Журнал физической химии, 2022, T. 96, № 9, стр. 1240-1248

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность изучения и уточнения теплофизических и термодинамических свойств L-аминокислот обусловлена их важной ролью в азотистом обмене живых организмов. Помимо их широко известных функций в биосинтезе белка, в качестве нейромедиаторов и эндогенных источников NO [1], аминокислоты используются в современной медицинской и пищевой промышленности [2, 3]. Для проведения комплексного изучения процессов с участием аминокислот необходимо иметь возможность осуществлять их термодинамическую оценку, поэтому важно иметь достоверные величины основных термодинамических функций этих соединений.

L-аспарагин представляет собой α-аминокислоту и относится к 20 основным аминокислотам, которые участвуют в построении первичной структуры белков. В организме L-аспарагин участвует в метаболизме клеток мозга и нервной системы и регулирует концентрацию аммиака. В промышленности применение кристаллов аспарагина рассматривают для конструкции нелинейных оптических устройств [4], а также ведется разработка противораковых препаратов на его основе [5].

В настоящей работе получены термодинамические характеристики моногидрата L-аспарагина, L-Asn⋅H₂O.

В литературе методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) изучено поведение L-Asn⋅H₂O [6, 7] в закрытом и открытом (проколотом) контейнере в температурном интервале 353–533 K. На кривой ДСК наблюдали два пика: пик при температуре 355–388 K отнесли к дегидратации, а при 479–526 K к термическому разложению аминокислоты.

Определение теплоемкости L-Asn⋅H₂O калориметрическим методом проведено в двух работах [8, 9]. В работе [8] для определения удельной теплоемкости использовали анероидный медный калориметр. Исследованная область составила 90.4–296.2 K с погрешностью определения менее 1%. Коммерческий образец L-Asn⋅H₂O (фирма “Merck”) был предварительно очищен многократной перекристаллизацией при быстром охлаждении горячего водного раствора, затем образец выдерживали в печи при 100–110°C до постоянной массы. Чистота исследованного образца L‑Asn⋅H₂O в работе не указана. Полученная экспериментальная теплоемкость экстраполирована к 0 K [10], рассчитана абсолютная энтропия L‑Asn⋅H₂O.

Измерение мольных теплоемкостей L‑Asn⋅H₂O в температурном интервале 11–305 K провели в работе Hutchens et al. [9]. В работе использован калориметр, состоящий из медного контейнера с вакуумной изоляцией, окруженный массивным экраном, температура которого остается почти постоянной во время измерения теплоемкости [11], погрешность измерения теплоемкости cсоставляла 5% при 10 K, 2% до 15 K, 1% до 20 K, 0.27% для 40–250 K, 0.4% до 300 K. Образец для исследования был получен из Национального института здравоохранения США (National Institutes of Health, USA). Перед началом эксперимента образец моногидрата L-аспарагина высушивали в калориметре при давлении <10^–6 мм и охлаждении жидким азотом до постоянной массы. Чистота исследуемого образца авторами так же не указана. В работе рассчитаны значения термодинамических функций при 298.15 K.

Сравнение данных, полученных в [8] и [9] (рис. 1) показывает, что величины мольных теплоемкостей моногидрата L-аспарагина сопоставимы в интервале температур от 85 до 297 K, однако, на кривой, полученной в [9] наблюдается некая температурная аномалия от 276 до 284 K, которая отсутствует в [8], т.е. данные по мольной теплоемкости моногидрата L-аспарагина требуют дополнительного уточнения и изучения.

В настоящей работе методами низкотемпературной адиабатической калориметрии (в области температур 7.59–354.33 K), дифференциальной сканирующей калориметрии (в области температур 293–553 K) и рентгеноструктурного анализа проведены экспериментальные определения теплоемкости, параметров плавления и структуры L‑Asn⋅H₂O.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Образец. Коммерческий образец L-аспарагина (компания “Роанал”, чистота 98.0 мас. %) был очищен трехкратной перекристаллизацией из пересыщенного водно-спиртового раствора [12]. В качестве растворителей использовали деионизованную воду (“MilliQ”, “х.ч.”) и этанол (“Химмед”, “х.ч.”). Полученные кристаллы были отфильтрованы, промыты этанолом и высушены при пониженном давлении 2.6 кПа. Далее все операции с очищенным образцом проводили в атмосфере сухого аргона.

