β соответственно, осуществляли с помощью ПЦР в реальном времени. Для этого из семенников выделяли тотальную РНК с помощью реагента ExtractRNA (“Evrogen”, Россия). Обратную транскрипцию проводили с помощью набора MMLV RT Kit (“Evrogen”, Россия), экспрессию оценивали с помощью амплификатора 7500 Real-Time PCR System (“Thermo Fisher Scientific Inc.”, США). Для оценки экспрессии генов целевых белков использовали следующие праймеры: Lhr – CTGCGCTGTCCTGGCC (For), CGACCTCATTAAGTCCCCTGAA (Rev); Star – AAGGCTGGAAGAAGGAAAGC (For), CACCTGGCACCACCTTACTT (Rev); Cyp11a1 – TATTCCGCTTTGCCTTTGAG (For), CACGATCTCCTCCAACATCC (Rev); Hsd3b – AGGCCTGTGTCCAAGCTAGTGT (For), CTCGGCCATCTTTTTGCTGTAT (Rev); Cyp17a1 – CATCCCCCACAAGGCTAAC (For), TGTGTCCTTGGGGACAGTAAA (Rev); Hsd17b – CCTTTGGCTTTGCCATGAGA (For), CAATCCATCCTGCTCCAACCT (Rev), структура которых была описана ранее [19]. Подбор праймеров осуществляли с помощью программы Primer BLAST NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/), а также на основе данных литературы. В качестве референсных использовали гены Actb и Gapdh, кодирующие β-актин и глицеральдегидфосфатдегидрогеназу. Результаты анализировали с помощью метода ΔΔС_t и программного обеспечения 7500 Software v2.0.6 и Expression Suite Software v1.0.3. Значения RQ рассчитывали по отношению к контрольной группе, получавшей в течение 5 дней ДМСО (в/б).

Статистический анализ проводили с помощью программы “Microsoft Office Excel 2007”. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для сравнения двух выборок с нормальным распределением использовали t-критерий Стьюдента. Статистически значимыми считали отличия при уровне значимости p < 0.05. Данные представляли как M ± SEM.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основываясь на зависимости “доза-эффект” для различных способов введения препаратов были выбраны дозы 20 мг/кг для в/б и п/к введения, доза 40 мг/кг для перорального введения TP03 и доза 20 МЕ/крысу для в/б и п/к введения ХГЧ. В этих дозах достигался 65–75% от максимального стероидогенного эффекта препарата при соответствующем способе введения (табл. 1).

При однократном введении показано, что в случае TP03 наиболее эффективным было в/б введение, в то время как п/к и пероральный способы были сопоставимыми и по максимальному стероидогенному эффекту, и по значениям AUC_1–5(ч), представляющим интегрированную площадь под кривой “концентрация тестостерона (нМ)-время(ч)” (табл. 2). При п/к и пероральном введении стимулирующий эффект TP03 запаздывал по сравнению с таковым при в/б введении (табл. 2). В случае ХГЧ п/к введение было более эффективным, позволяя уже через 1 ч после введения препарата достичь значительного повышения уровня тестостерона. Значение AUC_1–5(ч) для п/к введения на 30% превышало таковое при в/б введении гонадотропина (табл. 2).

Введение препаратов в течение 5 дней также показало более высокую эффективность в/б введения TP03 по сравнению с п/к и пероральным введением и п/к введения ХГЧ по сравнению с в/б введением. На это указывают как динамика изменения уровня тестостерона в крови животных, так и значения AUC_1–5(д), представляющие собой интегрированную площадь под кривой “концентрация тестостерона (нМ)-время(дни)” (рис. 1).

Рис. 1.

Уровни тестостерона в крови (a) и значения AUC_1–5(д) (b) при внутрибрюшинном, подкожном и пероральном введении TP03 и подкожном и внутрибрюшинном введении ХГЧ в течение пяти дней самцам крыс Wistar.

Обозначения: 1 – контроль-1, ДМСО, в/б; 2 – TP03, 20 мг/кг, в/б; 3 – TP03, 20 мг/кг, п/к; 4 – TP03, 40 мг/кг, перорально; 5 – контроль-2, физиологический раствор, п/к; 6 – ХГЧ, 20 МЕ/крысу, п/к; 7 – ХГЧ, 20 МЕ/крысу, в/б.

На рисунке 1b: ^a – различия между группами с обработкой препаратами и соответствующими контролями статистически значимы при p < 0.05; ^b – различия между в/б и п/к введением статистически значимы при p < 0.05; ^с – различия между в/б и пероральным введением статистически значимы при p < 0.05. n = 5. M ± SEM.

