Журнал физической химии, 2021, T. 95, № 7, стр. 1012-1017

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве объектов исследования использовались L-α- и D-α-аланины производства фирмы Reanal, Венгрия, пиридаксаль гидрохлорид марки “х.ч.” фирмы Ferak, Berlin. Основания Шиффа синтезировались и идентифицировались по методикам, приведенным в работе [3].

Кинетику трансальдимирования измеряли в термостатированных кюветах и поляриметрических трубках. Термостатирование проводилось при помощи термостата U-4 с точностью до ±0.1°С. За начало реакции принимался момент сливания растворов. Идентификацию продуктов реакции проводили методами элементного анализа, УФ-, ИК-спектроскопии, поляриметрии [3]. Константы скорости конденсации и трансальдимирования рассчитывались по уравнениям второго порядка для обратимых и необратимых реакций [4].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенные ранее нами исследования показали, что при взаимодействии пиридоксаля с L- и D-α-аланинами возникает новый хиральный центр в аминоспирте со знаками (+) при взаимодействии пиридоксаля с L-α-аланином и знаком (–) при взаимодействии пиридоксаля с D-α-аланином, абсолютные величины которых со временем увеличиваются [5]. Эти результаты можно объяснить тем, что присоединение NH₂-группы аминокислот происходит не перпендикулярно плоскости карбонильной группы пиридоксаля, а вдоль ее плоскости с образованием аминоспирта и появлением хиральных центров. Далее, по-видимому, происходит поворотная изомерия с образованием промежуточных и конечных продуктов путем оптимизации их энергетических и геометрических параметров (увеличение абсолютного значения удельного угла вращения во времени). Возникает вопрос почему L- и D-α-аланины при взаимодействии с пиридоксалем образуют аминоспирты с различными знаками удельного угла вращения, а также почему абсолютные величины их со временем увеличиваются?

Для выяснения этого вопроса были рассмотрены структуры продуктов взаимодействия пиридоксаля с L-α- и D-α-аланинами с учетом оптимизации их геометрических и энергетических параметов в программе Hyper Chem. Структура этих продуктов рассматривалась путем расположения фрагмента пиридинового кольца ~90° от глаза наблюдателя (совмещение его атомов углерода в орто- и мета-положениях) . Анализ рассматриваемых структур, показал, что ОН-группа располагается приблизительно в одной плоскости пиридинового кольца (условно “левая часть”), СН₂ОН-группа, ввиду нелинейности ее структуры, выступает за плоскость пиридинового кольца (условно “правая часть”). СН₂ОН-группа в аминоспиртах находится слева, а аминокислотный фрагмент – справа от плоскости пиридинового кольца в случае конденсации D-α-аланина с пиридоксалем. Обратная картина наблюдается для аминоспиртов в случае конденсации L-α-аланина с пиридоксалем – (СН₂ОН-группа – справа, аминокислотный фрагмент слева). Такое же расположение наблюдается и у оснований Шиффа – >С=N–R-группа – слева для D-α-аланинового фрагмента и справа для L-α-аланинового фрагмента.

На основании рассмотрения структур промежуточных продуктов конденсации пиридоксаля с L-α- и D-α-аланинами и их конечных продуктов – оснований Шиффа, можно сделать ряд предположений:

1. Карбонильная группа в пиридоксале расположена под углом 90° относительно плоскости пиридинового кольца.

2. Присоединение аминокислот к пиридоксалю происходит стереоспецифично вдоль плоскости карбонильной группы с образованием аминоспиртов и возникновением хиральных центров в них (появлением оптической активности).

3. Далее стереоспецифично происходит поворотная изомерия путем оптимизации геометрических и энергетических параметров аминоспиртов и оснований Шиффа, приводящих к изменению угла вращения за счет вращения аминоспиртовых фрагментов при хиральном центре относительно плоскости пиридинового кольца с образованием R (D)- или S (L)-изомеров.