Перекристаллизованный образец был исследован методом рентгенофазового анализа. РФА-анализ подтвердил наличие в образце единственной кристаллической фазы, совпадающей с фазой моногидрата L-аспарагина (L-Asn⋅H₂O, C₄H₁₀N₂O₄, CAS 5794-13-8), известной из литературы (CCDC 2041930, кристаллографическая база данных The Cambridge Crystallographic Data Centre (CCDC), https://www.ccdc.cam.ac.uk/structures/). Уточненные методом полнопрофильного анализа (рис. П-1, Приложение) параметры элементарной ячейки составили: a = 5.58836(12) Å, b = 9.8250(2) Å, c = 11.8090(3) Å, пространственная группа P2₁2₁2₁. Дифрактограмма была получена на порошковом дифрактометре Rigaku MiniFLEX 600, оснащенном рентгеновской трубкой с медным анодом (излучение CuKα_1,2, λ = 1.5460 Å) и позиционночувствительным полупроводниковым детектором D/teX Ultra в установках Брэгга–Брентано. Интервал съемки составил 3–90° 2θ, шаг 0.01° 2θ.

Чистота исследуемого образца определена методом элементного анализа, проведенного на приборе CHNS/O анализатор 2400 Series II производства Perkin Elmer. Полученные результаты приведены в табл. 1.

Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) и термогравиметрический анализ (ТГА). Термический анализ проводили на дифференциальном сканирующем калориметре теплового потока DSC 204 F1 Phoenix® (NETZSCH, Германия), оснащенном τ-сенсором с термопарой E-типа. Прибор был предварительно откалиброван согласно стандартам ASTM E967 и ASTM E2253 по точно установленным параметрам фазовых переходов веществ высокой чистоты (99.999%): циклогексан C₆H₁₂, адамантан C₁₀H₁₆, Hg, Ga, бифенил C₁₂H₁₀, бензойная кислота С₆H₅COOH, In, Sn, Bi, KClO₄, Pb, Zn, CsCl. Среднеквадратичное отклонение результатов калибровки от эталонных значений составило 0.1 K по температуре и 3% по теплоте. Точную навеску образца (m = 5.25 мг) L-аспарагина помещали в стандартный алюминиевый контейнер (V = 56 мм³, d = 6 мм), запрессованный крышкой с отверстием, и нагревали в интервале температур 293–553 K со скоростью 2 K/мин в проточной атмосфере инертного газа (N₂, “ос.ч.”, 40 мл/мин).

Термическую стабильность определяли на термомикровесах TG 209 F1 Iris® (NETZSCH, Германия), оснащенных алундовым держателем с защитным экраном и температурным сенсором типа P, откалиброванным по точкам плавления стандартных веществ (In, Sn, Bi, Al, Ag, чистота 99.99%). Точную навеску образца (m = 7.52 мг) нагревали в открытых алундовых тиглях (V = 85 мм³, d = 6.7 мм) в интервале температур 303–553 K со скоростью 10 K/мин в проточной атмосфере инертного газа (N₂, “ос.ч.”, 20 мл/мин). Неопределенность получаемых результатов, согласно измерениям потери массы при нагревании до 1000°С стандартного образца моногидрата оксалата кальция CaC₂O₄⋅H₂O, не превышала 0.5 мас. %.

Массы всех навесок определяли на аналитических весах A&D GH 202 с точностью 1 × 10^–2 мг по разнице значений для пустого контейнера (тигля) и заполненного. Измерения проводили не менее трех раз до получения сходящихся подряд значений.

Экспериментальные данные обрабатывали с помощью пакета анализа NETZSCH Proteus Thermal Analysis согласно нормам ASTM E 793, E 794, 2550.

Адиабатическая калориметрия. Молярную теплоемкость L-Asn⋅H₂O измеряли в автоматизированном вакуумном адиабатическом калориметре. Детали конструкции калориметра и процедуры измерения описаны в работах [13–15].

Образец загружали в цилиндрический контейнер объемом 1 см³, и герметизировали прокладкой из индия. Контейнер в калориметрической ячейке вставляли в медную манжетку с нагревателем (R ~ 300 Ω), окруженную адиабатическим, радиационными и тепловыми экранами. Разница температур между контейнером и адиабатической оболочкой измеряли с помощью дифференциальной термопары (Cu +0.1 мас. % Fe)/Хромель. Адиабатические характеристики калориметра поддерживали цифровым управлением с использованием компьютерной измерительной системы с точностью ±3 × 10^–3 K. Температуру в калориметре измеряли во всей исследуемой области железо-родиевым термометром сопротивления (R_273.1 ~ 51 Ω), прокалиброванным в МТШ-90 [16].