Далее исследовали влияние TP03 и ХГЧ на экспрессию гена Lhr, кодирующего рецептор ЛГ, а также на экспрессию генов Star, Cyp11a1, Cyp17a1, Hsd3b и Hsd17b, кодирующих холестерин-транспортирующий StAR-белок, и стероидогенные ферменты – цитохромы Р450_scc и Р450-17α и гидростероиддегидрогеназы-3β и -17β соответственно. Было выявлено не только различие между эффектами TP03 и ХГЧ на экспрессию исследуемых генов, но и влияние на них способа доставки препарата. Так, TP03 при в/б введении повышал экспрессию гена Lhr, а при п/к и пероральном введении практически не влиял на нее. В то же время ХГЧ при обоих исследованных способах доставки значимо снижал экспрессию гена рецептора ЛГ (табл. 3). Все препараты, хотя и в различной степени, повышали экспрессию гена Star, но различия с контролем были статистически значимы только для обоих способов введения ХГЧ и в/б введения TP03 (табл. 3). При в/б введении TP03 повышал экспрессию гена Cyp17a, а при п/к – экспрессию гена Hsd17b. При пероральном способе введения, несмотря на выраженный стероидогенный эффект, ТП03 не оказывал заметного влияния на экспрессию генов, кодирующих стероидогенные ферменты (табл. 3). При п/к введении ХГЧ в среднем в 6 раз повышал экспрессию генов обоих цитохромов, в то время как при в/б введении гонадотропин в значительной степени повышал экспрессию гена Hsd17b и в меньшей степени экспрессию генов Cyp11a и Cyp17a (табл. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные нами данные указывают на то, что низкомолекулярный аллостерический агонист TP03 в наибольшей степени повышает уровень тестостерона при его в/б введении самцам крыс, как при однократном введении, так и в течение 5 дней. П/к и пероральный способы введения в этом отношении были менее эффективными, причем снижался не только максимальный и суммарный (AUC) стероидогенный эффект TP03, но и отмечалось отставание, в сравнении с в/б введением, в динамике развития этого эффекта. Причиной этого, как мы полагаем, является то, что гидрофобный по природе тиено[2,3-d]-пиримидин сравнительно медленно поступает в кровь при п/к и пероральном введении и в меньших количествах достигает основных мишеней своего действия – тестикулярных клеток Лейдига, в которых осуществляются все стадии синтеза тестостерона. Следует отметить, что, несмотря на сниженную эффективность стероидогенного эффекта TP03, пероральный способ введения имеет большие перспективы, поскольку позволяет избежать инъекционных способов введения препарата, что расширяет сферу его применения в фармакологии. Устойчивость в желудочно-кишечном тракте и способность всасываться в кровь при пероральном введении являются значимыми преимуществами тиено[2,3-d]-пиримидиновых производных перед гонадотропинами, которые могут вводиться только инъекционным путем.

Как известно, ХГЧ широко применяют для лечения гипогонадотропного гипогонадизма у мужчин [5] и индукции созревания ооцитов и обеспечения поддержания лютеиновой фазы в ходе in vitro фертилизации у женщин [20], причем вводят его либо п/к, либо внутримышечно [15]. При осуществлении контролируемой индукции овуляции в последние годы также апробируют внутриматочное введение ХГЧ [21]. Несмотря на то, что изначально традиционным путем введения ХГЧ считали внутримышечные инъекции, п/к способ в настоящее время считают предпочтительным, поскольку он обеспечивает желаемый клинический эффект с меньшими неудобствами для пациента и не уступает внутримышечному по эффективности [15]. В/б введение ХГЧ в медицине не используют, но этот способ нашел применение при изучении физиологических эффектов гонадотропина в экспериментах на животных, в том числе при исследовании его стероидогенного эффекта [16–18], а также наиболее широко применяется для введения низкомолекулярных агонистов рецепторов гонадотропинов [8, 10, 11].

Нами показано, что при п/к введении ХГЧ его стимулирующий эффект на уровень тестостерона существенно превосходит таковой при в/б введении, о чем свидетельствуют более высокие значения AUC_1–5(ч) и AUC_1–5(д) и более выраженный максимальный стероидогенный эффект гонадотропина. При этом в случае п/к введения значимый подъем уровня тестостерона отмечается уже через 1 ч после введения гонадотропина, составляя 57% от такового через 3 ч после п/к введения. В то же время, как при в/б введении подъем уровня тестостерона через 1 ч составляет всего 29% от такового через 3 ч, что указывает на более медленное поступление препарата к клеткам Лейдига (табл. 2).

Выявленные нами различия в динамике и эффективности стероидогенного эффекта TP03 и ХГЧ при различных способах введении ассоциированы и с различиями их влияния на экспрессию стероидогенных ферментов и рецептора ЛГ. Необходимо отметить, что такой сравнительный анализ был проведен впервые как для низкомолекулярных агонистов рецептора ЛГ, так и для ХГЧ. Поскольку исследование проводили на 5-й день эксперимента, после длительной активации рецептора ЛГ и всей системы тестикулярного стероидогенеза, то различия в экспрессии, как мы полагаем, могут быть обусловлены не столько эффективностью действия самих агонистов рецептора ЛГ, сколько функционированием всей системы обратных связей, контролирующих экспрессию белков, вовлеченных в стероидогенез. В результате были выявлены следующие факты.