Результаты проведенных исследований [6–12] взаимодействия пиридоксаля с различными по структуре аминокислотами и аминами показали:

1. β- и ε-аминокислоты (β-аланин и лизин) взаимодействуют с пиридоксалем с образованием оснований Шиффа, устойчивых к дальнейшим химическим превращения.

2. L-$\alpha ~$-аминокислоты, взаимодействуя с пиридоксалем образуют основания Шиффа, которые после отщепления α-водорода перестраиваются в хиноидную структуру с последующим гидролизом и образованием в качестве конечных продуктов – кетокислот и пиридоксамина.

3. Основания Шиффа с D-α-аминокислотами декарбосилируются с последующей перестройкой в хиноидную структуру с образованием после гидролиза пиридоксаля и этиламина.

Из литературных данных [13] известно, что образование новых оснований Шиффа, по-видимому, происходит путем присоединения аминогруппы не к $ > {\kern 1pt} {\text{C}}{\kern 1pt} = {\kern 1pt} {\text{C}}$-группы PLP-зависимых ферментов, а к С=NH⁺-группе, путем трансальдимирования. За стадией присоединения к продукту конденсации пиридоксаля с L-лизином следует стадия элиминирования ε-аминогруппы молекулы лизина. Косвенным доказательством этого предположения механизма служит предложенная авторами работы [13] гипотеза, что присоединение к НС=NH⁺-группе происходит гораздо быстрее, чем присоединение к HC=O-группе. Это подтверждается, по мнению авторов, исчезновением положительного кругового дихроизма при добавлении субстрата к коферменту, которое после превращения субстрата круговой дихроизм появляются вновь.

При взаимодействии пиридоксалиден-β-аланина с L-α-аланином при λ 430 нм оптическая плотность растворов смеси на стадии присоединения резко уменьшается, а затем со временем на стадии отщепления β-аланина– возрастает. При взаимодействии пиридоксалиден-β-аланина с D-α-аланином при той же длине волны оптическая плотность смеси растворов на первой стадии со временем резко возрастает, а затем на второй стадии медленно увеличивается до некоторого постоянного значения (рис. 1).

Рис. 1.

Изменение оптической плотности смеси 0.01 М растворов пиридоскалиден-β-аланина (1) с L-α- (2) и D-α-аланинами (3) по времени (90%-ный спиртово-водный буферный раствор, рН 6.7; Т = 20°С).

Анализ кинетических кривых позволил сделать предположение, что на первой стадии (быстрое увеличение или быстрое уменьшение оптической плотности смесей растворов) происходит присоединение NH₂-групп аминокислот к основанию Шиффа с образованием промежуточного продукта аминаля. На второй стадии происходит отщепление β-аминокислоты с образованием конечного продукта –пиридоксалиден – L-α-аланина или пиридоксалиден-D-α-аланина. Возникает вопрос почему в результате взаимодействия пиридоксалиден- β-аланина с L-α-аланином на первой стадии происходит уменьшение оптической плотности смеси растворов, а при взаимодействии пиридоксалиден – β-аланина с D-α-аланином, наоборот – резкое увеличение оптической плотности смеси растворов, хотя согласно литературным данным и нашим экспериментальным данным на первой стадии образуется один и тот же промежуточный продукт – аминаль? Для выяснения этого вопроса была изучена кинетика и механизм трансальдимирования методом поляриметрии. На стадии присоединения к основанию Шиффа L-α-аланина или D-α-аланина должен возникнуть хиральный центр. Данные, приведенные на рис. 2, показывают, что при взаимодействии пиридаксалиден-β-аланина с L-α-аланином на первой стадии очень быстро образуется продукт, у которого удельный угол вращения – положительный. Обратная картина наблюдается при взаимодействии пиридоксалиден-β-аланина с D-α-аланином. Очень быстро образуются промежуточный продукт – аминаль с отрицательным удельным углом вращения.

Рис. 2.