Теплоемкость определяли методом калориметрических ступеней, с “шагом” по температуре 0.1–1.0 K в области 5–80 K и 1.0–2.0 K – выше 80 K. В каждом экспериментальном “шаге” начальную и конечную температуры калориметра в главном периоде оценивали экстраполяцией линейной зависимости скоростей дрейфа температуры во времени до середины этого периода. Время установления температурного равновесия после ввода тепла (60–400 с в зависимости от диапазона температур) контролировали компьютерной программой; время измерения температурного дрейфа составляло 40–270 с. Теплоемкость измеряли в процессе нагрева образца.

Калориметр был протестирован по образцам меди (99.95 мол. %) и хроматографически чистого н-гептана. Средние отклонения экспериментальных значений теплоемкости от прецизионных литературных данных [17, 18] рассматриваются как экспериментальные неопределенности прибора при определении теплоемкости и составляют 2% в диапазоне температур от 7 до 20 K, 1% от 20 до 40 K, 0.4% от 40 до 80 K, 0.2% от 80 до 300 K и 1% выше 300 K. Погрешность определения температуры оценивали в ±2 × 10^–2 K во всем диапазоне температур 7–350 K.

Рентгеноструктурный анализ. Рентгеноструктурный анализ монокристалла моногидрата L-аспарагина проводили с использованием дифрактометра Bruker D8 Quest c детектором Photon III при температурах 113(2), 173(2), 223(2), 265(2), 273(2) и 281(2) К с излучением MoK_α (λ = = 0.71073 Å), φ и ω-сканирования. Структура была расшифрована прямым методом и уточнена полноматричным анизотропным МНК по F² с использованием программного пакета SHELXTL [19, 20]. Атомы водорода были локализованы из карт разностной электронной плотности и уточнены в изотропном приближении. Кристаллографические данные, параметры эксперимента и уточнения структуры приведены в табл. 2. Координаты атомов, длины связей, валентные углы и параметры теплового смещения депонированы в Кембриджском банке структурных данных (CCDC № 2156639–2156643).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Термический анализ, оценка параметров плавления L-Asn⋅H₂O. Предварительно была проведена оценка термической стабильности образца методом термогравиметрического анализа. Согласно проведенным экспериментам на кривой ТГА при температуре 370.86 K наблюдается одностадийное разложение вещества: образец теряет 11.74% или 0.88 мг своей массы в температурном интервале 357–388 K, что соответствует процессу дегидратации аминокислоты (массовое содержание кристаллизационной воды в молекуле моногидрата L-аспарагина равна 11.99%, рис. 2). Для оценки термодинамических параметров процесса плавления моногидрата L-аспарагина применяли метод дифференциальной сканирующей калориметрии. ДСК измерения проводили в открытом тигле в температурном интервале 293–553 K (рис. 2). Согласно полученным ДСК кривым, первый эндотермический пик соответствует процессу дегидратации, начинающемуся при температуре 355.85 K, тепловой эффект, рассчитанный по площади пика, составляет 355.5 Дж/г = = 46.967 кДж/моль. Аналогично настоящей работе, процесс дегидратации в области температур 353–357 K был подтвержден методом термогравиметрии группой Rodante et al. [21], потеря массы образца в их работе составила 14%.

Второй пик на ДСК-кривой можно соотнести с процессом плавления с разложением, который начинается при температуре T_пл = 480.15 K, что хорошо согласуется с литературой. Так, группой Contineanu et al. [22] методом ДСК определена средняя температура начала плавления для шести различных навесок аминокислоты, ${{T}_{{{\text{пл,ср}}}}}$ = 479.9 ± ± 2.6 K. Такой же профиль ДСК кривой в области температур 479–523 K для открытой измерительной ячейки был получен в работе [7], температура начала разложения аминокислоты (${{T}_{{{\text{нач,отк}}}}}$ = 479 K) оказалась ниже, чем для герметичной ячейки (${{T}_{{{\text{нач,зак}}}}}$ = 491 K) при низком давлении и (${{T}_{{{\text{нач,зак}}}}}$ = = 501.85 K) при высоком давлении. Однако в справочнике Lide D.R. [23] приведены более высокие значения температур плавления моногидрата и безводного L-аспарагина, 507 K и 508 K соответственно.

