Физиология растений, 2019, T. 66, № 1, стр. 58-65

ВВЕДЕНИЕ

Засуха является одним из самых распространенных лимитирующих факторов для выживания растений в природных условиях. В первую очередь она влияет на водный обмен, активность которого может зависеть как от водного потенциала почвы [1, 2], так и от влажности воздуха [1, 3, 4]. Низкий уровень влажности почвы и воздуха в большинстве случаев приводит к уменьшению размеров устьичной щели [5] и снижению таких ключевых показателей водного обмена растений, как проводимость устьиц для воды и транспирация [2, 4]. Помимо типичных изменений этих показателей, в ряде случаев могут наблюдаться “парадоксальные” ответы [3]. В частности, при быстром снижении влажности воздуха у Xanthium strumarium и Vicia faba происходило быстрое (порядка 10 минут) переходное увеличение проводимости устьиц для воды, сменяющееся более медленным снижением и выходом на стационарный уровень [3], однако механизмы подобных ответов остаются невыясненными.

Для эффективной регуляции жизнедеятельности растения используют дальние сигналы различной природы. Такие сигналы возникают в зоне действия неблагоприятных факторов и распространяются в интактные части растительного организма, где индуцируют многообразные физиологические ответы, включая усиление генной экспрессии, продукцию фитогормонов, активацию дыхания, изменения активности транспирации, фотосинтеза и др. [6–8]. Локальные стимулы способны индуцировать у растений генерацию и распространение электрических сигналов, включая вызванный повреждающими воздействиями (ожог, нагрев, раздавливание) уникальный электрический сигнал растений – вариабельный потенциал (ВП) [6, 9, 10]. ВП существенно влияет на физиологическое состояние растений и, в частности, вызывает сложные изменения транспирации интактных листьев [11–18], которые в некоторых случаях могут иметь многофазный характер [13]. Согласно нашим предыдущим результатам [13], такие ответы могут быть связаны с изменениями активности Н⁺-АТФазы плазматической мембраны в ходе генерации ВП; с другой стороны, определенный вклад в изменения транспирации могут вносить и вызванные локальными повреждениями гидропассивные изменения открытости устьиц [14].

Итоговой функцией электрических сигналов, по-видимому, является повышение устойчивости фотосинтетического аппарата [19–21] и растения в целом [13, 22] к неблагоприятным абиотическим факторам, в первую очередь, к высоким и низким температурам. Механизмы такого повышения имеют комплексный характер [20]: в случае увеличения теплоустойчивости они включают в себя (i) повышение устойчивости фотосистемы I, которое связано с ВП-индуцированным снижением поглощения CO₂ в ходе темновой стадии фотосинтеза [19], и (ii) стимуляцию теплового повреждения фотосистемы II, обусловленного ВП-индуцированным снижением транспирации во время действия повышенной температуры и усилением нагрева листа [13]. Следует отметить, что стимуляция повреждения фотосистемы II также может иметь защитный характер, поскольку способствует снижению теплового повреждения фотосистемы I путем уменьшения на нее потока электронов [20, 21]. Кроме того, вызванное ВП снижение транспирации при нагреве, возможно, приводит к увеличению теплоустойчивости растения в целом вследствие уменьшения потерь воды растительным организмом [14].

Положительное влияние на теплоустойчивость растения может потенциально оказывать как усиление транспирации, которое приводит к снижению нагрева листа, так и ее уменьшение, способствующее снижению потери воды растением и замедляющее потерю тургора. С этой точки зрения логично ожидать, что в условиях низкой влажности воздуха и высокого уровня транспирации ключевую роль для выживания при повышении температуры играет снижение водной потери, т.е. закрытие устьиц; и наоборот, в условиях высокой влажности и относительно низкого исходного уровня транспирации возрастание водопотери при повышении температуры будет не столь велико, а значит, более важным окажется снижение температуры листа, т.е. открытие устьиц. На основании этого весьма вероятной представляется зависимость направленности вызванных ВП изменений транспирации от влажности воздуха.

