Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2022, T. 58, № 6, стр. 477-486

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования послужили представители пяти видов гладконосых летучих мышей (Chiroptera, Vespertilionidae): ночница Брандта (Myotis brandtii Eversmann, 1845) (n = 18), усатая ночница (Myotis Mystacinus Kuhl, 1817) (n = 5), водяная ночница (Myotis Daubentonii Kuhl, 1817) (n = 28), бурый ушан (Plecotus auritus, Linnaeus, 1758) (n = 9), северный кожанок (Eptesicus nilssonii, Keyserling, Blasius, 1839) (n = 43), обитающие в природных условиях в республике Карелия (61–63° с.ш., 30–36° в.д.). Сбор и отлов летучих мышей производили в разные сезоны года: осенью в период подготовки и начала гибернации (конец сентября–ноябрь), зимой в фазу глубокого сна (декабрь–февраль), весной (март, апрель) на позднем этапе спячки, и летом (конец июля–начало августа) в период наибольшей активности животных. Сбор летучих мышей в период гибернации осуществляли на зимовках в подземных укрытиях разного типа. Поиск животных проводили методом сплошного визуального осмотра зимовок, определяли пол и видовую принадлежность. Летний отлов животных проводили паутинными сетями. Встречаемость и относительное обилие [14] летучих мышей зимой определяли в подземных убежищах различного типа, а относительное обилие и относительную численность летом – на ночных автомобильных маршрутах с ультразвуковым детектором Song Meter SM 2 BAT+ (США) с последующей обработкой с использованием программного обеспечения Kaleidoscope Pro. Разрешения для отлова выданы Управлением охотничьего хозяйства Министерства сельского, рыбного и охотничьего хозяйства республики Карелия. Работа выполнена в соответствии с этическими стандартами, утвержденным правовыми актами РФ, принципами Базельской декларации и рекомендациями этического комитета Института биологии КарНЦ РАН (протокол № 2 от 10 февраля 2021 г.).

Содержание ретинола и α-токоферола определяли в печени и скелетной мышце, взятой из области бедра, методом ВЭЖХ [15]. Образцы тканей (100 мг) гомогенизировали в 0.9 мл 0.25 М раствора сахарозы (рН 7.4) в качестве суспензирующей среды. К гомогенату добавляли 0.025%-ный раствор бутилокситолуола в этиловом спирте и тщательно смешивали для осаждения белков. Приливали 0.0125%-ный раствор бутилокситолуола в н-гексане, смесь встряхивали в течение 5 мин, затем центрифугировали при 3000 × g в течение 10 мин и выдерживали в течение 40 мин при 4°C. Пробу для хроматографического анализа отбирали из верхнего гексанового слоя. Хроматографическое разделение проводили методом микроколоночной хроматографии, элюентом служила смесь гексана с изопропанолом в соотношении 98.5:1.5. Для проведения анализа использовали колонку с прямой фазой, наполнителем для которой служил силикагель. Детектирование проводили при 292 нм для α‑токоферола и 324 нм для ретинола. Нижний предел определения 0.01 мкг/г влажной ткани. При построении калибровочных кривых использовали стандартные растворы ретинола и α-токоферола (“Sigma-Aldrich”, США). Для контроля физиологического состояния в разные сезоны года определяли массу тела летучих мышей. Полученные данные обрабатывали с применением непараметрического критерия Вилкоксона–Манна–Уитни. Влияние на содержание витаминов таких факторов, как “сезон”, “пол” и “вид” оценивали с помощью многофакторного дисперсионного анализа (MANOVA). В связи с большой вариабельностью изучаемых показателей в табл. 1 и 2 кроме среднего приводятся минимальное и максимальное абсолютные значения.