Процесс плавления с разложением происходит в диапазоне температур 480–533 K. Определенная в настоящей работе методом ДСК энтальпия плавления аминокислоты равна ∆Н_пл = = 840.2 Дж/г или 111.01 кДж/моль при стандартной неопределенности значения u(ΔH_пл) = = 3.33 кДж/моль. Полученное значение энтальпии фазового перехода меньше величины, указанной в публикации [7] для открытой ячейки на 2.9%. В случае высокого давления в системе при измерениях в закрытом тигле получено меньшее значение энтальпии разложения, ∆Н_пл = 97.8 кДж/моль, что объясняется частичной деградацией вещества на этапе дегидратации аспарагина.

Теплоемкость, рентгеноструктурный анализ L-Asn⋅H₂O.Теплоемкость L-Asn⋅H₂O определена в интервале температур от 8.63 до 354.33 K. Измерения проводили в контейнере с образцом и гелием (теплообменный газ) при давлении p298(He) = = 10 ± 2 кПа. Образец взвешивали на весах марки “Меттлер” с погрешностью ± 5 × 10^–5 г. Массу образца L-Asn⋅H₂O с поправкой на вакуум (0.59609 г) определяли с использованием плотности 1.567 г см^–3 [24]. В качестве охлаждающих агентов использовали жидкий гелий и жидкий азот. Экспериментальные данные приведены на рис. 3 и в табл. П-1 (Приложение) . Воспроизводимость кривой ${{С}_{{p,m}}}$ =  f (T) составила 0.03–0.2%.

На кривой теплоемкости в области температур 265–275 K обнаружена термическая аномалия, которая хорошо воспроизводится в серии экспериментов. В области аномалии проведено три измерения с различным “шагом” по температуре (∆T – 1, 0.8 и 0.4 K, рис. 4).

Температура максимума аномалии (272.9 ± 0.2 K) соответствует наибольшему значению мольной теплоемкости при исследовании с наименьшим температурным шагом (∆T = 0.4 K). Значения теплоемкостей, полученных в этих экспериментах приведены в табл. П-2 (Приложение) .

Изменение энтальпии, ∆H_а, и энтропии, ∆S_а, в области термической аномалии оценили суммированием значений в каждой экспериментальной точке за вычетом гипотетической невозмущенной части теплоемкости (табл. 3).

Для объяснения наблюдаемой температурной аномалии был проведен рентгеноструктурный анализ образца при температурах 113, 173, 223, 265, 273 и 281 К. Аспарагин кристаллизуется в ромбической хиральной пространственной группе P2₁2₁2₁ в виде моногидрата. Пространственная группа и число молекул в ячейке при всех температурах остаются неизменными и совпадают с литературными данными [25]. Анализ параметров элементарной ячейки однозначно показывает, что параметр а остается фактически неизменным, а параметры b и c монотонно растут с температурой без значительных отклонений от линейной зависимости и аномалий (рис. П-2). Аналогично и объем элементарной ячейки для кристалла изменяется по закону, близкому к линейному. Таким образом, исходя из макроскопических параметров мы можем однозначно утверждать, что в области 265–281 K стандартной картины для фазовых переходов или потери воды в кристалле моногидрата L-аспарагина не наблюдается.

Поскольку можно было предположить, что наблюдаемая температурная аномалия на кривой теплоемкости связана с переносом протона, мы также проанализировали и детали кристаллической структуры. В кристалле цвиттер-ионная форма аспарагина вовлечена в цепь прочных водородных связей типа N–H···O и O–H···О. При этом самая прочная (N···O 2.788(2) Å) из N–H···О связей (N(1)–H(1NB)···О(3) направлена вдоль кристаллографической оси а, которая остается фактически неизменной с ростом температуры (рис. П-3). Исходя из анализа длин связей в молекуле, а также учитывая, что атомы водорода были локализованы в разностных синтезах электронной плотности, мы можем однозначно утверждать, что в кристалле не наблюдается переноса протона. Во всем диапазоне температур сохраняется одинаковая таутомерная форма и одинаковая система водородных связей. Более того, мы не видим никакого разупорядочения как для молекулы, так и сольватной молекулы воды. Параметры атомных смещений в кристалле монотонно увеличиваются с ростом температуры без аномалий, характерных для динамической разупорядоченности.