У травянистых растений при высокой влажности воздуха (75% и более) после локального ожога и распространения ВП происходит лишь усиление транспирации интактных листьев [10]. В условиях умеренной влажности воздуха (более 50, но менее 75%) после ожога наблюдается преимущественно сложная реакция, включающая как активацию транспирации, так и снижение ее активности [13, 23, 24]. В условиях низкой влажности воздуха (50% и ниже) в интактных листьях после распространения ВП могут наблюдаться либо такие же сложные изменения транспирации (активация, затем снижение) [15, 16], либо только снижение [12, 17, 18]. Вопрос о механизмах этих изменений остается в настоящее время нерешенным. В первую очередь, среди возможных механизмов снижения транспирации под влиянием ВП следует отметить инактивацию H⁺-АТФазы плазматической мембраны, которая играет ключевую роль в развитии ВП [25]. Известно, что активность H⁺-АТФазы прямо связана с открытостью устьиц [26], а роль ВП-индуцированного снижения ее активности в уменьшении транспирации подтверждается результатами ингибиторного анализа [13]. В свою очередь, вероятным следствием такой инактивации является активация потенциал-зависимых outward калиевых каналов плазматической мембраны и выход ионов калия [25]. Согласно литературным данным [27], активация калиевых каналов и выход калия сопровождаются потерей тургора замыкающими клетками устьиц, что также может приводить к их закрытию. В качестве вероятного механизма индуцированной ВП активации транспирации рассматривают гидропассивное открытие устьиц [10, 16], обусловленное потерей тургора у окружающих устьица эпидермальных клеток; при этом такая потеря тургора также может быть связана со снижением активности H⁺-АТФазы и активацией калиевых каналов. Таким образом, данные литературы показывают, что вызванные ВП изменения транспирации могут зависеть от влажности воздуха, окружающего лист. Нельзя исключать также, что различия в вызванных ВП транспирационных ответах приведут к различиям в ответах фотосинтетической ассимиляции СО₂, так как именно через устьица преимущественно осуществляется поступление углекислого газа в лист.

Цель работы – исследование влияния локальных ожогов и связанных с ними ВП на транспирацию и фотосинтез листьев гороха посевного в условиях различной влажности воздуха.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования были использованы 2–3-недельные растения гороха посевного (Pisum sativum L.) сорта “Альбумен”. Растения культивировали гидропонным способом на 50% среде Хоглэнда–Арнона в климатической камере Binder KBW 240 (Германия) при 16-часовом световом периоде и температуре 24°С.

Электрические сигналы регистрировали с помощью стандартной электрофизиологической установки, включающей Ag/AgCl макроэлектроды ЭВЛ-1М3 (Гомельский завод измерительных приборов, Беларусь), высокоомный усилитель ИПЛ-113 (“СЕМИКО”, Россия) и персональный компьютер. Электрический сигнал индуцировали классическим повреждающим раздражением – ожогом открытым пламенем [13] кончика первого зрелого листа растения (1 см²) в течение 3 с (рис. 1). Время адаптации растения до нанесения раздражения составляло не менее 1.5 часов. Измерительные электроды располагались на стебле рядом со вторым зрелым листом растения (Э_ст) и на исследуемом втором листе (Э_л) на расстоянии 5–7 см от зоны локального раздражения; электрод сравнения (Э_ср) находился в растворе, омывающем корни. Контакт измерительных электродов осуществлялся с помощью электропроводящего геля “Униагель” (“Гельтек-Медика”, Россия).

Рис. 1.

Схема нанесения ожога, расположения электродов и зоны регистрации фотосинтетической ассимиляции СО₂ и транспирации у проростка гороха посевного. Э_ст, Э_л – измерительные электроды, расположенные на стебле и листе, Э_ср – электрод сравнения.

Параметры газообмена и водного обмена растения регистрировались с помощью системы, включающей инфракрасный газоанализатоp GFS-3000 и измерительную головку Dual-PAM gas-exchange Cuvette 3010-Dual (“Heinz Walz GmbH”, Геpмания). Данный комплекс позволял осуществлять измерение параметров ассимиляции и транспирации на участке нестимулируемого листа гороха (1.3 cм²). Исследования проводились в условиях освещения листа (актиничный свет 460 нм, интенсивность 239 мкмоль/(м² с)), которое обеспечивалось РАМ-флуориметром Dual-PAM-100, также подключенным к измерительной головке системы. В кювете с исследуемым листом растения поддерживалась постоянная температура (23°С) и концентрация СО₂ (360 ppm).