Исследования выполнены с использованием научного оборудования Центра коллективного пользования Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Осенью в начальный период гибернации содержание ретинола в печени самок северного кожанка было достоверно ниже, чем у самок бурого ушана (p < 0.05), ночницы Брандта (p < 0.05) и водяной ночницы (p < 0.05) (табл. 1). В печени самцов северного кожанка обнаружен высокий уровень ретинола, причем у одной особи отмечено максимальное (264.3 мкг/г) по сравнению с другими видами значение. Зимой в печени самок всех видов, кроме водяной ночницы, уровень ретинола был выше, чем в осенний период. Содержание ретинола в печени самок северного кожанка зимой увеличилось более, чем в 20 раз (p < 0.05), в то время как у самцов снизилось в 7 раз по сравнению с осенними показателями. В скелетной мышце летучих мышей содержание ретинола было существенно ниже по сравнению с печенью. У некоторых особей в скелетной мышце ретинол не обнаружен. Весной содержание витамина А в печени самок северного кожанка было выше, чем осенью (p < 0.05), но снижалось по сравнению с зимним периодом. У самок ночницы Брандта уровень ретинола весной был выше, чем у самцов этого вида в 12.5 раза. На этом фоне особенно выделялась одна из самок ночницы Брандта, содержание витамина А в печени которой было чрезвычайно высоким и составляло 552.72 мкг/г. В летний период содержание витаминов А и Е смогли определить только у двух видов – ночницы Брандта и водяной ночницы. В результате обнаружено, что уровень ретинола в печени ночницы Брандта летом был ниже, чем зимой и весной во время спячки, но превышал содержание в печени водяной ночницы в 3 раза. Исследования уровня ретинола в мышцах двух видов ночниц в летний период показали более высокие значения, чем во время гибернации.

Наиболее значительные запасы α-токоферола осенью в начале гибернации обнаружены в печени северного кожанка (табл. 2). Анализ индивидуальных данных показывает, что не все особи накапливают к зиме значительные запасы витамина Е – минимальные значения выявлены как у самок, так и у самцов этого вида. В скелетной мышце наиболее высокое содержание α-токоферола выявлено у бурого ушана. В зимний период гибернации основной тенденцией было снижение α-токоферола по сравнению с осенними показателями, хотя у отдельных особей значения превышали предыдущие значения. Весной как в печени, так и в скелетной мышце выявлен довольно значительный уровень α-токоферола, при этом самки имели в печени бóльшие запасы витамина Е по сравнению с самцами. Влияние пола на содержание α-токоферола в печени установлено у ночницы Брандта (F = 4.76; df = 1; p = 0.048; η² = 16.91) и водяной ночницы (F = = 9.23; df = 1; p = 0.008; η² = 23.09). Содержание α‑токоферола в печени исследованных летом самок ночницы Брандта было значительно ниже (р = = 0.05), чем в зимний период. У самок водяной ночницы летом выявлены различия по сравнению с осенними значениями α-токоферола как в печени, так и в скелетной мышце (p < 0.05). Многофакторный анализ выявил влияние сезона года на уровень токоферола в печени (F = 4.88; df = 3; p = 0.017; η² = 51.98) и скелетной мышце (F = 7.06; df = 3; p = = 0.012; η² = 67.04) ночницы Брандта, а также в скелетной мышце водяной ночницы (F = 3.41; df = 3; p = 0.034; η² = 25.76).

Исследования динамики массы тела летучих мышей тела показали, что у всех видов максимальный вес наблюдался осенью в начальный период гибернации (рис. 1). Масса тела животных является видовым признаком, поэтому вес летучих мышей разных видов имел существенные различия. За время зимней спячки отмечалось достоверное снижение массы тела у самцов северного кожанка (p < 0.05). Кроме того, выявлено влияние пола на массу тела северного кожанка (F = 7.68; df = 1; p = = 0.009; η² = 15.37), самки которого были тяжелее самцов. Масса тела существенно зависела от сезона года у бурого ушана (F = 11.35; df = 2; p = 0.022; η² = = 47.87) и водяной ночницы (F = 7.74; df = 3; p = = 0.002; η² = 58.10).

