Журнал физической химии, 2020, T. 94, № 11, стр. 1731-1734

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Использовали пиридоксаль-5'-фосфат фирмы Aldich с содержанием основного вещества 0.98; глицин, диглицин и триглицин фирмы Merck имели чистоту ≥0.99. Перед использованием реактивы высушивали в вакууме при 50°С до постоянной массы. Реакцию проводили в водном фосфатно-буферном растворе (0.04165 М NaH₂PO₄/0.20492 М Na₂HPO₄) при рН 7.35 и температуре 293 ± 0.3 K. Точное значение pH 7.35 фосфатного буферного раствора обеспечивали варьированием компонентов буферной смеси с использованием pH-метра. Использование буферного раствора обеспечивало стабильность ионных форм реагентов в растворе в ходе реакции. Концентрации пептидов варьировали от 0.2 до 1.8 мM, концентрация пиридоксаль-5'-фосфата составляла 0.04 мM.

Ход реакции между пептидом и PP наблюдали с использованием спектрофотометра Agilent 8455 по изменениям в разностном электронном спектре поглощения PP при различных добавках пептида, регистрируемом относительно раствора свободного PP той же концентрации в интервале длин волн от 250 до 600 нм. Для измерений использовали кварцевые кюветы размером 1 × 1 см. Регистрация изменений в разностном спектре со временем показала, что реакция кофермента с аминокислотами и пептидами в условиях эксперимента заканчивалась через 600 с. Поэтому для определения равновесных концентраций реагентов период ожидания перед измерением оптической плотности составлял не менее 20 мин после смешения растворов PP и AA.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Сопоставление электронных спектров PP с добавками мономерного глицина или его пептидов (рис. 1) указывает на однотипный характер наблюдаемых превращений. Общая тенденция изменения спектров при добавках аминокислоты и пептидов – убывание интенсивности поглощения при 375 нм и появление полос, характерных для поглощения основания Шиффа при 275–280 и 430–440 нм. Появление новых полос вызвано изменением состояния ароматического пиридинового кольца при образовании оснований Шиффа. Ароматическая электронная система входит в сопряжение с двойной связью между атомами углерода и азота, что приводит к заметному смещению исходной полосы поглощения PP от 388 до 444 нм. Кинетические исследования деградации продуктов конденсации PP с триглицином показали высокую стабильность спектральных полос при 430 и 450 нм в нейтральной среде [4]. Интенсивность данной полосы зависит от мольного соотношения реагентов. Поэтому измерение ее интенсивности было использовано для нахождения концентрации продукта взаимодействия пиридоксаль-5'-фосфата с аминокислотой и пептидами (ShB) и равновесной константы этого взаимодействия.

Методика определения равновесной концентрации образующихся оснований Шиффа из спектральных данных подробно описана нами ранее [3]. Молярный коэффициент поглощения в максимуме полосы основания Шиффа находили из линейного соотношения изменений оптических плотностей и молярных коэффициентов экстинкции для двух полос разностного спектра: поглощения PP при 375 нм (ΔD³⁷⁵, ε³⁷⁵ = 6250 см^–1 л моль^–1) и поглощения основания Шиффа при 430–444 нм (ΔD^ShB, ε^ShB).

Величины ε^ShB определеляли с погрешностью δε^ShB = 125 см^–1 л моль^–1 и использовали для спектрофотометрического определения равновесных концентраций оснований Шиффа [ShB] по уравнению Бугера–Ламберта–Бера: Равновесные концентрации кофермента [PP] и пептида [AA] рассчитывали по соотношениям где $c_{{{\text{Py}}}}^{^\circ }$ и $c_{{{\text{AA}}}}^{^\circ }$ – начальные молярные концентрации исходных веществ.