Влажность в кювете регистрировалась с помощью газоанализатора и варьировала в пределах 13 000–25 000 ppm. Для оценки особенностей ответов газообмена и водного обмена при разных концентрациях Н₂О в воздухе растения были объединены в группы, охватывающие два диапазона влажностей: умеренную (от 13 000 до 19 000 ppm, 45–67%) и высокую (от 19 000 до 25 000 ppm, 67–89%). В условиях умеренной и высокой влажности окружающего лист воздуха, анализ средних начальных уровней транспирации (рис. 2а) и фотосинтетической ассимиляции СО₂ (рис. 2б) показал лишь тенденцию к снижению транспирации при высокой влажности; отличий начального уровня ассимиляции при различной влажности зарегистрировано не было.

Рис. 2.

Средние начальные уровни транспирации (а) и фотосинтетической ассимиляции СО₂ (б) листьев гороха посевного в условиях умеренной (13 000–19 000 ppm, n = 10) и высокой (19 000–25 000 ppm, n = 11) влажности, окружающего лист воздуха.

Биологическая повторность экспериментов составляла не менее 10 (n). В работе представлены примеры записей, средние значения и их стандартные отклонения, а также значения коэффициентов линейной корреляции между вызванными вариабельными потенциалами изменений транспирации и ассимиляции СО₂ на различных фазах развития ответов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

На первом этапе исследования было показано, что локальный ожог листа гороха приводит к генерации и распространению по растению электрического сигнала в виде вариабельного потенциала (рис. 3а). Амплитуда электрической реакции, развивающейся в нераздраженном листе растения на расстоянии 7–10 см от зоны повреждения, составляла 52 ± 5 мВ. После ожога и распространения ВП в исследуемой зоне возникали также изменения активности транспирации и ассимиляции СО₂ (рис. 3б). Изменения транспирации и ассимиляции имели 3-фазный характер (быстрое снижение Е₀-Е₁, медленное возрастание Е₁-Е₂, длительное снижение Е₂-Е₃). В случае ассимиляции СО₂ наблюдалось ее выраженное снижение А₀-А₁, затем повышение до уровня А₂ и снижение к А₃. Отметим, что длительность первых двух фаз составляла в среднем около 6–7 мин, а через 15–30 мин начиналась вторая фаза снижения ассимиляции.

Рис. 3.

Примеры вызванного локальным ожогом вариабельного потенциала во втором зрелом листе гороха посевного – серая линия и в стебле у основания этого листа – черная линия (а), и изменений фотосинтетической ассимиляции СО₂ (А – серая линия) и транспирации (Е – черная линия) при абсолютной влажности около 19000 ppm (66% относительной влажности) (б). Стрелкой обозначен момент ожога первого зрелого листа. А и Е с индексами обозначают нулевой уровень и последующие экстремумы кривых ассимиляции и транспирации, соответственно.

На следующем этапе был проведен анализ влияния влажности воздуха на вызванные ВП транспирационные и фотосинтетические ответы. Было показано, что ответы транспирации существенно зависели от влажности окружающего лист воздуха. Так, при умеренной влажности происходило сильное снижение транспирации с уровня Е₀ до Е₁, затем ее небольшое возрастание до Е₂, которое сменялось еще более выраженным медленным снижением до уровня Е₃ (рис. 4а). При высокой влажности воздуха наблюдалась иная картина: незначительное снижение транспирации с Е₀ до Е₁ сменялось существенным повышением до уровня Е₂, на завершающем этапе реакции происходило снижение транспирации до уровня Е₃, который был лишь немного ниже начального Е₀ (рис. 4б). В случае ассимиляции явные различия между вызванной ВП быстрой инактивацией фотосинтеза при разной влажности отсутствовали, однако длительное снижение ассимиляции СО₂ было намного более выраженным при умеренной влажности воздуха (рис. 4).

Рис. 4.

Примеры вызванных локальным ожогом и связанным с ним вариабельным потенциалом изменений фотосинтетической ассимиляции СО₂ (А – серая линия) и транспирации (Е – черная линия) листьев гороха посевного при абсолютной влажности 16 000 ppm (а) и 20 000 ppm (б). Стрелкой обозначен момент ожога первого зрелого листа. А и Е с индексами обозначают нулевой уровень и последующие экстремумы кривых ассимиляции и транспирации, соответственно. В качестве умеренной принималась влажность в диапазоне от 13 000 до 19 000 ppm (n = 10), в качестве высокой – от 19 000 до 25 000 ppm (n = 11).

