1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Журнал физической химии
  4. T. 96, № 5, 2022

Журнал физической химии, 2022, T. 96, № 5, стр. 747-753

Влияние амфифильных полимеров на активность бенгальского розового в реакции фотоокисления триптофана в водной среде

А. С. Курьянова a, b, *, Н. А. Аксенова a, b, М. А. Савко a, Н. Н. Глаголев a, А. С. Дубовик c, d, И. Г. Плащина c, П. С. Тимашев a, b, e, А. Б. Соловьева a

a Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семенова РАН
Москва, Россия

b Институт регенеративной медицины, Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова
Москва, Россия

c Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН
Москва, Россия

d Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН
Москва, Россия

e Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Москва, Россия

* E-mail: kuryanovaanastasi@gmail.com

Поступила в редакцию 26.10.2021
После доработки 26.10.2021
Принята к публикации 29.10.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Исследовано влияние амфифильных полимеров (АП) – плюроников F-127 и F-108, поли-N-винилпирролидона (ПВП) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) на фотокаталитическую активность ксантенового красителя – бенгальского розового (БР) в реакции фотоокисления триптофана в воде. БР – эффективный фотосенсибилизатор (ФС) в генерации синглетного 1О2 кислорода и находится в растворе в виде ассоциатов. Показано, что все указанные АП повышают эффективную константу скорости фотоокисления триптофана, что обычно связывается с частичной дезагрегацией таких ассоциатов. При этом наибольший эффект наблюдается в присутствии плюроника F-108. В присутствии АП наблюдается изменение ЭСП и спектров флуоресценции ксантенового красителя, в частности, в том числе, батохромный сдвиг (5–15 нм) полос поглощения красителя и рост интенсивности (в 2–5 раз) фотолюминесценции БР, причем наибольший рост интенсивности флуоресценции БР наблюдается при добавлении ПВП. Методом динамического рассеяния света показано, что размер частиц бенгальского розового уменьшается в 1.3–1.5 раза в присутствии плюроника F-108 и ПВП. Наблюдаемые закономерности свидетельствуют о взаимодействии между ксантеновым красителем и АП. Такие системы на основе БР-АП перспективны для применения в качестве препаратов для тераностики – флуоресцентной визуализации и лечении методом фотодинамической терапии онкологических и неонкологических опухолей.

Ключевые слова: бенгальский розовый, амфифильные полимеры, фотоокисление триптофана, спектры поглощения и фотолюминесценции, фотодинамическая терапия, тераностика

Переход к персонализированной медицине требует новые способы лечения различных видов заболеваний для конкретного пациента при диагностировании и терапии. Тераностика является одним из таких методов, объединяющих диагностику и терапию в единую систему для достижения оптимальной эффективности лечения [1–3]. В частности, при фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний, одним из наиболее органощадящих и эффективных методов лечения, в организм вводят внутримышечно/внутривенно туморотропный фотосенсибилизатор (ФС), который избирательно накапливается в опухоли, визуализируя пораженные участки (флуоресцентная диагностика) и разрушает патологические клетки и ткани. Это происходит благодаря способности ФС активировать при фотовозбуждении молекулярный кислород с образованием активных форм кислорода, прежде всего, синглетного 1О2 кислорода. Однако большинство ФС имеют недостаточно интенсивную люминесценцию для использования их в тераностике [1, 2]. В последнее время наряду с макроциклическими ФС – порфиринами и фталоцианинами в ФДТ начинают использовать природные и синтетические красители, более доступные и достаточно эффективные в генерации 1О2 кислорода. В частности, ввиду хорошей растворимости в воде, достаточно высокому квантовому выходу генерации синглетного 1О2 кислорода (ФΔ – 0.76), низкой темновой токсичности, наличию собственных бактерицидных свойств, ксантеновый краситель – бенгальский розовый (БР) применяется в ФДТ при лечении онкологических [4–8] и неонкологических локализованных воспалений (антимикробная фотодинамическая терапия), в том числе при лечении микозов [8–14]. Однако из-за склонности к агрегации для БР характерна невысокая активность при применении в ФДТ, что приводит к необходимости использовать достаточно высокие концентрации красителя, что, соответственно, обусловливает повышенную токсичность БР [15, 16]. Для снижения агрегации и повышения фотосенсибилизирующей активности БР используют реагенты, препятствующие агрегации и способствующие проникновению красителя через клеточные мембраны. Среди таких реагентов известны, в частности, полисахариды и ПАВ [17–19].