Рис. 1.

Масса тела летучих мышей в разные сезоны года.

Обозначения: a – самцы; b – самки; по оси абсцисс – время года; 1 – ночница Брандта; 2 – усатая ночница; 3 – водяная ночница; 4 – бурый ушан; 5 – северный кожанок; c – различия достоверны по сравнению с осенью (начало гибернации) при p < 0.05; d – различия достоверны по сравнению с северным кожанком; e – различия достоверны по сравнению с ночницей Брандта.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Исследование летучих мышей, обитающих в природных условиях, выявило значительную вариабельность содержания ретинола и α-токоферола в печени и скелетной мышце, что обусловлено физиологическим состоянием животных, которое зависит от уровня питания, времени перехода в состояние гибернации, возраста животных, участия в спаривании, наличия эктопаразитов и др. О содержании ретинола и токоферола в тканях летучих мышей, обитающих в природных условиях, известно немного. При исследовании плодоядных и всеядных видов летучих мышей субэкваториальной зоны выявлена очень низкая концентрация ретинола в крови, причем у некоторых видов каротиноиды и ретинол не обнаружены. В то же время уровень α-токоферола в печени и почках этих видов был выше, чем у крыс и мышей, и показал обратную связь с уровнем ПОЛ. Дефицит витамина Е не был зафиксирован у насекомоядных видов летучих мышей, обитающих в дикой природе, в отличие от живущих в неволе [4, 12, 16].

Проведенные нами исследования показали, что уровни ретинола и токоферола в печени разных видов летучих мышей северной зоны имели различия, однако закономерностью является более высокий уровень витаминов А и Е во время зимней спячки по сравнению с периодом летней активности. Содержание ретинола и α-токоферола в печени гибернирующих летучих мышей сохранялось на высоком уровне или даже увеличивалось весной перед окончанием спячки. Вероятно, такое увеличение связано с интенсивной мобилизацией из жировых депо в этот период. Так, содержание ретинола и α-токоферола в печени самок и самцов ночницы Брандта весной было выше, чем осенью в начале гибернации, причем высокие значения отмечались и у особей других видов. Это свидетельствует о большой пластичности организма рукокрылых относительно потребностей в микронутриентах для успешной зимней спячки. У зимоспящих все процессы связаны с обменом липидов, от которого зависит содержание в тканях витаминов А и Е, липофильных по своей природе соединений. Обнаружено, что уровень вырабатываемого адипоцитами гормона адипонектина, секреция которого обратно пропорционально запасам липидов и стимулирует окисление жирных кислот, в начале периода накопления жира низкий и увеличен во время спячки [17]. Тринадцатиполосные суслики (Ictidomys tridecemlineatus) в период зимней спячки имели более высокий уровень витамина А в печени по сравнению с весной и летом. Полагают, что поддержание высокого уровня ретинола в печени может отражать повышенную потребность в витамине А во время гипотермии [8]. При исследовании европейских видов летучих мышей к концу зимней спячки отмечено увеличение содержания каротиноидов [11]. Печень у летучих мышей, как и у большинства млекопитающих, является основным местом хранения и метаболизма витамина А, где гидролиз ретиниловых эфиров приводит к образованию ретинола, который связывается затем с ретинолсвязывающим белком. Во время зимней спячки биосинтез белка, а также экспрессия генов, кодирующих транспортные белки ретинола, в печени значительно увеличены. Считается, что модуляция экспрессии генов во время зимней спячки представляет собой молекулярный механизм адаптации к экстремальным условиям [18]. Кроме того, у зимоспящих устойчивость к холоду печени обеспечивается за счет удержания гепатоцитами большого количества α-токоферола для предотвращения перекисного окисления липидов [19]. Установлено, что процесс впадения в спячку и выход из нее у зимоспящих млекопитающих рассматриваются как результат влияния витамина Е. У адаптированных к холоду животных депо витамина Е является жировая ткань и осеннее ожирение сочетается также с увеличением токоферола, являющегося ингибитором обменных процессов [10]. Очевидно, что продолжительная спячка рукокрылых требует наличия механизма резервирования и экономии всех веществ, необходимых для поддержания организма в хорошем физическом состоянии.