Эффективные константы образования оснований Шиффа определяли по соотношению

где [ShB], [PP] и [AA] – равновесные концентрации основания Шиффа, пиридоксаль-5'-фосфата и пептида или аминокислоты соответственно. В выражении для константы образования использованы суммарные равновесные концентрации для всех форм и ионных состояний реагентов и продукта реакции. Рассчитанные эффективные константы образования и спектральные характеристики оснований Шиффа приведены в табл. 1. Рассчитанные константы образования были усреднены для изученного концентрационного интервала аминокислот от 0.2 до 1.8 мM, стандартное отклонение при этом составило δ(lg K ') = = 0.05. Ранее полученные значения констант образования с участием глицина качественно согласуются с нашими результатами с учетом отличий в условиях и методах оценки констант. Для реакции в среде фосфатного буфера с pH 7.5 при значительном избытке аминокислоты (C_AA/C_PP = = 2000), в работе [5] получена величина lg K  ' = = lg(K/[${{C}_{{{{{\text{H}}}_{2}}{\text{O}}}}}$]) = 1.99 ± 0.26, в пределах ошибки совпадающая с полученной нами. Для реакции в водном растворе (NaOH + KCl) при ионной силе 0.5 М и pH 7.5 измерена близкая величина lg K  ' = = 2.15 [6]. Использование концентраций отдельных ионных форм PP, в отличие от его общей концентрации, приводит к сильно отличающимся оценкам констант, как это сделано в работе [7]: lg K = 2.93 или 1.12.

Анализ полученных спектральных характеристик свидетельствует, что изменения в электронной структуре ароматического пиридинового кольца РР зависят от структуры и свойств присоединяемого пептида. Значительный спад в молярных коэффициентах поглощения оснований Шиффа, образованных Gly; Gly-Gly или Gly-Gly-Gly, свидетельствует об уменьшении степени сопряжения алдиминной группы CH=N с ароматическим оксипиридиновым хромофором в структуре молекулы при удлинении цепи пептидного фрагмента. Это может быть связано с нарушением их компланарности вследствие увеличения степени свободы пептидного фрагмента и, по-видимому, ослаблением индуктивного эффекта карбоксильной группы, расположенной на конце пептидной цепи.

Увеличение расстояния между карбоксильной группой и аминогруппой в ряду Gly – Gly-Gly – Gly-Gly-Gly приводит к понижению основности реакционного NH₃⁺ центра пептида. Известно, что константы кислотной диссоциации протонированной аминогруппы возрастают в ряду от глицина (pK° = –lg K° = 9.78) к триглицину (pK° = 8.04) [8]. Расчеты долевого распределения ионных форм пептидов при pH 7.35 с использованием полученных констант диссоциации показывают значительное увеличение в растворе доли пептидов с неионизированными аминогруппами в указанном ряду: 0.4% для Gly; 31.0% для Gly-Gly-Gly. Повышение доли пептида с молекулярной формой аминогруппы и ослабление специфической гидратации данной группы из-за снижения ее основности приводят к возрастанию степени превращения и константы связывания пептида в реакции конденсации с коферментом PP. Логарифм константы связывания возрастает от 1.78 до 2.41 при переходе от мономерного глицина к его трипептиду. Наличие закономерной корреляции между константами связывания пептидов с PP и константами диссоциации протонированных аминогрупп пептидов (рис. 2) подтверждает указанные положения.

Таким образом, полученные данные показывают, что в условиях физиологического показателя pH 7.35 концевые аминогруппы в составе пептидов, расположенные вдали от заряженной карбоксильной группы, более реакционно-способны в ферментативных пиридоксаль-зависимых реакциях по сравнению с α-аминогруппами мономерных аминокислот. Химическая активность молекул аминов, не содержащих в своем составе других полярных групп, и аминов, содержащих полярные незаряженные группы, близка к активности пептидов в реакциях с PP. Так, константы образования оснований Шиффа, образующихся с н-амиламином, lg K ' = lg(K/[${{C}_{{{{{\text{H}}}_{2}}{\text{O}}}}}$]) = = 2.24 ± 0.55 [5], и трис-(гидроксиметил)-аминометаном, lg K ' = lg(K/[${{C}_{{{{{\text{H}}}_{2}}{\text{O}}}}}$]) = 2.08 ± 0.26 [5], лежат в области значений, характерных для пептидов, в которых реакционная аминогруппа удалена от ионизированной карбоксильной группы.