Журнал физической химии, 2020, T. 94, № 2, стр. 306-312

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Использовали препараты A, Ado и ADP фирмы “Serva”. В качестве неорганического фосфата (P_i) использовали соль NaH₂PO₄ · 2H₂O класса “extra pure”, остальные реактивы – класса “х.ч.”. Для приготовления растворов применяли воду, очищенную на установке Millipore. Эксперименты выполняли в слабокислой среде (pH 6.6), доведение pH растворов до этой величины производили добавлением HCl и NaOH. В исследованных растворах [AX] = 2 × 10^–4 M, [NaCl] = 0.1 М.

Обpазцы замоpаживали в тефлоновыx контейнерах быстрым погpужением в жидкий азот (77 К) и оcвобождали непоcpедcтвенно пеpед оcвещением. Облучение пpоизводили pтутной лампой cвеpxвыcокого давления ДPШ-1000 cо cветофильтpом УФC-5 (стандартное значение 40%-го пpопуcкания в диапазоне 260–400 нм). Интенcивноcть оcвещения I_hν ограничивали до ~0.6 от максимальной интенсивности источника облучения пpи помощи pешеток, калибpованныx на cпектpофотометpе, аналогично [3–5]. Это было связано с тем, что эффективность фотопродукции H₂O₂ (α), определяемая как отношение количества образующегося пероксида [H₂O₂] к интегральной интенсивности сигнала ЭПР, регистрируемого в области g ≈ 2.00 (Int_S), существенно снижается при увеличении I_hν [3, 4].

Образцы облучали при 77 К в кварцевом дьюаре. Спектры ЭПР регистрировали при 77 К на изготовленном в лаборатории ЭПР-спектрометре (частота 9.5 ГГц). Мощность СВЧ-излучения составляла W ≈ 200 мкВт и W ≈ 2 мВт, амплитуда модуляции – 2 Гс. Высокую мощность СВЧ-излучения считали необходимой для более точной оценки содержания медленно насыщающихся свободных радикалов ${\text{O}}_{2}^{{ - \bullet }}$ и ${\text{NO}}_{2}^{ \bullet }$ (пpиcутcтвие последних в cпектpаx обуcловлено, по-видимому, вероятными пpимеcями нитpатов в компонентаx pаcтвоpов).

Методика оценки вклада различных компонент в сигналы S, выполнявшейся на основании построения модельного сигнала, идентична описанной в [7] и применявшейся во всех цитированных выше работах. Основными составляющими (“базисными сигналами”), вносящими вклад в регистрируемые спектры облученных растворов AX, являются сигналы пероксильных радикалов – ${\text{O}}_{2}^{{ - \bullet }}$ и ${\text{HO}}_{2}^{ \bullet }$, электрондефицитных радикалов аденина A^•; радикалов рибозы Ri^• в Ado и ADP, (локализованных преимущественно на C5'); C8OH-аддуктов аденина – AOH^•; сигналы ${\text{Cl}}_{2}^{{ - \bullet }}$; стабилизированных в матрице электронов e^– и радикалов ${\text{NO}}_{2}^{ \bullet }$.

В случаях присутствия в растворах добавок P_i попытка внесения в базисную систему сигналов фосфатных радикалов и радикалов OH^•, вносящих существенный вклад в анализируемые спектры при более высоких концентрациях реагентов [8], при используемых концентрациях оказалась безуспешной.

После записи спектров ЭПР облученные образцы хранили в течение суток в жидком азоте (77 K) вплоть до определения H₂O₂. Определение Н₂О₂ проводили спектрально-иодометрическим методом [9], аналогично выполнявшемуся в работах [1–5]. Точность определения концентрации пероксида водорода <1 мкМ. Параллельно с облученными образцами в каждом из опытов выполняли определение H₂O₂ в контрольных, не облучавшихся образцах, хранившихся то же время при 77 К. Пероксид водорода в этих образцах отсутствовал ([H₂O₂] < 1 мкМ).

Среднеквадратичная ошибка определения H₂O₂ в облученных образцах составляет ~24%; среднеквадратичная ошибка определения Int_S составляет ~33%. Количество параллельных образцов в различных опытах варьировало от 2 до 7.