В организме наиболее высокий уровень витаминов А и Е обнаруживается в печени, откуда они переносятся в другие органы и ткани. Уровень ретинола и токоферола в скелетной мышце обычно значительно ниже, чем в печени, но данная ткань также является местом хранения необходимых организму микронутриентов. Кроме того, при адаптации к холоду печень и скелетная мышца участвуют в энергетическом метаболизме. Во время зимней спячки летучие мыши проходят повторяющиеся циклы оцепенения-возбуждения с чередованием состояний гипотермии и нормотермии. Генерация АФК, пониженная при гибернации, значительно усиливается при периодических пробуждениях, которые сопровождаются окислительным стрессом, ассоциированным с резким повышением потребления кислорода, необходимого для поддержания бурой жировой тканью и скелетными мышцами термогенеза. В скелетной мышце и в печени у гибернирующих арктических сусликов и черных медведей обнаружено снижение транскрипции генов, ответственных за ключевые окислительно-восстановительные процессы [18, 20], что является энергосберегающей адаптацией во время спячки. Целый ряд физиологических механизмов, имеющихся у зимоспящих млекопитающих, вносит вклад в окислительную способность скелетной мышцы, включая высокий уровень антиоксидантов. При дефиците витамина Е происходит активация ПОЛ и накопление продуктов этого процесса в скелетной мышце, поэтому токоферол играет важную роль в поддержании функционального состояния ткани во время гипобиоза [6, 21, 22]. Так, у самок северного кожанка уровень α-токоферола и ретинола в мышце зимой и весной был выше, чем осенью, а у самцов северного кожанка и ночницы Брандта содержание α-токоферола практически не отличалось от полученных осенью результатов. Весной у летучих мышей высокий уровень α-токоферола обнаружен как в печени, так и в скелетной мышце, в то время как летом содержание снижалось по сравнению с периодом гибернации. В скелетной мышце самок ночницы Брандта летом содержание α-токоферола было ниже, чем осенью и зимой в 12 и 4.6 раза соответственно. Схожая динамика наблюдалась у водяной ночницы, у которой содержание α-токоферола в мышце летом было меньше почти в 10 раз по сравнению с осенью. В то же время уровень ретинола в скелетной мышце летом увеличивался по сравнению с весенним периодом гибернации у самок ночницы Брандта и водяной ночницы. Содержание ретинола и α-токоферола в тканях летучих мышей весной было сопоставимо, а в ряде случаев даже превышало значения, обнаруженные осенью, что может свидетельствовать об изменении в конце зимней спячки ее стратегии, направленной на мобилизацию ресурсов. В конце спячки в скелетной мышце также усиливается синтез белка в отличие от процессов в печени, где существенных изменений не отмечено [23]. Считается, что печень может служить субстратом для восстановления мышц у зимоспящих [24]. Дисбаланс между образованием АФК и уровнями антиоксидантов может привести к окислительному стрессу, поэтому, вероятно, у зимоспящих антиоксидантная способность активируется не в начале, а в конце пробуждения от оцепенения [9]. У сусликов во время спячки антиоксидантная мощность икроножной мышцы была на 156% выше по сравнению с летними особями в период их наибольшей активности [25]. Можно предположить наличие у рукокрылых общих с другими зимоспящими млекопитающими механизмов регуляции процессов метаболизма в период гибернации.