Несмотря на то, что в конце эксперимента уровни тестостерона в крови крыс при их обработке TP03 и ХГЧ были сопоставимыми, экспрессия гена, кодирующего рецептор ЛГ, в семенниках животных менялась разнонаправленно. В случае TP03 при всех способах введения она не снижалась, а при в/б введении даже повышалась, в то время как в случае п/к и в/б инъекций ХГЧ экспрессия гена Lhr отчетливо снижалась. Эти данные указывают на то, что одной из причин ослабления стероидогенного эффекта при длительном введении ХГЧ, независимо от способа доставки препарата, является снижение количества рецепторов ЛГ, и это можно рассматривать как результат запуска системы отрицательных обратных связей, индуцированных как высокими концентрациями гонадотропина, так и повышенным уровнем тестостерона [22]. TP03 не оказывает подобного эффекта, что во многом объясняет стабильность его стероидогенного эффекта во времени. Ранее нами было показано, что сохранение или даже усиление экспрессии ЛГ является характерной чертой для различных тиено[2,3-d]-пиримидиновых производных при их длительном в/б введении самцам крыс, и в норме, и при патологии [19, 23, 24].

Транспортный белок StAR катализирует скорость-лимитирующую стадию стероидогенеза – перенос холестерина в митохондрии, где осуществляются начальные стадии синтеза стероидных гормонов [25]. При этом TP03 при в/б введении и ХГЧ при обоих изученных способах введения в значительной степени стимулировали экспрессию гена этого белка (табл. 3), что характерно для активаторов стероидогенеза. В случае п/к и перорального введения TP03 стимулирующие эффекты этого агониста на экспрессию гена Star были выражены значительно слабее, и это было ассоциировано с менее выраженными стимулирующим эффектом TP03 на продукцию тестостерона (рис. 1, табл. 3).

Цитохромы Р450_scc и Р450-17α катализируют превращение холестерина в прегненолон (Р450_scc) и превращение прогестерона сначала в 17-оксипрогестерон, а затем в андростендион (Р450-17α) [26]. Экспрессия генов, кодирующих эти цитохромы, в значительной степени повышалась при пятитидневном п/к введении ХГЧ, в то время как в/б введение ХГЧ влияло на нее в существенно меньшей степени. Довольно неожиданным является различие в соотношении экспрессии гена Cyp17a цитохрома Р450-17α и гена Hsd17b дегидрогеназы 17β, катализирующей заключительную стадию стероидогенеза – превращение андростендиона в тестостерон, при различных способах введения ХГЧ. Так, при п/к введении экспрессия Cyp17a повышалась в шесть раз, а экспрессия Hsd17b, напротив, имела тенденцию к снижению (соотношение значений RQ для Cyp17a/Hsd17b составило 9.58), в то время как при в/б введении на фоне слабо выраженного повышения экспрессии Cyp17a отмечали значительное повышение экспрессии Hsd17b (соотношение Cyp17a/Hsd17b составило 0.39). Такое варьирование экспрессии, вероятно, обусловлено различиями в динамике синтеза и накопления различных прекурсоров тестостерона в ходе длительной стимуляции стероидогенеза.

В отличие от ХГЧ, TP03 при всех вариантах введения сравнительно слабо влиял на экспрессию генов стероидогенных ферментов, и лишь в сравнительно небольшой степени повышал экспрессию гена Cyp17a цитохрома Р450-17α в случае в/б введения и гена дегидрогеназы 17β в случае п/к введения. Эти данные указывают на то, что TP03, обеспечивая сравнимый с ХГЧ стероидогенный эффект, не вызывает гиперактивации экспрессии генов всех ключевых стероидогенных ферментов, которая сохраняется на уровне, близком к таковому в контроле. Это свидетельствует о том, что повышение продукции тестостерона, вызываемое низкомолекулярным агонистом, обеспечивается путем поддержания высокого уровня активности стероидогенных ферментов и не требует повышения их экспрессии.

Нами показано, что в случае ХГЧ п/к способ введения более предпочтителен в сравнении с в/б введением, на что указывает более выраженный стероидогенный эффект п/к введенного гонадотропина. Выявленные различия, как мы полагаем, обусловлены различной биодоступностью ХГЧ при п/к и в/б введении и различиями в паттерне генной экспрессии цитохрома Р450-17α и дегидрогеназы 17β, катализирующих заключительные стадии тестикулярного стероидогенеза. В случае гидрофобного по природе тиено[2,3-d]-пиримидинового производного TP03, действующего на аллостерический сайт рецептора ЛГ, в/б введение оказалось намного более эффективным, чем п/к и пероральное введение. Это указывает на то, что интерес, с точки зрения фармакологии, в случае TP03 могут представлять в/б введение, а также пероральное, как наиболее удобный и естественный способ доставки лекарственных препаратов. Показано также, что, в отличие от гонадотропина, обработка животных с помощью TP03 приводит к устойчивому во времени (при пятидневном введении) стероидогенному эффекту, умеренно влияя на экспрессию генов стероидогенеза и не снижая экспрессию рецептора ЛГ в семенниках, что может свидетельствовать в пользу сохранения чувствительности семенников к эндогенным гонадотропинам.