Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2022, T. 58, № 6, стр. 540-548

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводили на белых беспородных крысах-самцах Rattus norvegicus, массой 200–250 г (n = 42). Протокол исследования соответствует Директиве ЕС 2010/63/EU по проведению экспериментов на лабораторных животных и был одобрен Этическим комитетом Института эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова Российской академии наук (этическое разрешение № 13-к-а от 15 февраля 2018 г.).

Животные были разделены на 2 группы, одна из которых служила интактным контролем, тогда как крысам второй группы вводили подкожно (п/к) ДНФФ в дозе ЛД50. Животным контрольной группы вводили 1 мл 0.9%-ного раствора NaCl.

Пробы мочи и крови (пункция хвостовой вены) получали через сутки, 3 и 7 сут после воздействия. Исследования проводили на анализаторе мочи Combilyzer 13 (Human GmbH, Германия) и биохимическом анализаторе Sapphire (Hirose Electronic System Co., Япония) согласно инструкции производителя. Определяли суточный диурез, удельный вес мочи, уровень билирубина, общего белка, глюкозы, рН, креатинина, альбумина, D-3-гидроксибутирата и мочевой кислоты. В сыворотке крови определяли содержание амилазы, лактата, мочевой кислоты, общего билирубина, креатинина, триглицеридов, мочевины, общего белка, глюкозы, альбумина и D-3-гидроксибутирата.

Образцы почек для гистологического и ультрамикроскопического исследования брали у животных, погибших в течение 1-го часа, и после декапитации, через сутки, 3 и 7 сут после острого воздействия. Материал фиксировали в 10%-ном забуференном формалине и 2.5%-ном глутаровом альдегиде. Для гистологического исследования образцы почек обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, заливали в парафин. Полученные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Для ультрамикроскопического исследования материал дополнительно фиксировали 2%-ным раствором OsO₄, последовательно обезвоживали в спиртах и ацетоне восходящей концентрации, заливали в смолу Araldite (EMS, США). Двойное контрастирование ультратонких срезов осуществляли раствором цитрата свинца и 1%-ным водным раствором уранилацетата. Исследование проводили на световом микроскопе Axio Imager A2 (Carl Zeiss, Германия) и электронном микроскопе Merlin (Carl Zeiss, Германия).

Морфометрию проводили в базовой программе для получения, обработки и анализа изображений AxioVision, версия 4.8.2 (Carl Zeiss, Германия). На полученных препаратах измеряли толщину гломерулярных базальных мембран.

Полученные данные анализировали в программах Microsoft Office Excel 2007 и SPSS Statistics 17.0. Статистическую значимость различий между группами определяли с использованием непараметрического Н-критерия Краскела–Уоллиса. Данные представлены в виде медиан.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Отличий в уровнях билирубина, общего белка и альбумина в моче между контрольной и экспериментальной группами не выявлено. Содержание амилазы, лактата, мочевой кислоты, общего билирубина, креатинина, триглицеридов, мочевины, общего белка, глюкозы и D-3-гидроксибутирата в сыворотке крови также не имело различий между группами. Отмечено снижение уровня альбумина в сыворотке крови через сутки после отравления (р = 0.018), однако уже через 3 сут его уровень восстанавливался до контрольных значений (рис. 1).

Рис. 1.

Уровень содержания альбумина в сыворотке крови животных контрольной (1) и экспериментальной группы через сутки (2), 3 сут (3) и 7 сут (4) после воздействия ДНФФ. На рисунке представлены значения Me (Q1, Q3) для каждой группы. *p ≤ 0.05.

Значимых отличий в клиренсе креатинина на разных сроках после отравления не выявлено, отмечена лишь тенденция (0.05 < р < 0.1) к снижению клиренса через сутки и к увеличению до контрольных значений через 3 сут после воздействия ДНФФ.

В экспериментальной группе животных выявлено снижение суточного диуреза в первые сутки интоксикации (р = 0.05) (рис. 2a), при этом относительная плотность мочи увеличивается (р = 0.001), а показатели изменяются в кислую сторону через сутки и в щелочную через 3 сут (р = 0.001) (рис. 2b,c). Уровень мочевой кислоты в моче увеличивается через сутки и 3 сут по сравнению со значениями контрольной группы (р = 0.013) (рис. 2d), а уровень D-3-гидроксибутирата увеличен через сутки (р = 0.004) (рис. 2e); также был отмечен рост уровня глюкозы в моче животных через сутки после острого воздействия (р = 0.007) (рис. 2f).

Рис. 2.