Ранее нами было показано, что некоторые амфифильные полимеры (АП), в том числе поливинилпирролидон (ПВП), тройные блоксополимеры этилен – и пропилен-оксидов, плюроники F127 и F108, не обладающие собственной фотохимической активностью, образуют с порфириновыми фотосенсибилизаторами (ПФС) в воде слабосвязанные комплексы, что способствует разагрегации и увеличению фотосенсибилизирующей активности ПФС в модельных процессах фотоокисления, в клеточных экспериментах и in vivo-экспериментах (модельные раны у крыс линии Wistar) [20, 21]. Так, совместное использование ПФС с плюроником F127 повышает активность порфиринов в 10–30 раз при фотодинамическом воздействии на культуры раковых клеток, а также в экспериментах in vivo при ФДТ опухолей поверхностной локализации и модельных ран у животных [21]. Возможно такое повышение активности ПФС в присутствии плюроников, связано со способностью этих ПАВ облегчать проникновение ароматических соединений, в частности, цитотоксического антибиотика доксирубицина, в раковые клетки [22].

В данной работе изучено влияние амфифильных полимеров на спектры поглощения и флуоресценции и фотокаталитическую активность бенгальского розового в генерации синглетного 1О2 кислорода (в реакции фотоокисления триптофана).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Использовали бенгальский розовый, БР (натриевая соль 4,5,6,7-тетрахлор-2',4',5',7'-тетрайодфлуоресцеина, 95%, Sigma-Aldrich), (рис. 1). В качестве амфифильных полимеров использовали: полиэтиленгликоль (ПЭГ), м.м. 4 × 104 Da (Serva,), поли-N-винилпирролидон (ПВП), м.м. 4 × 104 Da (Sigma-Aldrich), а также плюроник F127 с м.м. 12600 Da (Sigma-Aldrich) и плюроник F108 с м.м. 14600 Da (Fluka). В качестве субстрата в модельной реакции фотоокисления использовали D,L-триптофан (Трп) (Acros Organics).

Рис. 1.

Структурная формула бенгальского розового.

Системы БР-АП получали смешением водных растворов обоих компонентов и перемешиванием в течение 15 мин. Фотоокисление триптофана осуществлялось за счет растворенного в воде молекулярного кислорода в кварцевой кювете (толщина l = 1 см) при комнатной температуре и перемешивании с помощью магнитной мешалки. Концентрация триптофана составляла 1.0 × 10–4 М, концентрацию БР варьировали от 2 × 10–6 до 1 × × 10–5 М, а концентрация АП менялась от 0 до 0.8 мас. %. Освещение реакционной смеси осуществляли светодиодным фототерапевтическим аппаратом “АФС” (ООО “Полироник”, Россия) с λ = 530 нм, мощностью – 210 мВт. Кинетику процесса фотоокисления фиксировали по уменьшению оптической плотности полосы поглощения в электронных спектрах поглощения Трп (λ = = 280 нм). Электронные спектры поглощения (ЭСП) растворов снимали на спекторофотометре Cary 50 (Varian), спектры флуоресценции – на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian).

Для сопоставительной оценки активности фотосенсибилизирующей БР и его комплексов с АП использовали эффективную константу keff скорости фотоокисления триптофана: keff = (C0 –‒ Ct)/(С0ΔtCБР)), где C0 и Сt – исходная концентрация субстрата и концентрации Трп в момент времени t, CБР– концентрация бенгальского розового. Ошибка измерений составляла ~10%.