Таким образом, мы можем однозначно утверждать, что с точки зрения, как макроскопических параметров, так параметров, описывающих супрамолекулярную организацию и тепловое движение нет никаких указаний на реализацию в области температур 265–281 K структурных фазовых переходов или потери воды.

Термодинамические функции. Для расчета термодинамических функций полученные экспериментальные значения теплоемкости L-Asn⋅H₂O аппроксимировали степенными полиномами вида:

где ${{A}_{k}}$ и ${{B}_{k}}$ – нормирующие коэффициенты, i – степень полинома, A_i – коэффициенты, вычисленные методом МНК. Среднеквадратичные отклонения (СКО) экспериментальных значений теплоемкости от вычисленных по аппроксимирующим уравнениям (1), лежат в пределах погрешности эксперимента (табл. 4).

Экстраполяцию ${{C}_{{p,m}}}$ к 0 K проводили с помощью уравнения:

используя функцию Дебая теплоемкости, D, и подгоночные параметры α и β. Значения α и β вычислены методом наименьших квадратов (МНК) в интервале температур 8.63–10.36 K, α = 20.0000, β = 273.9540. СКО экспериментальных значений теплоемкости от рассчитанных по уравнению (2) составляет 0.0122 Дж K^–1 моль^–1 (2.18%).

Интегрированием аппроксимирующих уравнений (1) и (2) рассчитаны сглаженные основные термодинамические функции в области температур 5–350 K (табл. 5).

Погрешности сглаженных функций составляют ~0.5% (для энтальпии), ~0.6–0.8% (для энтропии, ~1.5% (для свободной энергии Гиббса).

Сравнение термодинамических функций, полученных в настоящей работе с имеющимися в литературе приведены в табл. 6.

На основе абсолютных энтропий L-Asn⋅H₂O, $S_{{\text{m}}}^{^\circ }$(T) (табл. 6) и C_{(графит)}, N_2(г), H_2(г), О_2(г) [26] рассчитана абсолютная энтропия образования L‑Asn⋅H₂O, ${{\Delta }_{{\text{f}}}}S_{{298{\text{(кр}}{\text{.)}}}}^{^\circ }$, (табл. 7) согласно реакции:

Свободная энергия Гиббса образования L‑Asn⋅H₂O в конденсированном состоянии, ${{\Delta }_{{\text{f}}}}G_{{298{\text{(кр}}{\text{.)}}}}^{^\circ }$, рассчитана с использованием значений энтропии образования, ${{\Delta }_{{\text{f}}}}S_{{298{\text{(кр}}{\text{.)}}}}^{^\circ }$, полученной в этой работе, и литературных данных по энтальпии образования, ${{\Delta }_{{\text{f}}}}H_{{298{\text{(кр}}{\text{.)}}}}^{^\circ }$.

Поскольку все литературные величины ${{\Delta }_{{\text{f}}}}H_{{298{\text{(кр}}{\text{.)}}}}^{^\circ }$ незначительно различаются между собой (–1084.8 [8], –1086.6 ± 0.84 [27], –1084.1 ± ± 3.0 [20]), для расчета энергии Гиббса образования использовали среднюю величину (‒1085.2 ± ± 3.0 кДж моль^–1). Основные термодинамические функции образования моногидрата L-аспарагина в кристаллическом состоянии при температуре 298.15 К представлены в табл. 7.

Таким образом, в работе проведено комплексное исследование образца моногидрата L-аспарагина чистотой 99.87 мас. % методами дифференциальной сканирующей калориметрии, ретгеноструктурного анализа и вакуумной адиабатической калориметрии. Выполнена оценка термической стабильности вещества, уточнены температуры, энтальпии плавления моногидрата L-аспарагина, измерена низкотемпературная теплоемкость. На кривой теплоемкости в области 265–275 K обнаружена термическая аномалия. Для выяснения ее происхождения проведен рентгеноструктурный анализ образца при нескольких температурах, однако, однозначно определить причину ее возникновения не удалось. На основании литературных и полученных экспериментальных данных рассчитаны основные термодинамические функции и функции образования в конденсированном состоянии при 298 K.

Исследование было выполнено в рамках госбюджетной темы “Химическая термодинамика и материаловедение” (АААА-А16-121031300039-1) и поддержано Национальным проектом “Наука”, Программой развития МГУ и Центром совместного исследовательского оборудования МГУ “Технологии получения новых наноструктурированных материалов и их комплексное изучение”.