Ранее выполненные оптические измерения зависимости оптической плотности (D) растворов AX от [P_i] были произведены на автоматизированном спектрофотометре Specord UV VIS (ГДР), позволявшем хранить оцифрованные результаты измерений.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты определения количества пероксида водорода в размороженных образцах AX, облученных при 77 К с светофильтром УФС-5, приведены в табл. 1. Там же представлены результаты определения интегральных интенсивностей сигналов ЭПР в этих образцах перед размораживанием (Int_S) и оценки вклада основных компонент в регистрируемые суммарные спектры.

Данные, полученные на образцах, не содержащих P_i, идентичны приведенным в [5], поскольку эксперименты по влиянию P_i и ионов Zn²⁺ на фотопродукцию H₂O₂ производными аденина выполняли одновременно. Добавление P_i к исследуемым растворам AX + NaCl приводит к значительному увеличению выхода H₂O₂ в облученных образцах (до ~ 10-кратного для A, табл. 1).

В анализируемых спектрах ЭПР растворов, содержащих добавки P_i, присутствия фосфатных радикалов, радикалов OH^•, и атомов H^•, наблюдавшихся при более высоких концентрациях реагентов в [8], при используемых концентрациях не обнаруживается. Примеры спектров ЭПР, регистрируемых в исследуемых облученных образцах при 77 К, и результаты их моделирования показаны на рис. 1.

Рис. 1.

Примеры спектров ЭПР, регистрируемых в облученных растворах AX (2 × 10^–4 M); I_hν = 0.6, t_hν = 16 мин, W ≈ 200 мкВт. Экспериментальные спектры ЭПР – серые линии, модельные – обычно накладывающиеся тонкие черные линии. Под спектрами приведены результаты оценок вклада основных компонент сигналов (условные единицы); * – сигнал дьюара, 1–3: AX + 0.1 М NaCl; 4–6: AX + 0.1 М NaCl + 5 × 10^–4 M P_i; T = 77 K. В рамках указан выход пероксида водорода в соответствующих системах, в мкМ.

Значительное увеличение выхода H₂O₂ при добавлении в облучаемые растворы невысокого количества P_i вызывает вопрос о степени комплексообразования AX с P_i. Нам неизвестны литературные данные о величинах констант ассоциации AX с P_i (K_a). Приведенная нами для комплексования A и P_i оценка K_a ~ 400 М^–1, полученная в [10], была, по-видимому, недостаточно корректной.

Результаты оптических измерений. Более подробный анализ результатов влияния P_i на изменение D растворов AX по этим измерениям (0.05 М цитратный буфер, pH 5.6, 293 К) показывает существенное различие между поведением оптических спектров A и ADP (рис. 2). Добавление небольших количеств P_i (~10^–4 M) к растворам A и ADP приводит к появлению минимума в разностных спектрах (ΔD =D_{(AX + Pi)} – D_AX0) при длинах волн λ ~ 273 нм, более выраженному в случае A. Увеличение ΔD в области λ ≈ 240–264 нм в случае A больше, чем в ADP (рис. 2).

Рис. 2.

Влияние P_i на спектры оптического поглощения A (а) и ADP (б); в и г – разностные спектры (ΔD) растворов AX + NaCl + P_i и AX + NaCl; приведены значения [P_i], М. Вставка – зависимости констант корреляции (K_cor) экспериментальных результатов с получаемым линейным приближением в системе двойных обратных координат от λ; 0.05 М цитратный буфер, pH 5.6, 293 К.

При линеаризации результатов измерений оптической плотности ADP + P_i в системе двойных обратных координат (1/[P_i]; 1/ΔD) по методике [11] (в предположении образования комплексов 1:1) зависимости от λ констант корреляции (K_cor) экспериментальных результатов с получаемым линейным приближением существенно различаются в случаях A и ADP (рис. 2, вставка). Результаты расчета возможных величин K_a при λ, соответствующих оптимальным соотношениям величин β = K_cor/σ (%), приведены в табл. 2.

Относительная среднеквадратичная ошибка определения K_a при различных длинах волн λ составляет в случае ADP ~11% и ~60% для A. Таким образом, определение констант ассоциации аденина с P_i (K_a) по оптическим измерениям представляется невозможным. Мы считаем, что причина этого может состоять в изменении соотношения таутомерных форм A в присутствии P_i. Известно, что помимо основной формы A (N9H), некоторый вклад в спектры оптического поглощения вносят его таутомеры N7H и N3H [12]. (Хотя возможность присутствия в водных растворах формы N3H не очевидна [13]). Отсутствие в спектрах оптического поглощения растворов Ado “плеча” в области λ ~ 270 нм, наблюдаемого в растворах A [14], свидетельствует, по-видимому, о том, что вклад таутомеров A в соответствующие спектры в данной области λ существенен. Соответственно, увеличение минимума ΔD в разностных спектрах в этой области и одновременное увеличение ΔD при меньших значениях λ (рис. 2) может свидетельствовать об изменении таутомерного равновесия A в присутствии добавок P_i. К сожалению, как результаты расчетных работ, так и данные экспериментальных работ, выполненных различными методами, не позволяют конкретизировать указанное предположение.