Размер частиц БР в водном растворе в присутствии и отсутствии АП, а также амфифильных полимеров определяли методом динамического рассеяния света (ДРС) на анализаторе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., UK), оснащенном гелий-неоновым лазером с мощностью 4 мВт и длиной волны 633 нм. Растворы фильтровали через фильтрующую поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану с диаметром пор 0.22 мкм (Milipore Millex-GV, Germany) в кварцевую кювету (PSC1115). Измерения проводились при комнатной температуре и угле рассеяния 173°. Данные обрабатывались с помощью программного обеспечения Zetasizer Software 6.20 (Malvern Instruments Ltd., UK).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Как уже упоминалось, бенгальский розовый в силу своей гидрофобности склонен к агрегации в водных растворах, уже при концентрациях выше 2 × 10–6 М БР образует агрегаты H-типа [15]. Процессы агрегации БР отражаются в его спектре поглощения (рис. 2).

Рис. 2.

ЭСП БР при концентрациях: 2 × 10–6 (1), 5 × 10–6 (2) и 1 × 10–5 (3) М.

В частности, в ЭСП БР имеется основная полоса поглощения при 550 нм, которая относится к мономерной форме красителя и “плечо” в области 515 нм, относящееся к его димерной форме (рис. 2) [16, 23, 24]. Таким образом, увеличение оптической плотности полосы с λ = 515 нм в ЭСП БР является свидетельством процесса агрегации молекул бенгальского розового, происходящего при увеличении концентрации красителя (рис. 2).

При введении АП в растворы БР наблюдается батохромный сдвиг обоих полос поглощения с λ = 550 и 515 нм на 5–15 нм, связанный, очевидно, с изменением локального окружения молекул красителя. Одновременно наблюдается рост оптической плотности полосы поглощения БР при 550 нм, отвечающей мономерной форме БР (рис. 3а). Можно полагать, что в присутствии амфифильных полимеров происходит дезагрегация исходно существующих в растворе димеров БР. Об этом же свидетельствует и увеличение в 2–5 раз (в зависимости от природы полимера) интенсивности (I) полосы флуоресценции БР при добавлении к раствору ксантенового красителя амфифильных полимеров (рис. 3б). При этом наибольшее влияние на ЭСП и спектр флуоресценции БР оказывает ПВП. Известно, что ПВП в водных растворах склонен как к ионным, так и к гидрофобным взаимодействиям. Поскольку в молекуле БР присутствуют как анионные, так и гидрофобные группировки, взаимодействие ПВП – БР, очевидно, достаточно сильное (по сравнению с другими изученными АП), что и отражается в соответствующих спектрах флуоресценции и ЭСП [25–27].

Рис. 3.

Электронные спектры поглощения (а) и флуоресценции (б) БР (1), и БР в присутствии АП: плюроника F108 (2), F127 (3), ПЭГ (4) и ПВП (5); [БР] = 5 × 10–6 М, концентрации полимеров – 0.1 мас. %; *– БР-ПВП разбавлен в 2 раза, ввиду резкого подъема интенсивности флуоресценции БР в присутствии ПВП.

По соотношению φ оптических плотностей полос с λ = 550 и 515 нм (φ = Dmax/Dshoulder) обычно судят об изменении содержания димерной или мономерной формы ксантенового красителя. На рис. 4 представлена зависимость φ при трех концентрациях БР от концентрации всех изучаемых амфифильных полимеров. Так, для чистого БР при С = 2 × 10–6, 5 × 10–6 и 1 × 10–5 М величины φ практически одинаковы φ = 3–3.1, что в соответствии с литературными данными, означает, что ксантеновый краситель при данных концентрациях содержит больше мономерных, чем димерных форм [23, 24]. При добавлении полимеров с концентрацией 0.1 мас. % величина φ повышается (до ~3.4), что свидетельствует о смещении равновесия мономер ↔ димер в сторону мономера. Дальнейшее повышение концентрации АП практически не влияет на величину φ, что свидетельствует о сохранении определенного равновесия мономер ↔ димер даже в присутствии избытка ПВП.

Рис. 4.