Анализ средних значений изменения транспирации при ВП показал, что при умеренной влажности значения таких показателей, как Е₁-Е₀ и Е₃-Е₀ были достоверно выше, чем при высокой влажности (таблица). Также при высокой влажности наблюдалось возрастание ответа параметра Е₂-Е₀ по сравнению с нулевым уровнем, т.е. ВП в этих условиях и в этом временном диапазоне вызывал активацию транспирации по сравнению с начальным уровнем. Важно также отметить, что влажность воздуха практически не влияла на величину возрастания от Е₁ к Е₂. Последнее позволяет предположить, что возрастание транспирации от Е₁ к Е₂ представляет собой не просто снижение подавления транспирации, а именно ее активацию, которая имеет свои собственные механизмы. Анализ средних значений изменения ассимиляции СО₂ при ВП показал достоверно большие величины параметров А₂-А₀ и А₃-А₀ при умеренной влажности воздуха. Для разности экстремумов А₁-А₀ наблюдалась лишь слабая тенденция к снижению при высокой влажности воздуха. Как и в случае транспирационных ответов, влажность воздуха не влияла на изменения А₂-А₁ (таблица 1).

Проведение корреляционного анализа между вызванными вариабельным потенциалом изменениями транспирации и ассимиляции СО₂ на различных фазах развития ответов показало умеренную достоверную корреляцию между А₂-А₀ и Е₂-Е₀ (R = 0.53) и высокую достоверную корреляцию между А₃-А₀ и Е₃-Е₀ (R = 0.81) (рис. 5). Такой результат показывает, что изменения устьичной проводимости, вероятно, лежащие в основе вызванных ВП изменений транспирации, слабо влияют на быструю компоненту фотосинтетического ответа, однако могут вносить существенный вклад в длительное ингибирование фотосинтеза.

Рис. 5.

Величины коэффициентов линейной корреляции (R) между вызванными вариабельными потенциалами изменениями транспирации и ассимиляции СО₂ листьев гороха посевного на различных фазах развития ответов. Белым цветом обозначена корреляция фаз А₁-А₀ и Е₁-Е₀ (◻), светло-серым цветом – корреляция А₂-А₀ и Е₂-Е₀ (◼), темно-серым – А₃-А₀ и Е₃-Е₀ (◼), черным – А₂-А₁ и Е₂-Е₁ (◼). Коэффициенты корреляции рассчитаны по всему исследованному диапазону влажностей (n = 21). * – коэффициент корреляции является статистически значимым (p < 0.05).

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты свидетельствуют о наличии связи индуцированных вариабельным потенциалом изменений транспирации с уровнем влажности воздуха, что согласуется с обобщенными литературными данными, представленными во Введении [10, 12, 13, 15–18, 23, 24]. Интерпретация полученных результатов требует обращения к механизму генерации вариабельного потенциала в клетках высших растений [9, 25]. Генерация ВП связана со входом в клетку ионов Ca²⁺, увеличение концентрации которого вызывает активацию анионных каналов и инактивацию протонной АТФазы, что ведет к развитию деполяризации. Формирование реполяризации вызвано выходом из клетки ионов K⁺ и реактивацией протонного насоса [25]. Как было отмечено выше, в целом можно выделить следующие стадии индуцированного ВП транспирационного ответа: кратковременная инактивация, переходная активация и длительная инактивация. Выраженность каждой из стадий ответа потенциально может варьировать при различной влажности воздуха, что обуславливает различия в итоговой (суммарной) динамике транспирации.

Известно, что закрытие устьиц обусловлено инактивацией K⁺_inward-каналов, активацией K⁺_outward-каналов, а также анионных каналов и снижением активности Н⁺-АТФазы [25, 26], что приводит к уменьшению концентрации осмотически активных ионов и падению тургора. Генерация ВП связана с инактивацией H⁺-АТФазы плазматической мембраны, которая приводит к активации ионных каналов и возникновению масштабных потоков K⁺ и Cl^- из клетки [25]. На основании этого можно предполагать ключевую роль снижения активности H⁺-АТФазы и последующей активации ионных каналов в развитии кратковременной инактивации транспирации. Проведенный ранее ингибиторный анализ [13], который показал ключевую роль инактивации H⁺-АТФазы в развитии изменений транспирации при ВП, подтверждает это предположение. Дополнительным аргументом в пользу приведенного механизма является также близкое время (первые 3–5 минут после нанесения локального ожога) развития кратковременной инактивации транспирации и быстрой начальной деполяризации в ходе ВП, которая в значительной степени связана с активацией ионных каналов [25].