Для А максимальное полученное нами значение константы ассоциации (при λ = 238.5 нм) составляет $K_{{\text{a}}}^{{{\text{A - P}}}}$ = 935 M^–1. Количество связанного P_i при [P_i] = 1.3 × 10^–4 M мало ([A-P_i] ~5 × 10^–6 M), расстояние между свободными молекулами P_i составляет ~240 Å и среднее расстояние между свободными молекулами P_i и A может составлять ~120 Å. В случае ADP определение константы ассоциации для комплексования ADP с P_i приводит к очень высоким значениям $K_{{\text{a}}}^{{{\text{ADP - P}}}}$ ~ 12300 M^–1. Следовательно, при [P_i] = 1.0 × 10^–4 M (рис. 2) ~35% молекул ADP находятся в связанном с P_i состоянии и не связанными с ADP оказываются ~6.5 × 10^–5 M P_i. Расстояние между свободными молекулами P_i составляет в этом случае ~295 Å, между P_i и ADP ~150 Å. Возможные механизмы влияния низких концентраций растворенных молекул (обусловленного их воздействием на структуру водного окружения) рассмотрены в [15, 16].

Выход H₂O₂ и результаты измерений ЭПР. Возвращаясь к результатам влияния P_i на выход пероксида водорода в AX, следует отметить, что при используемых концентрациях AX и [P_i] = 5 × 10^–4 M ~80% молекул ADP и ~30% молекул А может находиться в комплексах [AX-P_i] (в случае справедливости полученных оценок K_a). Однако, если в облученных растворах A + NaCl добавление P_i приводит к почти десятикратному увеличению выхода H₂O₂ по сравнению с растворами, не содержащими P_i, то в аналогичных растворах ADP и Ado это увеличение составляет всего 3.8 и 3.1 раза, соответственно (табл. 1). Таким образом, у нас есть существенные основания для предположения ключевой роли изменения соотношения таутомерных форм A в рассматриваемых экспериментах.

Как и при включении в растворы ZnCl₂, увеличивающем, по-видимому, самоассоциативные свойства AX ([5] и ссылки в этой работе), возрастанию выхода H₂O₂ в случаях A и ADP сопутствует падение Int_S. Напротив, в случае снижения образования H₂O₂ в растворах Ado при добавлении ZnCl₂ (предположительно, обусловленного изменением конформации рибозной группы Ado), наблюдалось некоторое возрастание Int_S [5].

В облученных при 77 К растворах AX + NaCl + P_i как увеличение выхода H₂O₂ при [P_i] = 5 × 10^–4 M по сравнению с растворами, не содержавшими P_i, так и падение Int_S, наблюдаются для всех исследовавшихся AX, включая Ado (табл. 1, рис. 1). Нам представляется, что приведенные в данной работе результаты подтверждают предположение о существенности для AX пути фотоиндуцируемого образования H₂O₂, происходящего в агрегатах этих соединений, и не приводящему к сколько-нибудь заметному выходу в среду интермедиатных свободных радикалов [3–5]. В [5] предположено, что возможными путями образования H₂O₂ в этом случае могут быть реакции:

Помимо предполагаемого в определенных условиях взаимодействия фотоиндуцируемых в наших системах радикалов OH^• с молекулами H₂O [7], фотопродукция радикалов ${\text{HO}}_{2}^{ \bullet }$ в присутствии Ado и ADP, по-видимому, может осуществляться при взаимодействии радикалов R^• с O₂ [18]. В отсутствие добавок относительное содержание радикалов ${\text{HO}}_{2}^{ \bullet }$, действительно, несколько выше в растворах Ado и ADP, чем в растворах A (табл. 1). Небольшое количество H^• (${\text{In}}{{{\text{t}}}_{{{{{\text{H}}}^{ \bullet }}}}}$ ≤ ≤  0.02Int_S) наблюдалось в содержащих NaCl облученных растворах Ado и ADP, в отличие от растворов A, в [6]. Поэтому вклад реакции (1) в образование H₂O₂, по-видимому, возможен. Вклад реакции (2) маловероятен, поскольку образование радикалов OH^• не регистрируется методом ЭПР ни в одной из исследованных систем.