Зависимости φ = (Dmax/Dshoulder) при концентрациях БР = 2 × 10–6 (а), 5 × 10–6 (б) и 1 × 10–5 (в) М от концентрации полимеров: плюроников F108 (1) и F127 (2), ПЭГ (3), ПВП (4).

Таким образом, вне зависимости от природы АП, величины φ примерно одинаковы, т.е. определенное количество димерных (или более высоких) агрегатов БР в растворе сохраняется, даже при высоких содержаниях АП.

На рис. 5 приведены зависимости интенсивности флуоресценции I БР (2.0 × 10–6 М) от концентрации амфифильных полимеров. Как уже было упомянуто выше (рис. 2), амфифильные полимеры (0.1%) повышают величину I БР, причем наибольший рост наблюдается в присутствии ПВП. Важно, что как следует из рис. 5, уже при концентрации ПВП 0.04% интенсивность флуоресценции БР (2 × 10–6 М) превышает I исходного БР в 4.5 раза. Дальнейшее увеличение концентрации ПВП практически не меняет интенсивность флуоресценции. Аналогичные зависимости I от концентрации АП были получены для БР с [5 × × 10–6 М] и [1 × 10–5 М]. Во всех случаях при концентрации АП выше 0.04% I красителя уже практически не меняется вне зависимости от содержания добавленного АП. Это свидетельствует, очевидно, как о достаточно сильном взаимодействии молекул красителя с фрагментами макромолекул АП, так и о существовании динамического равновесия в системе мономер↔димер БР.

Рис. 5.

Зависимости интенсивности флуоресценции бенгальского розового от концентрации полимеров. АП: плюроник F108 (1), плюроник F127 (2), ПЭГ (3), ПВП (4); [БР] = 2 × 10–6 М.

Таким образом, взаимодействие БР с изучаемыми амфифильными полимерами, приводящее к разагрегации исходно ассоциированных молекул БР, происходит достаточно эффективно. Это подтверждается и при использовании БР в присутствии АП в качестве фотосенсибилизатора процесса окисления триптофана. При изучении фотосенсибилизирующей активности БР в реакции фотоокисления триптофана и влияния на эффективную константу keff скорости процесса амфифильных полимеров оказалось, что с увеличением концентрации бенгальского розового уменьшается его фотокаталитическая активность, что, возможно, связано с увеличением степени агрегированности БР в водном растворе при увеличении его концентрации (рис. 6).

Рис. 6.

Зависимость эффективной константы скорости (keff) фотоокисления триптофана (1 × 10–4 М) от концентрации БР (1).

На рис. 7 приведены зависимости эффективной константы keff скорости фотоокисления триптофана в присутствии БР при трех его концентрациях 2 × 10–6 М, 5 × 10–6 М и 1 × 10–5 М от концентрации амфифильных полимеров. Видно, что в присутствии АП keff процесса (а, следовательно, и фотосенсибилизирующая активность ксантенового красителя) растет. Наибольший рост фотокаталитической активности бенгальского розового наблюдается при концентрациях красителя (2 и 5) × 10–6 М в присутствии плюроников F108 (кривая 1) и F127 (2), ПЭГ (кривая 3) с концентрацией 0.1 мас. % (рис. 7 а и б). Уменьшение keff при дальнейшем увеличении концентрации АП, возможно, происходит из-за того, что не только молекулы БР, но и молекулы субстрата (триптофана) взаимодействуют с АП и, с ростом концентрации полимера возрастает вероятность “неэффективного” связывания БР и триптофана макромолекулами АП. Другими словами краситель и субстрат могут связываться с разными фрагментами цепей амфифильных полимеров или с разными макромолекулами АП.

Рис. 7.

Зависимости эффективной константы скорости фотоокисления триптофана (С = 1 × 10–4 М) в присутствии БР (С = 2 × 10–6 М (а), 5 × 10–6 М (б)) и 1 × 10–5 М (в) от концентрации АП: плюроник F108 (1), плюроник F127 (2), ПЭГ (3) и ПВП (4). Концентрации полимеров варьировались в пределах 0–0.8 мас. %.