Изменение удельных углов вращения во времени при взаимодействии 0.01 М смеси раствора пиридаликсен-β-аланина (1) с L-α-аланином (2) и D-α-аланином (3) на стадии образования N-ацеталей (90°-ный спиртово-водный буферный раствор, рН 6.7; Т = = 20°С. DigiPol DS Automatic Sacsharimeter, USA; удельные углы вращения L-α-аланина (4) и D‑α-аланина (5).

Критический анализ кинетических кривых методами УФ-спектроскопии, поляриметрии, а также рассмотрение структуры промежуточных (аминалей) и конечных продуктов по программе Hyper Chem показал:

1. В основаниях Шиффа и (пиридоксалиден-β-аланина) и в конечных продуктах аминная группа развернута на 90° относительно плоскости пиридинового кольца.

2. Присоединение аминокислоты к основанию Шиффа происходит стереоспецифично – вдоль плоскости $ > {\kern 1pt} {\text{C}}{\kern 1pt} = {\kern 1pt} {\text{NH}}{\kern 1pt} - $ группы из-за пространственных затруднений (наличие ОН- и СН₂ОН-групп в орто-положении ) с образованием аминаля ($ - {\kern 1pt} {\text{CH}}{\kern 1pt} < {\kern 1pt} \begin{array}{*{20}{c}} {{\text{NHR}}} \\ {{\text{NHR}}{\kern 1pt} '} \end{array}$) в строго определенных положениях аминокислотных фрагментов в пространстве. При этом происходит очень быстрое изменение оптической плотности смеси растворов (резкое увеличение или резкое уменьшение) с возникновением хиральных центров.

3. Затем, по-видимому, происходит поворотная изомерия за счет оптимизации геометрических и энергетических параметров с отщеплением одного из компонентов в N-аминалях (программа Hyper Chem).

Попытки выделить аминали не увенчались успехом даже при проведении реакций при низких температурах из-за большой нестабильности промежуточных продуктов. Возникает вопрос почему при взаимодействии пиридаксалиден-β-аланин с L-α- и D-α- аланинами образуются аминали с различными знаками удельных углов вращения с изменениями их абсолютных величин во времени? Для объяснения этого сложного вопроса были рассмотрены структуры аминалей и оснований Шиффа в программе Hyper Chem с учетом оптимизации их геометрических и энергетических параметров. Поскольку, как отмечалось ранее, $ > {\kern 1pt} {\text{C}}{\kern 1pt} = {\kern 1pt} \mathop {{\text{NHR}}}\limits^ + $- и $ > {\kern 1pt} {\text{C}}{\kern 1pt} < {\kern 1pt} \begin{array}{*{20}{c}} {\mathop {{\text{N}}{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{R}}}\limits^ + } \\ {{\text{NHR'}}} \end{array}$-группы развернуты относительно плоскости пиридинового кольца ~90° от глаза наблюдателя структура промежуточных и конечных продуктов рассматривалась путем совмещения атомов углерода пиридинового кольца в орто- и мета-положениях. Анализ рассматриваемых структур показал, что орто-ОН-группа расположена приблизительно в одной плоскости пиридинового кольца (условно “левая часть”), а CH₂OH-группа ввиду ее нелинейности выступает за плоскость пиридинового кольца (условно “правая часть”).

D-α-аминокислотный фрагмент в N-аминалях и основаниях Шиффа располагается “слева”, а β-аминокислотный фрагмент в этих структурах располагается “справа”. Поэтому при взаимодействии пиридоксалиден-β-аланина с L-α- и D-α-аланинами в качестве промежуточных продуктов образуются N-аминали с различным расположением аминокислотных фрагментов в пространстве относительно плоскости пиридинового фрагмента с образованием двух конфигураций R (D+) и S (L–).

Далее происходит отщепление одного из фрагментов в N-аминалях с одновременной поворотной изомерией с образованием конечного продукта с оптимальными энергетическими и геометрическими параметрами. Эти экспериментальные данные, по-видимому, объясняют взаимосвязь величин удельного угла вращения и его знак со структурой промежуточных и конечных продуктов, обнаруженных методами УФ-спектроскопии.