Биохимические показатели мочи в контрольной группе и через сутки (1d), 3-е сут (3d) и 7 сут (7d) после острого воздействия ДНФФ. (a) Cуточный диурез. (b) Относительная плотность мочи. (c) рН. (d) Уровень мочевой кислоты. (e) Уровень D-3-гидроксибутирата. (f) Уровень содержания глюкозы. На рисунке представлены значения Me (Q1, Q3) для каждой группы. *p ≤ 0.05.

В тканях почек животных, погибших в течение 1-го часа после введения ДНФФ, выявлены изменения микроциркуляции, выражающиеся в появлении стазов в капиллярах интерстиция, клубочковых капиллярах и кровоизлияниях в капсулы клубочков (рис. 3b). Кровоизлияния в капсулу свидетельствуют о нарушении целостности фильтрационного барьера почек, что предположительно связано с разрывами гломерулярных базальных мембран. В структуре почечного тельца животных через сутки после отравления выявлены растяжение капсулы Шумлянского–Боумена и увеличение площади мочевого пространства при острой токсической нагрузке (рис. 3c). На ультраструктурном уровне выявлены очаговые нарушения люминальных поверхностей мембран эпителиальных клеток проксимальных извитых канальцев и обтурация просветов канальца десквамированными эпителиальными клетками. Через 7 сут после острого воздействия ДНФФ состояние паренхимы почек крыс соответствовало контролю (рис. 3d).

Рис. 3.

Морфологические изменения в почках крыс контрольной группы (a), погибших в течение часа (b), через сутки (c) и 7 сут (d) после введения ДНФФ в дозе ЛД50. Кровоизлияния в интерстиций показаны звездами, кровоизлияния в капсулу клубочка (белая стрелка), растяжение капсулы Шумлянского-Боумена (черная стрелка). Окрашивание гематоксилином и эозином, масштабный отрезок = 50 мкм.

При ультраструктурном исследовании почек животных через 7 сут после отравления отмечали потерю четкого деления гломерулярных базальных мембран обработанных на lamina rara externa, lamina densa и lamina rara interna. Было выявлено статистически значимое увеличение толщины гломерулярных базальных мембран (р =  0.05) (рис. 3, 4).

Рис. 4.

Гломерулярные базальные мембраны фильтрационного барьера почек в контрольной группе (a), через сутки (b) и 7 сут (c) после введения ДНФФ в дозе ЛД50. 1 – тело подоцита, 2 – ножковые отростки подоцитов, 3 – гломерулярная базальная мембрана, 4 – просвет клубочкового капилляра. Трансмиссионная электронная микроскопия, масштабный отрезок = 200 nm.

Рис. 5.

Толщина гломерулярных базальных мембран фильтрационного барьера почек крыс через сутки (1d) и 7 сут (7d) после введения ДНФФ в дозе ЛД50. На рисунке представлены значения Me (Q1, Q3) для каждой группы. *p ≤ 0.05.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Эпителиальные клетки, выстилающие проксимальные канальцы, играют важную роль в извлечении ионов и белков, проходящих сквозь гломерулярный фильтрационный барьер [21]. Протеинурии, как одного из основных критериев, свидетельствующих о нарушении функции почек, у животных, переживших острую интоксикацию ДНФФ, выявлено не было. Следовательно, нарушение целостности апикальной поверхности эпителиальных клеток, выявленное на ранних сроках, не оказывает влияние на апикальный эндоцитоз белков. Вероятно, мультилигандные рецепторы мегалин и кубилин, обеспечивающие реабсорбцию белков и располагающиеся между микроворсинками эпителиальных клеток проксимального извитого канальца, экспрессированы в достаточном количестве клеток для обеспечения нормального уровня реабсорбции [21, 22]. Это соответствует результатам других исследований, где, в случае применения низких доз ФОС, в первые сутки после отравления гистопатологических изменений в тканях почек животных не наблюдалось, хотя через 3 нед хронического воздействия они оказывались ярко выраженными и включали кровотечение, десквамацию эпителия канальцев, инфильтрацию воспалительными клетками и некроз [23]. Нормальный уровень реабсорбции белка в проксимальных канальцах косвенно указывает на целостность гломерулярных мембран фильтрационного барьера почек в ранние сроки у выживших животных после отравления сублетальными дозами ДНФФ и сохранность достаточного количества канальцев для его поддержания.

Выявленное снижение уровня альбумина в сыворотке крови через сутки после острого воздействия без увеличения его экскреции с мочой может свидетельствовать о нарушении гемато-тканевых барьеров и вероятном выходе альбумина в паренхиму головного и спинного мозга [24–26]. Следов выведения необратимо связанных комплексов альбумин-ФОС в фильтрационном барьере почек или моче в нашем исследовании обнаружено не было ни через сутки, ни через 7 суток после воздействия ДНФФ. Электронно-плотные комплексы в структуре гломерулярных мембран также не обнаружены. Однако наличие следов белка в толще гломерулярных мембран в исследованиях токсического действия ФОС на ткань почек показано для квиналфоса [27].