Содержание в органах и тканях витаминов А и Е определяется поступлением с пищей, которое прекращается в холодное время года, когда происходит переключение с углеводного и белкового обменов на липидный. При температурной адаптации липиды играют важную роль в регуляции метаболизма, так как у находящихся в спячке животных обменные процессы в значительной степени зависят от температуры среды [10, 16, 26]. Спячка рукокрылых в Карелии в основном проходит при отрицательной температуре воздуха, которая в феврале в отдельных зимних укрытиях может кратковременно опускаться до –8.9°C. В то же время понижение температуры воздуха на 10° приводит к снижению обмена примерно в 2–2.5 раза [27]. Печень и скелетная мышца, на долю каждой из которых приходится примерно по трети всего запаса жира, потребляют для своего функционирования при гипотермии наибольшее количество свободных жирных кислот. Во время спячки в митохондриях печени и скелетных мышц подавляется дыхание и выработка АФК снижается [19, 28], в то время как в тканях сердца и мозга подавления метаболизма не происходит [21]. Снижение окислительных процессов уменьшает расход эндогенных запасов ретинола и токоферола у летучих мышей во время гибернации. Высокое содержание глутатиона и активность антиоксидантных ферментов в крови находящихся в состоянии гипотермии летучих мышей по сравнению с активными указывает на то, что повышение уровня антиоксидантов может модулироваться для минимизации окислительного стресса у рукокрылых [4]. Во время гибернации уровень α-токоферола в плазме крови сирийских хомяков увеличивался в 3.5 раза, так как существует баланс между высвобождением токоферола вместе с липопротеинами из печени в кровь и поглощением клетками и тканями посредством эндоцитоза. При пробуждениях во время спячки α-токоферол защищает полиненасыщенные жирные кислоты или липиды клеточных мембран против ПОЛ [9]. Обнаружено, что уровень антиоксидантов увеличивается во время гибернации и истощается при периодических пробуждениях, которые необходимы для мобилизации метаболитов и восстановления системного гомеостаза [29].

Во время спячки снижение массы тела у рукокрылых происходит за счет жира, и чем чаще летучая мышь за зиму просыпается, тем меньше становятся его запасы, поэтому сохранение энергетических резервов может дать репродуктивное преимущество [30]. Наши наблюдения показали, что среди животных с характерными признаками пробуждения (“в росе”) преобладали водяная и усатая ночницы. У северного кожанка общая продолжительность спячки и периодов оцепенения в лабораторных условиях больше, чем у других видов, а длительность активного состояния, требующего больших энергетических затрат, меньше [1]. У летучих мышей во время спячки вес самцов снижается интенсивнее, чем у самок, медленнее расходующих свои жировые запасы зимой [30–32].

Витамины А и Е необходимы для нормального функционирования репродуктивной системы самок и самцов, поэтому обеспеченность витаминами является существенным условием не только для перенесения летучими мышами зимней спячки, но и их благополучного размножения. Различия в содержании ретинола и токоферола у самок и самцов могут быть связаны с более медленным расходованием самками имеющихся резервов. Это связано с разными периодами репродуктивной активности, которая у самцов происходит летом или в начале осени. У самцов сперматогенный процесс проявляется только в благоприятное время года, когда животные активны и имеется достаточно корма. Самки, которые спариваются как весной, так и осенью перед спячкой, могут иметь очень длинный латентный период беременности [32]. Вероятно, это обусловливает более высокое содержание ретинола и токоферола в тканях самок по сравнению с самцами. Ранее подобная закономерность отмечалась у других видов европейских рукокрылых [11], в то же время при исследовании концентрации ретинола и токоферола в крови летучих мышей субэкваториальной зоны различий между полами не обнаружено [12]. Функция половых желез имеет наибольшее значение для формирования сезонных состояний организма, поэтому существует взаимосвязь между состоянием системы размножения летучих мышей и временем выхода из зимней спячки [33]. Наблюдения показывают, что северный кожанок после спячки вылетает из зимних убежищ раньше, чем другие виды. Хотя на зимовках в Карелии зарегистрировано пять видов рукокрылых, северный кожанок занимает доминирующее положение, что тесно связано с экофизиологической адаптацией данного вида к условиям севера.