Аналогичные ионные механизмы могут обуславливать и длительную инактивацию транспирации; в то же время такая инактивация может быть связана не только непосредственно с распространением ВП, но и с вызванным вариабельным потенциалом длительным повышением содержания стрессовых фитогормонов (прежде всего, абсцизовой кислоты) [8], которые регулируют активность анионных и калиевых каналов, а также Н⁺-АТФазы, снижая тем самым устьичную проводимость [28]. Литературные данные [17, 18] подтверждают это предположение, показывая, что ВП увеличивает содержание абсцизовой кислоты в растении, при этом снижение ассимиляции СО₂ и транспирации после вариабельного потенциала на длительных временных интервалах (десятки минут) связано, по-видимому, с таким повышением.

Можно предположить, что сходные изменения ионного транспорта и снижение тургора, происходящие не в устьичных, а в эпидермальных клетках, также обеспечивают активацию транспирации, имеющую место после кратковременной инактивации. Известно, что активация транспирации может быть вызвана снижением тургора в соседних с замыкающими эпидермальных клетках – так называемый эффект Иванова [27]. Такое снижение тургора эпидермальных клеток может быть также связано с распространением вариабельного потенциала и возникновением трансмембранных ионных потоков. Различия в динамике изменения тургора устьичных и эпидермальных клеток могут обуславливать наблюдаемые многофазные изменения транспирации, развивающиеся после локального повреждения. В свою очередь, тип транспирационного ответа при отличающейся влажности воздуха может зависеть от различного влияния содержания воды в воздухе на вызванные ВП ответы замыкающих клеток устьиц и клеток эпидермиса; однако механизмы такого влияния требуют будущих исследований. Изменение активности ассимиляции, как показано выше, также проявляет зависимость от уровня влажности воздуха, при этом увеличение влажности ведет к понижению ответа ассимиляции CO₂. Наличие такой зависимости может объясняться существованием двух путей регуляции интенсивности ассимиляции. Первый из них связан с возрастанием внеклеточного pH, имеющего место при генерации ВП, приводящее к снижению поступления СО₂ в клетку и уменьшению активности темновой стадии фотосинтеза [8]. Определенный вклад в спад ассимиляции СО₂ может вносить и понижение внутриклеточного рН, которое приводит к закислению стромы хлоропластов [20], тем самым, вероятно, снижая активность ферментов цикла Кальвина.

Другим путем ВП-индуцированного уменьшения поступления CO₂ в клетки мезофилла является, по-видимому, снижение устьичной проводимости; вероятно, именно этот путь в значительной степени отвечает за длительную инактивацию фотосинтеза (десятки минут), так как на этом временном интервале между изменениями транспирации и ассимиляции СО₂ наблюдается высокая корреляция. При этом, если первый из отмеченных механизмов ведет к снижению интенсивности ассимиляции независимо от влажности воздуха, то изменение устьичной проводимости, как было отмечено выше, может иметь различную направленность, соответственно внося вклад в активацию или инактивацию ассимиляции. Однако, в отличие от транспирации, ответы ассимиляции изменяются только по амплитуде, сохраняя свою направленность (снижение активности) (рис. 5). Это может говорить о том, что первый из указанных механизмов вносит больший вклад в регуляцию ассимиляции при распространении ВП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ранее нами было показано, что распространяющиеся вариабельные потенциалы [13, 19, 21] участвуют в повышении теплоустойчивости фотосинтетического аппарата и растения в целом, т.е. являются одним из механизмов адаптации растения к действию температурного фактора [8]. Обнаруженная в настоящей работе зависимость параметров вызванного ВП функционального ответа от влажности может быть значимой для “выбора стратегии” такой адаптации в условиях комбинированного действия повышенной температуры и различного уровня влажности. В частности, в условиях повышенной влажности фактор потери влаги для растения не столь критичен, в связи с чем целесообразным является снижение температуры путем повышения транспирации. В условиях умеренной и низкой влажности определяющим для выживания будет снижение транспирации для обеспечения приемлемого для жизни уровня содержания воды.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Государственное задание № 6.3199.2017/4.6) и Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 16-34-00972 мол_а).