Как следует из рис. 7в, при концентрации БР 1 × 10–5 М амфифильные полимеры незначительно влияют на величину эффективной keff константы скорости фотоокисления триптофана, что, очевидно, связано с высоким содержанием агрегатов красителя при высокой концентрации БР.

Для подтверждения факта связывания амфифильных полимеров с БР методом динамического рассеяния света были измерены размеры частиц БР в присутствии и отсутствии полимеров. В качестве АП были взяты плюроник F108, который оказывает наибольшее влияние на фотокаталитическую активность БР, и ПВП, который среди выбранных АП оказывает наибольшее влияние на ЭСП и спектр флуоресценции бенгальского розового. Полученные данные приведены в таблице 1. Из табл. 1 следует, что размер частиц БР (при его концентрации в растворе 10–3 М) представлен двумя величинами ~161 нм, что можно отнести к агрегатам БР и 0.7 нм, что соответствует единичному размеру молекул красителя. Размер частиц анионного красителя в присутствии АП уменьшается в 1.2–1.5 раза, что подтверждает дезагрегацию молекул бенгальского розового в присутствии амфифильных полимеров.

Таблица 1.  

Средний размер частиц БР, F108, ПВП и смесей БР-АП в водных растворах, определенный методом динамического рассеяния света

Образец Размер частиц, нм
BR (1 × 10–3 М) 0.7 ± 0.2 (6%)
  161 ± 1.5 (94%)
F108 (1 × 10–3 М) 5.24 ± 0.15 (90%)
  78.1 ± 0.3 (10%)
PVP (1 × 10–3 М) 6.05 ± 0.5 (66%)
  29 ± 1.5 (34%)
BR + F108(1 : 1) 5.75 ± 0.5 (16%)
  35 ± 1.5 (30%)
  132 ± 2.5 (54%)
BR + PVP (1 : 1) 5.1 ± 0.2 (30%)
  15.4 ± 0.4 (45%)
  108 ± 2.5 (25%)

Таким образом, некоторые АП способны повышать фотокаталическую активность БР. Наибольший эффект достигался при добавлении плюроников F108 и F127. При росте концентраций красителя 2 и 5 × 10–6 М. С ростом концентрации БР (для 1 × 10–5 М) образуются очевидно прочно связанные ассоциаты красителя, которые практически не распадаются в присутствии АП. Наличие взаимодействия между ксантеновым красителем и АП иллюстрируют ЭСП и спектр флуоресценции. С помощью динамического светорассеяния показано, что в двухкомпонентной системе на основе БР-АП размер частиц ксантенового красителя уменьшается в 1.2–1.5 раза.

Наблюдаемая высокая интенсивность флуоресценции БР в присутствии АП, прежде всего ПВП, может стать основой для создания перспективных препаратов на основе бенгальского розового и поливинилпирролидона для тераностики.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках научного проекта № 20-32-90097 и госзадания № 0082-2019-0012.

Список литературы

  1. Ryu J. H., Lee S., Son S. et al. // J. Control. Release. 2014. V. 190. P. 477.https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2014.04.027

  2. Josefsen L.B., Boyle R.W. // Theranostics. 2012. V. 2. № 9. P. 916.https://doi.org/10.7150/thno.4571

  3. Chernov V.I., Bragina O.D., Sinilkin I.G. et al. // Vestn. Rentgenol. Radiol. 2016. V. 97. № 5. P. 306.https://doi.org/10.20862/0042-4676-2016-97-5-306-313

  4. Sun W., Luo L., Feng Y. et al. // Adv. Mater. 2020. V. 32. № 23. P. 1.https://doi.org/10.1002/adma.202000377

  5. Qin J., Kunda N., Qiao G. et al. // Cell Death Dis. 2017. V. 8. № 2. P. 1.https://doi.org/10.1038/cddis.2016.473

  6. Uppal A., Jain B., Gupta P.K. et al. // Photochem. and Photobiol. 2011. V. 87. № 5. P. 1146.https://doi.org/10.1111/j.1751-1097.2011.00967.x