В период активности летучие мыши обладают очень высоким уровнем потребления кислорода. Чем больше подвижность и выше уровень метаболизма, тем быстрее идут реакции окисления и накопления продуктов распада в тканях. В период летней активности, когда потребление энергии усиливается, уровень ретинола и токоферола у ночницы Брандта и водяной ночницы был ниже, чем в период гибернации. К завершению этой фазы скорость метаболизма снижается, что приводит к значительному увеличению отложения липидов и повышению уровня витаминов А и Е в тканях. Однако большую часть года на территории Карелии рукокрылые проводят в состоянии гипобиоза, что позволяет экономить энергию и ресурсы организма в холодное время года. Так, у северного кожанка потребление кислорода во время спячки снижается в 25 раз [33]. С понижением обмена ряд исследователей связывают более медленное старение и высокую продолжительность жизни летучих мышей по сравнению с другими видами животных подобного размера [2–4]. Считается, что одной из главных причин долголетия рукокрылых является высокая устойчивость к окислительному повреждению по сравнению с короткоживущими видами. Летучие мыши способны ослаблять окислительное повреждение, производя низкие уровни АФК, что определяет базальные эндогенные уровни антиоксидантов и продолжительность жизни. Кроме того, при адаптации к холоду выявляется динамическое равновесие между потреблением кислорода и образованием АФК [2, 4, 26, 34]. В то же время исключительно высокая продолжительность жизни отмечается только у самцов летучих мышей [3, 35]. Высокий уровень антиоксидантов у самок может зависеть от ряда причин, и одной из основных являются значительные затраты на репродукцию [32].

Сезонные изменения содержания витаминов А и Е в тканях летучих мышей являются отражением их видоспецифических черт. Виды, продвинувшиеся на север дальше других, являются и самыми устойчивыми к холоду. Существует положительная корреляция между температурной устойчивостью вида и температурой среды обитания [36, 37]. Такие арктические виды, как белый медведь и песец, не только накапливают к зиме большие запасы жира, но также обладают чрезвычайно высокой способностью к накоплению ретинола и токоферола [38, 39]. Способность к гибернации и накопление перед этим жировых запасов – одни из существенных отличий летучих мышей северных широт от видов тропического и экваториального поясов планеты, которых относят к “примитивным” формам с несовершенной терморегуляцией [40]. В подзонах средней и северной тайги Карелии, в отличие от более южных частей лесной зоны, как на зимовках, так и в период летней активности преобладает северный кожанок [41]. В нашем исследовании самки и самцы этого вида к концу зимней спячки имели нормальную массу тела, а также значительный уровень ретинола и α-токоферола в печени и скелетной мышце. В то же время у особей других видов, переживших продолжительный холодный период, выявлены запасы витаминов А и Е, и наиболее высокое их содержание весной обнаружено у ночницы Брандта.

Таким образом, содержание ретинола и α-токоферола в печени и скелетной мышце у пяти видов летучих мышей европейского Севера имеет определенные различия, однако общим для них является значительный уровень витаминов А и Е в тканях во время гибернации, который обеспечивает антиоксидантную защиту тканей для минимизации окислительного стресса, связанного с переходом летучих мышей в активное состояние. Во время летней активности уровень антиоксидантов ниже, чем во время зимней спячки. Содержание ретинола и α-токоферола в тканях летучих мышей в значительной степени является результатом экофизиологической адаптации определенного вида к обитанию в условиях севера. Способность рукокрылых накапливать резервы и поддерживать необходимый их уровень в период продолжительной гибернации можно рассматривать как наследственно закрепленную реакцию, сформированную в процессе эволюции для выживания в условиях низких температур и отсутствия пищи. Значительное снижение метаболизма в период гибернации позволяет сокращать затраты эндогенных ресурсов организма и является основным фактором выживания летучих мышей во время зимовки, положительный исход которой обеспечивается благодаря действию общих и специфических эколого-физиологических механизмов зимней спячки.