В [19] выдвинуто предположение о существенности для транспорта электронов образования “напряженных” связей OH-групп с окружающими реагентами (которое, по-видимому, может быть отнесено и к молекулам H₂O). Экспериментальными основаниями для этого предположения служили опыты по обнаруживаемому методом ЭПР при 77 K переносу электрона от фотоиндуцируемого донора (обычно, триптофан) к различным акцепторам. Отмечается, что перенос электрона между донором и возможным акцептором возможен при концентрациях последнего <0.01 M, т.е. при расстояниях, составляющих <28 Å [19].

Возможная справедливость предполагаемого в [19] механизма фотоиндуцируемых реакций в исследованных нами системах в случаях “внутриагрегатного” (без существенного выброса интермедиатных свободнорадикальных продуктов в среду) образования H₂O₂ представляется весьма привлекательной для интерпретации наших результатов. Этому может способствовать возможность существования в условиях наших экспериментов катион-радикалов A.

Поскольку используемый в качестве базисного сигнал A^• был получен нами при относительно высокой концентрации аденина, [A] = 2 × 10^–3 M (при фотоиндуцируемом окислении A в присутствии P_i [20], pH ~ 5.2), принадлежность его депротонированным катион-радикалам A^+• (pK_a = = 4.2 [21]), предполагавшаяся в наших предшествующих работах, не очевидна.

В работе [22] методом ЭПР было продемонстрировано, что при γ-радиолизе олигомера (dA)₆ в 7.5 M стеклах LiCl при 77 K и последующем отжиге сигналов при T ~ 150 K, изменение параметров электрондефицитных свободных радикалов A свидетельствует о существенном увеличении pK_a этих радикалов (pK_a ~ 8) по сравнению с наблюдаемыми в аналогичных условиях в растворах dA при pK_a > 4.

В жидких растворах методом импульсного радиолиза показано, что при окислении растворов олигонуклеотидов свободными радикалами ${\text{SO}}_{4}^{{ - \bullet }}$ результаты анализа возникающего оптического поглощения зависят от последовательности нуклеиновых оснований. В олигонуклеотидах, содержащих последовательные фрагменты AA и AAA, наблюдалось двухкратное снижение константы скорости депротонирования катион-радикалов A по сравнению с растворами дезоксиаденозина (dA) [21]. В то же время спектры депротонированных (нейтральных) электрондефицитных радикалов A(–H)^• в олигонуклеотидах не зависят от последовательности оснований. Предположено, что значительное увеличение энергетического барьера для депротонирования катион-радикалов A вызвано стабилизацией катиона при стэкинге оснований A [21]. Выводы работ [21, 22] подтверждаются результатами расчетов, показывающими, что в случае стэкинга оснований A отрыв e^– от A приводит к делокализации образующейся “дырки” между 2–3 молекулами [23].

Известно, что расстояние между стэкинг-ассоциированными молекулами AX составляет ~3.4 Å [24]. Это, в принципе, позволяет внедрение в них одномолекулярного слоя H₂O (размер молекулы H₂O < 3 Å). Таким образом, существуют некоторые основания для предположения о том, что ключевым фактором образования H₂O₂ в агрегатах AX является фотоиндуцируемая деструкция молекул H₂O, а не предполагавшееся ранее исключительно восстановление растворенного O₂ и последующее взаимодействие ${\text{O}}_{2}^{{ - \bullet }}$ с компонентами раствора (включая фотоиндуцируемые) [1, 3].

Следует отметить, что выход пероксида водорода в ряде случаев [1, 2, 4, 5] превышает растворимость O₂ в водных и водно-солевых системах [25]. Однако, при использовавшемся способе замораживания наблюдаемое превышение выхода H₂O₂ над содержанием растворенного O₂ может объясняться также адсорбцией O₂ на поверхности образцов либо в результате неизбежных контактов с воздухом при освобождении образцов из контейнеров, либо при контакте их с примесным кислородом, растворенным в жидком азоте [2, 7].

Авторы выражают глубокую благодарность Е.Н. Дегтяреву за существенную помощь в экспериментальной работе.