Согласно литературным данным, ключевыми факторами, способствующими повреждению проксимальных канальцев, являются гипергликемия, протеинурия, гипоксия и воспаление [28]. Нарушения микроциркуляции, выявленные в тканях почек крыс, погибших в течение часа после воздействия ДНФФ, указывают на формирование для клеток почек выживших животных гипоксических условий. Согласно современным представлениям вышеуказанные факторы оказывают свое воздействие через изменения сигналинга TGF-beta и баланса медиаторов ренин-ангиотензиновой системы, дисрегуляцию полиолового и гексозаминового пути, активности протеинкиназы С, а также через образование конечных продуктов гликирования [28].

Согласно клиническим наблюдениям у пострадавших от воздействия ФОС наблюдается транзиторная глюкозурия при эугликемии [29]. В нашем исследовании у животных, переживших острую интоксикацию, наблюдалась аналогичная ситуация, высокий уровень содержания глюкозы в моче сочетался с отсутствием изменений уровня глюкозы в крови через сутки и 3 сут после воздействия. Как известно, апикальные мембраны эпителиальных клеток извитых канальцев несут на себе рецепторы к инсулину и транспортеры глюкозы [30, 31]. Потеря микроворсинок апикальной части клеток проксимальных канальцев приводит к утрате Na-зависимых SGLT-переносчиков глюкозы, что нарушает активный транспорт глюкозы в клетку из просвета канальца [32]. Снижение количества рецепторов инсулина в проксимальных канальцах, которое имеет место при инсулинорезистентном состоянии, также способствует развитию гипергликемии за счет усиления глюконеогенеза [31]. Изменения клеточных функций, происходящие в ответ на воздействие различных эндогенных факторов, в том числе и отравления ФОС, вызывающие потерю инсулиновых рецепторов и SGLT-переносчиков глюкозы в поврежденных проксимальных канальцах, могут способствовать развитию диабетоподобной нефропатии [30]. Это подтверждается полученными данными, свидетельствующими о возникновении метаболического кетоацидоза через сутки после отравления: смещение рН мочи в кислую сторону, рост уровня мочевой кислоты и D-3-гидроксибутирата. D-3-гидроксибутират является наиболее распространенным кетоном, обеспечивающим индикацию кетоацидоза. Имеются данные о случаях интоксикации человека ФОС, проявляющихся как диабетический кетоацидоз [33–35]. В моделях на животных эти соединения влияют на пути метаболизма глюкозы, что в конечном итоге приводит к гипергликемии [34].

Рост уровня экскреции мочевой кислоты в моче обработанных животных в нашем исследовании согласуется с данными о последствиях повышенной активности ксантиноксидазы и повышенного уровня оксидативного стресса при отравлении [14, 36]. Мочевая кислота – конечный продукт метаболизма эндогенных и поступающих с пищей пуриновых соединений у человека, образующийся из ксантина под действием ксантиноксидазы. Выведение мочевой кислоты в просвет канальца происходит при помощи мочекислого или уратного переносчика 1 (URAT1), также экспрессированного на люминальной клеточной мембране и в цитоплазме клеток проксимальных канальцев [37]. Частичная утрата эпителия проксимальных канальцев способна вызвать рост экскреции мочевой кислоты с мочой.

Патогистологические изменения в тканях почек при воздействии ДНФФ в дозе ЛД50 наиболее ярко проявляются через сутки, восстановление происходит в течение недели. Увеличение толщины гломерулярных базальных мембран, выявленное через 7 сут у обработанных животных не сочеталось с протеинурией и гематурией. Различий между контрольной и экспериментальной группами крыс по уровню сывороточной амилазы, которая, согласно данным некоторых исследований, имеет наибольшую диагностическую точность при оценке тяжести воздействия ФОС у человека [16], в нашем эксперименте не обнаружено.

В целом исследование показало, что однократное введение сублетальной дозы ДНФФ оказывает токсическое воздействие на крыс, отражающееся в ряде изменений биохимических показателей крови, мочи и морфологических показателей тканей почек. Согласно полученным данным, максимальные изменения биохимических показателей крови и мочи регистрируются через сутки после острого воздействия, выражаются в развитии метаболического кетоацидоза и снижении выделительной способности почек, что свидетельствует о формировании у крыс преморбидного состояния с последующей неполной его нормализацией. Результаты исследования позволяют предположить риск развития диабетической нефропатии в результате острой интоксикации ФОС.