Изучение кинетики и механизма трансальдемирования продуктов конденсации L-α-аланина и D-α-аланина с пиридоксалем УФ-спетрофотометрическим методом показало, что реакция протекает через две кинетически различимые стадии: 1 – стадия присоединения аминокислот к основанию Шиффа с образованием промежуточного продукта – N-аминаля, 2 – стадия отщепления одного из энантиомеров аминокислот с образованием нового основания Шиффа. Это доказывается кинетическими кривыми зависимости изменения оптической плотности смеси реагирующих растворов во времени. Согласно данным рис. 3 на первой стадии – стадии присоединения происходит в обеих случаях резкое уменьшение оптической плотности смеси растворов, а затем на второй стадии увеличение оптической плотности за счет образования нового основания Шиффа.

Рис. 3.

Изменение оптической плотности смеси 0.01 М растворов пиридоксалиден-L-α-аланина с D‑α-аланином (1) и пиридоксалиден-D-α-аланина с L-α-аланином (2) на стадии дезаминирования N‑аминалей во времени (90%-ный спиртово-водный буферный раствор, рН 6.65, Т = 20°С).

При таком предполагаемом механизме трансальдимирования на стадии присоединения аминокислоты к основанию Шиффа должен возникнуть хиральный центр. Изучение кинетики и механизма трансальдимирования энантиомеров аланина поляриметрическим методом показало, что при сливании растворов в начальный момент времени наблюдается резкое понижение положительного удельного угла вращения при взаимодействии пиридоксалиден-L-α-аланина с D-α-аланином (стадия присоединения), а затем медленно положительный удельный угол вращения уменьшается, переходя в отрицательный, на стадии отщепления L-α-аланина и образования пиридоксалиден-D-α-аланина. Обратная картина наблюдается при взаимодействии пиридоксалиден-D-α-аланина с L-α-аланином (рис. 4). На первой стадии наблюдается вначале времени резкое уменьшение отрицательного удельного угла вращения, а затем медленно удельный угол вращения переходит от отрицательного значения в положительное на стадии дезаминирования и образования нового основания Шиффа.

Рис. 4.

Изменение удельных углов вращения при взаимодействии пиридоксалиден-L-α-аланина с D-α-аланином (1) и пиридоксалиден-D-α-аланина с L-α-аланином (2), 3 – [α] – L-α-аланин, 4 – [α] – D-α-аланин (90%-ный буферный раствор, рН 6.65, Т = 20°С).

Изучение кинетики и механизма взаимодействия пиридаксалиден- L-α- и пиридаксалиден- D-α-аланинами с D-α- и L-α-аланинами соответственно использованием программы Hyper Chem показало, что в результате присоединения этих аминокислот к основаниям Шиффа образуются в качестве промежуточных продуктов – N‑аминали с различным расположением аминных фрагментов в них относительно плоскости пиридинового цикла. Эти соединения, по всей вероятности, имеют различные знаки и величины удельных углов вращения. Аналогичные зависимости структур промежуточных продуктов – аминалей и новых оснований Шиффа наблюдается в реакциях трансальдимирования с L-α-аланина и D-α-аланина под действием пиридоксаля. В целом механизм трансальдимирования можно представить:

Таким образом, результаты кинетических и структурных исследований позволили сделать ряд важных выводов для биохимии и решения ферментативных проблем.

1. В пиридоксале карбонильная группа развернута на 90° относительно плоскости пиридинового фрагмента.

2. В продуктах взаимодействия пиридоаксаля с L-α- и D-α-аминокислотами аминные фрагменты в основаниях Шиффа развернуты относительно плоскости пиридинового фрагмента на ~90°.

3. При конденсации пиридоксаля с аминокислотами и трансальдимировании оснований Шиффа с аминокислотами реагент атакует –HC=NR-связи вдоль их плоскостей расположения в пространстве.

4. Структура образующихся промежуточных продуктов (аминоспиртов и N-аминалей), их оптические свойства (величины и знак удельных углов вращения), определяются различным расположением ОН-групп и аминных фрагментов относительно плоскости пиридинового кольца.