  7. Maker A.V., Prabhakar B., Pardiwala K. // J. Clin. Cell. Immunol. 2015. V. 6. № 4. P. 5.https://doi.org/10.4172/2155-9899.1000343

  8. Demartis S., Obinu A., Gavini E. et al. // Dye. Pigment. 2021. V. 188. P. 1.https://doi.org/10.1016/j.dyepig.2021.109236

  9. Fila G., Kasimova K., Arenas Y. et al. // Front. Microbiol. 2016. V. 7. P. 1.https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.01258

  10. Rossoni R.D., Junqueira J.C., Santos E.L.S. et al. // Lasers Med. Sci. 2010. V. 25. № 4. P. 581.https://doi.org/10.1007/s10103-010-0765-1

  11. Amescua G., Arboleda A., Nikpoor N. et al. // Cornea. 2017. V. 36. № 9. P. 1141.https://doi.org/10.1097/ICO.0000000000001265

  12. Корнишева В.Г. // Проблемы медицинской микологии 2015. Т. 17. № 1. С. 3.

  13. Kochevar I.E., Redmond R.W. // Methods in Enzymol. 2000. V. 319. P. 20.https://doi.org/10.1016/s0076-6879(00)19004-4

  14. Paulino T.P., Magalhaes P.P., Thedei G. et al. // Mol. Biol. Educ. 2005. V. 33. № 1. P. 46.https://doi.org/10.1002/bmb.2005.494033010424

  15. Xu D., Neckers D.C. // J. Photochem. and Photobiol. A Chem. 1987. V. 40. P. 361.https://doi.org/10.1016/1010-6030(87)85013-X

  16. Neckers D.C. // J. Photochem. and Photobiol. A Chem. 1989. V. 47. № 1. P. 1.https://doi.org/10.1016/1010-6030(89)85002-

  17. Fini P., Castagnolo M., Catucci L. et al. // Thermochim. Acta. 2004. V. 418. P. 33.https://doi.org/10.1016/j.tca.2003.11.041

  18. Shrestha A., Kishen A. // Photochem. and Photobiol. 2012. V. 88. № 3. P. 577.https://doi.org/10.1111/j.1751-1097.2011.01026.x

  19. Wang X.L., Zeng Y., Zheng Y.Z. et al. // J. Chem. – A Eur. 2011. V. 17. № 40. P. 11223. https://doi.org/10.1002/chem.201100975

  20. Aksenova N.A., Zhientaev T.M., Brilkina A.A. et al. // Photonics Lasers Med. 2012. V. 1. № 1. P. 189.https://doi.org/10.1515/plm-2013-0011

  21. Rudenko T.G., Shekhter A.B., Guller A.E. et al. // Photochem. and Photobiol. 2014. V. 90. № 6. P. 1413.https://doi.org/10.1111/php.12340

  22. Batrakova E.V., Dorodnych T.Y., Klinskii E.Y. et al. // Br. J. Cancer. 1996. V. 74. № 10. P. 1545.https://doi.org/10.1038/bjc.1996.587

  23. Mendes B., Kassumeh S., Aguirre-Soto A. et al. // Photochem. and Photobiol. 2021. P. 1.https://doi.org/10.1111/php.13379

  24. Chang C.C., Yang Y.T., Yang J.C. et al. // Dye. Pigment. 2008. V. 79. № 2. P. 170–175.https://doi.org/10.1016/j.dyepig.2008.02.003

  25. Кирш Ю.Э. Поли-N-винилпирролидон и другие поли-N-виниламиды М.: Наука, 1998. 252 с.

  26. Ghiggino K.P., Brown J.M., Launikonis A. et al. // Aust. J. Chem. 1988. V. 41. № 1. P. 9.https://doi.org/10.1071/CH9880009

  27. Maruthamuthu M., Sobhana M. // J. Polym. Sci. A1. 1979. V. 17. № 10. P. 3159.https://doi.org/10.1002/pol.1979.170171008

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Журнал физической химии

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал