Физиология растений, 2019, T. 66, № 1, стр. 46-57

ВВЕДЕНИЕ

Картирование локусов количественных признаков (QTL, quantitative trait loci) на сегодняшний день стало одним из основных подходов, активно используемых для установления физиолого-генетического взаимодействия “генотип – среда”. Наследуемость, являющаяся частью общей фенотипической изменчивости, обусловленной генетическими различиями, используется в этом подходе для определения того, может ли признак применяться для картирования детерминирующих его генов или локусов хромосом. При этом, если исследователи имеют дело со сложными или количественными признаками, они учитывают тот факт, что несколько локусов могут определять один признак. Первоначальные попытки локализовать QTL основных агрономических свойств позволили установить, что позиции QTL не оставались стабильными от одного эксперимента или выявленного локуса к другому, что указывало на значительный эффект воздействия окружающей среды на проявление признака. В этой связи влияние физиологических компонентов (стрессоров) на генотип играет основную роль при возникновении подобного рода изменчивости [1].

Ранее в ряде работ было описано картирование QTL в полевых, полуконтролируемых и в строго контролируемых (агроэкобиополигон) условиях выращивания растений [2, 3], что позволило показать степень воздействия окружающей среды на физиолого-генетическую реализацию того или иного признака и вычленить лимитирующую направленность действия отдельных ее составляющих. Следует отметить, что агроэкобиополигон, помимо оснащения системами строгого контроля и регуляции микроклимата, а также соответствующим вегетационно-облучательным оборудованием различного типа для круглогодичного интенсивного выращивания растений различной высоты (последнее особенно важно для работы с сельскохозяйственными культурами), позволяет исключить влияние перепадов температуры, неравномерного выпадения осадков и варьирования влажности почвы на локализацию QTL признаков, связанных с морфофизиологическими особенностями, темпами роста и продуктивностью растений. В таких условиях были осуществлены исследования влияния различных режимов температуры, освещенности и уровней азотного питания при строгом контроле и неизменности остальных параметров выращивания [2, 3]. Кроме того, строго контролируемые условия агроэкобиополигона, в отличие от полевых и полуконтролируемых условий выращивания, позволяют эффективно применять специализированную аппаратуру для дистанционной и контактной диагностики морфофизиологического состояния вегетирующих растений. Количественная оценка хозяйственно ценных признаков, таких как продуктивность, качество урожая и толерантность к действию биотических и абиотических стрессоров, проявление которых обусловлено, прежде всего, реализацией физиологических процессов, является наиболее трудоемкой и технически сложной задачей, поскольку требует испытания во многих условиях среды в течение нескольких сезонов. Обычно результаты подобного рода фенотипирования по целевым показателям регистрируются визуально или вручную, а их получение отнимает много времени и требует существенных материальных затрат.

Современные полуавтоматические методы фенотипирования с повышенной пропускной способностью, такие как неинвазивная визуализация, спектроскопия, анализ фотографических образов и высокопроизводительных вычислений, основаны на получении и обработке изображений объектов исследований. Цветные изображения позволяют оценить биомассу и структуру растений, предоставляют данные о фенологии и состоянии листьев (хлороз, некроз). Изображения, полученные в ближнем инфракрасном диапазоне, предназначены для определения содержания воды в тканях растений и в почве, температуры растительного покрова или листьев растений. Флуоресцентные изображения позволяют оценить физиологическое состояние фотосинтетического аппарата. Все эти современные методы и оборудование для фенотипирования в деталях были описаны и обсуждены ранее в ряде обзоров [4, 5].

Эффективность оценки физиологического статуса растений контактными и дистанционными оптическими методами зависит от их разрешающей способности и возможности в реальном времени не только выявить ухудшение физиологического состояния растений, но и распознать тип стрессора, вызвавшего изменения оптических свойств листьев. При этом следует отметить, что в ответ на действие различных стрессоров (дефицит воды, минерального питания, действие УФ-В радиации и др.) спектральные характеристики радиации, отраженной от поверхности листьев, меняются до появления внешних симптомов угнетения и/или повреждения растений. Уменьшение содержания хлорофилла, накопление антоцианов и флавоноидов, усиление тепловой диссипации и рассеяния радиации внутри тканей листа, а также некоторые другие изменения оптических характеристик листьев являются неспецифической ответной реакцией на стресс, которая свидетельствует об усилении активности процессов “down regulation” фотосистемы II и, как правило, угнетении растений и торможении роста [6]. Вместе с тем проявление различных симптомов угнетения растений в зависимости от типа стрессора может отличаться, т.е. имеют место специфические проявления стрессовой реакции растений в зависимости от типа стрессора [7, 8].

Ранее для разработки и реализации технологий точного земледелия, в частности количественной оценки потребности растений в основных элементах минерального питания (азот, фосфор, калий) и воде, основанных на фенотипировании растений яровой пшеницы, были использованы контактные и дистанционные оптические методы [6, 8, 9]. Было показано, что при действии стрессора, сильно лимитирующего рост, заключение об угнетении растений и ухудшении их физиологического состояния можно сделать, зарегистрировав уменьшение индекса хлорофилла, заранее определенного для каждой культуры и сорта в оптимальных условиях. Сигналом угнетения растений при неглубоком или мало выраженном стрессовом воздействии, а также на ранних этапах возникновения стресса, когда концентрация хлорофилла не меняется или меняется незначительно, служит увеличение отношения каротиноиды/хлорофилл, усиление тепловой диссипации и рассеяния радиации внутри тканей листа, накопление антоцианов и флавонолов, что свидетельствует о снижении эффективности превращения фотосинтетически активной радиации в фотохимических процессах фотосинтеза и угнетении роста растений [8, 9].

Хотя связь различных индексов отражения с характеризующими активность фотосинтетического аппарата другими физиологическими показателями и обсуждается в ряде публикаций, сведений об их использовании для высокоскоростного фенотипирования и выявления перспективных генотипов с желательными хозяйственно ценными признаками имеется очень мало. До настоящего времени было идентифицировано относительно небольшое количество QTL физиологических признаков [10], еще меньше их было использовано в селекции, и ни один не был клонирован. До сих пор не было осуществлено ни одного исследования, в котором проводились бы одновременная оценка оптических показателей активности фотосинтетического аппарата листьев высших растений и выявление генетических детерминант, взаимосвязанных с эффективностью использования азотных удобрений в контролируемых условиях агроэкобиополигона.

Цель работы – идентификация и картирование QTL индексов оптического отражения листовых пластинок для характеристики физиологического состояния растений линий яровой гексаплоидной пшеницы (Triticum aestivum L.), проявляющих себя в контролируемых условиях регулируемой агроэкосистемы биополигона при различных уровнях азотного питания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. В качестве материалов исследований служили рекомбинантные инбредные линии (РИЛ) картирующей популяции ITMI (International Triticeae Mapping Initiative) яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.). Картирующая популяция ITMI была создана путем опыления яровой мягкой пшеницы сорта Opata 85 пыльцой синтетического гексаплоида W7984 [2, 3].

Условия выращивания. Выращивание и оценку рекомбинатных инбредных линий ITMI проводили в условиях регулируемой агроэкосистемы биополигона ФГБНУ “Агрофизический научно-исследовательский институт” (АФИ), как было описано ранее [3]. Изучение 114 линий картирующей популяции ITMI и их родительских форм Opata 85 и синтетического гексаплоида W7984 осуществляли в вегетационных облучательных установках (ВОУ), оснащенных лампами ДНаТ-400. При культивировании растений основные параметры жизнеобеспечения были постоянными. Температурный режим поддерживался на уровне 25–26°C день/20–21°C ночь. Фотопериодический режим включал 16-часовое ежесуточное освещение. Температурный и фотопериодический режимы выращивания растений подбирали по принципу создания условий, нивелирующих различия исследуемых образцов по генетическим системам, определяющим реакцию на данные факторы. Облученность на уровне верхних листьев составляла 50 ± 0.5 Вт/м² ФАР. По мере роста растений облученность ФАР корректировали, изменяя расстояние между светильниками и растениями. Растения выращивали в вегетационных сосудах объемом 2 л. В каждый сосуд высаживали по два растения, из расчета 100 растений на 1 м². Повторность для каждой линии и каждой родительской формы – 2-кратная.

В качестве корнеобитаемой среды использовали дерново-подзолистую легко суглинистую почву с содержанием подвижного фосфора 198 мг/кг (ГОСТ Р 54650-2011), подвижного калия 112 мг/кг (ГОСТ Р 546650-2011), нитратного азота 18.2 мг/кг (ГОСТ 26951-86), аммонийного азота 34.6 мг/кг (ГОСТ 26489-85). В связи с повышенным содержанием в почве подвижного фосфора и калия дополнительного внесения этих макроэлементов не проводили. Опыт включал два варианта, отличающихся по уровню азотного питания. В первом (эксперимент 1, низкий уровень азота) – азотные удобрения во время вегетации растений не вносили, во втором (эксперимент 2, высокий уровень азота) – выполнена 2-кратная подкормка мочевиной (ГОСТ 2081-2010) перед посевом и в фазу онтогенеза “выход в трубку”. Всего в два приема при удобрении вносили 0.321 мг мочевины на 1 кг почвы. На протяжении всего периода вегетации растений влажность почвы поддерживали на оптимальном для пшеницы уровне 70–80% от полной влагоемкости при ежедневном поливе водой. Фенологические наблюдения проводили один раз в двое суток, а во время основных онтогенетических фаз – ежедневно. При завершении вегетационных опытов для каждого индивидуального растения определяли основные показатели продуктивности.

Определение индексов отражения. Спектральные характеристики диффузного отражения листовых пластинок определяли в начале стадии “выход в трубку”. Спектры отраженной от поверхности листьев радиации регистрировали in situ с помощью миниатюрной оптоволоконной спектрорадиометрической системы фирмы “Ocean Optics” (США), которая обеспечивает оптическое разрешение 0.065 нм в диапазоне от 400 до 1100 нм с шагом 0.3 нм. Данная система включает 4 основных элемента: спектрометр HR2000, специальное программное обеспечение SpectraSuite, эталонный вольфрам-галогеновый источник света (LS-1) и оптические аксессуары для проведения измерений. Перед измерениями листьев записывали спектр отражения эталона (WS-1), изготовленного из материала “spectralon”, отражающего более 99% падающей радиации в измеряемом диапазоне длин волн. На экран компьютера выводится спектр диффузного отражения листа в процентах к отражению эталона, который может быть сохранен в виде цифрового файла.

Для регистрации спектров использовали полностью закончившие рост листья, располагая датчик в средней части листовой пластинки, избегая попадания на центральную жилку. В среднем для каждого варианта и каждой линии регистрировали не менее 15 спектров. Записанные спектры в цифровой форме переносили в программу Excel 2007, где рассчитывали средние значения коэффициентов отражения для каждой длины и индексы отражения, характеризующие физиологическое состояние растений. В таблице 1 приведены расчетные формулы индексов отражения [11–13], которые были использованы для оценки физиологического состояния растений.

Для удобства интерпретации полученных данных и получения положительных значений индексов отражения во всех вариантах опыта в расчетные формулы PRI [12] и ARI [13] была введена константная величина С, из которой вычитались значения перечисленных индексов. Получали модифицированные индексы отражения:

Величину С₁–С₂ подбирали экспериментально. В данном опыте С₁ = 0.5, С₂ = 0.7. Описание связи использованных для оценки физиологического состояния растений индексов отражения с нетто продуктивностью и их изменение при действии различных абиотических стрессоров на растения пшеницы [9] и ячменя [6] рассмотрено ранее.

Для определения площади листовой ассимилирующей поверхности (ALAS) с помощью цифровой камеры “Canon G7X” (США) получали фотографии листьев на эталонной пластине белого цвета с известной площадью. По полученным цифровым изображениям в программе Photoshop CS4 Portable определяли долю зеленого листа, экранирующего поверхность эталонной пластины, от площади данной пластины и в дальнейшем переводили полученную величину в см². Измерения были выполнены на стадии “выход в трубку”.

Статистический анализ. Идентификацию и локализацию QTL на группах сцепления выполняли с помощью программы QGENE, как это было описано ранее [3]. Вычисления проводили, используя математическую формулу, предложенную Haldane [14], с пересчетом расстояний и интеграцией данных в существующую базовую карту для популяции ITMI [15, 16]. При этом использовали только те маркеры, которые соответствовали функции картирования по Kosambi [17], учитывающей интерференцию.

Достоверность взаимосвязи между выявленными локусами и полиморфизмом по тому или иному признаку оценивали на основе порогового значения отношения правдоподобия логарифма шансов – LOD оценка (logarithm of odds) [18]. Для каждого признака в каждом эксперименте проводился отдельный QTL-анализ и устанавливались степени варьирования признаков (R²), которые объясняются данным QTL. Значимость каждого LOD была установлена тестом пермутации (1000 повторений). Во внимание принимались только локусы с LOD ≥ 3.0 (p < 0.001), 2 ≤ LOD < 3 (p < 0.01) и 1.5 ≤ LOD < 2 (p < 0.1) [3].

Для определения характера сопряженности между каждым из признаков и внесением азотного удобрения производили расчет коэффициентов корреляции r [19]. Для комплексной оценки сравниваемых средних значений признаков, определявшихся по разным условиям произрастания, применяли однофакторный дисперсионный анализ с расчетом показателей варьирования и статистической значимости полученных результатов (р). Значение p < 0.05 считали приемлемой границей статистической значимости. Результаты, значимые на уровне p < 0.01, рассматривали как статистически значимые, а результаты с уровнем p < 0.001 – как высокозначимые. Все значения рассчитывали с использованием компьютерной программы STATISTICA v.12.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ результатов оценки характеристик фотосинтетического аппарата: площади листовой ассимилирующей поверхности (ALAS), содержания хлорофилла и антоцианов (индексы ChlRI и ARI_mod), отношения суммы каротиноидов к сумме хлорофиллов (SIPI), фотохимической активности (PRI_mod), показателя рассеяния света листом, не зависящего от его структурных особенностей (R₈₀₀), показал их существенное разнообразие у линий популяции ITMI. Например, различия между минимальным и максимальным значениями ALAS, ChlRI, ARI_mod и PRI_mod отличались в 5.3, 2.0, 2.1 и 1.4 раза, соответственно. Достоверные отличия между средними значениями индексов отражения (ChlRI, SIPI, PRI_mod, ARI_mod), площади листовой ассимилирующей поверхности (ALAS) и числа семян, сформированном в колосе у линий популяции ITMI в экспериментах 1 и 2 также отличались существенно (р = 0.000). Отличия в экспериментах 1 и 2 между R₈₀₀ и массой 1000 семян были недостоверными (p > 0.05). В эксперименте 1, когда растения выращивали при более низком уровне азота, чем в эксперименте 2, не выявлено достоверной взаимосвязи между числом семян в колосе главного побега, массой 1000 семян и всеми индексами отражения, которые были использованы в этой работе. Однако обнаружено, что число семян, сформированных в колосе главного побега, и их абсолютная масса тесно связаны с площадью листовой ассимилирующей поверхности, которая была сформирована к началу стадии “выход в трубку” (табл. 2). В эксперименте 2 статистически значимая взаимосвязь между спектральными характеристиками диффузного отражения листовой пластинки, измеренными на стадии “выход в трубку”, и массой 1000 семян также отсутствовала. Однако была обнаружена достоверная корреляционная связь между числом семян, сформированных в колосе главного побега, и признаками активности фотосинтетического аппарата (табл. 2).

В результате проведенных исследований было установлено, что все шесть физиологических показателей отражения листовой пластинки, оцененные в двух одновременно проведенных экспериментах (табл. 3), проявляли нестабильность локализации на группах сцепления при идентификации QTL, определяющих их проявление. Так, например, индекс отражения хлорофилла (показатель содержания хлорофилла) в случае эксперимента без внесения азотного удобрения определялся QTL, идентифицированными на хромосомах 6А и 2А. При этом процент фенотипической изменчивости, определяемый выявленными QTL, составлял 21.89 и 8.52, соответственно. В случае же эксперимента с внесением азотного удобрения QTL были идентифицированы на хромосомах 3А и 2В. Процент фенотипической изменчивости при этом составил 12.07 и 14.88, соответственно. Обращает на себя внимание тот факт, что больший процент фенотипической изменчивости во втором эксперименте был выявлен у QTL с меньшим показателем LOD оценки, хотя в обоих экспериментах все аллели идентифицированных QTL были привнесены материнской формой.

Независимый от структуры листа индекс пигментов, характеризующий отношение суммы каротиноидов к сумме хлорофиллов, при идентификации определяющих его QTL в случае эксперимента без внесения азотного удобрения позволил выявить три локуса хромосом, расположенных на 6А, 4D и 5D, отвечающих за проявление этого физиологического признака. Процент фенотипической изменчивости при этом составил 20.21, 16.45 и 23.38, соответственно. В эксперименте с внесением азотного удобрения данный показатель определялся QTL, расположенными на 4D, 3А, 1А и 5D группах сцепления. Процент фенотипической изменчивости при этом составил 22.65, 22.09, 23.94 и 10.29, соответственно. Во всех случаях в обоих экспериментах аллели, выявленных QTL, были привнесены отцовской формой. Характерно то, что данный показатель определялся QTL, выявленными в обоих экспериментах на хромосомах 4D и 5D. Но если для группы сцепления 5D это был один и тот же локус, то для 4D выявленные локусы располагались на разных участках данной группы сцепления.

QTL индекса фотохимической активности фотосинтетического аппарата в случае эксперимента без внесения азотного удобрения также располагался на хромосоме 5D, а в случае эксперимента с внесением азотного удобрения – на хромосоме 3А. Процент фенотипической изменчивости для QTL на хромосоме 5D составил 24.26, а на хромосоме 3А – 10.61. Следует отметить, что QTL на хромосоме 5D был выявлен в том же локусе, что и один из QTL независимого от структуры листа индекса пигментов, характеризующий отношение суммы каротиноидов к сумме хлорофиллов, установленный в эксперименте без внесения азотного удобрения. QTL на хромосоме 3А локализован недалеко от QTL, выявленных на хромосоме 3А для показателя индекса отражения хлорофилла и независимого от структуры листа индекса пигментов, характеризующего отношение суммы каротиноидов к сумме хлорофиллов. Вероятно, эти три QTL составляют единый блок на хромосоме 3А, отвечающий за фотосинтетическую активность.

Для индекса отражения, характеризующего содержание антоцианов в листе, в случае эксперимента без внесения азотного удобрения было выявлено два QTL – по одному на группах сцепления 4D и 1B, а в случае эксперимента с внесением азотного удобрения – на группах сцепления 3A и 4B. Процент фенотипической изменчивости при этом составил 23.60 и 11.81, а также 10.04 и 9.10, соответственно. Характерно, что QTL на хромосоме 4D по своей локализации совпадал с QTL, выявленным на той же группе сцепления для независимого от структуры листа индекса пигментов, характеризующего отношение суммы каротиноидов к сумме хлорофиллов, а для QTL на 3А – для индекса фотохимической активности фотосинтетического аппарата.

QTL показателя интенсивности рассеяния света листом, зависящего от структуры листа, в случае эксперимента без внесения азотного удобрения были выявлены на группе сцепления 2А. Процент фенотипической изменчивости при этом составил 21.24. А в случае эксперимента с внесением азотного удобрения QTL были установлены на хромосоме 7В. Процент фенотипической изменчивости составил 22.81. Аллель QTL в первом эксперименте был привнесен материнской формой, а во втором – отцовской.

Показатель площади ассимилирующей листовой поверхности в случае эксперимента без внесения азотного удобрения определялся QTL, локализованными на хромосомах 4D и 2В, а в случае эксперимента с внесением азотного удобрения – на 5А и также 2В. Процент фенотипической изменчивости составил 17.79, 15.51, 25.40 и 9.27, соответственно. Следует заметить, что аллели QTL, идентифицированные на хромосомах 5А и 2В, были привнесены материнской формой, а на хромосоме 4D – отцовской.

Проведенный корреляционный анализ позволил установить, что внесение азотного удобрения значимо влияет на проявление пяти из шести исследованных оптических характеристик активности фотосинтетического аппарата яровой мягкой пшеницы в контролируемых условиях агроэкобиополигона (табл. 4). Исключение составляет R₈₀₀ – показатель интенсивности рассеяния света листом, коэффициент корреляции которого с дозой азота в почве (r = 0.18) выходит за границу статистической значимости (p ≥ 0.05), свидетельствуя о недостоверном влиянии различий в режимах азотного питания в экспериментах 1 и 2 на данный показатель. Поскольку при подсчете корреляционной зависимости данные были расположены в следующем порядке: без азота, с азотом, то если коэффициент корреляции положительный, то это означает, что средние значения признака в опыте с азотом выше, чем без азота. В случае с отрицательной корреляцией – наоборот (табл. 4). Для признаков индекс отражения хлорофилла (ChlRI), индекс отражения, характеризующий содержание антоцианов в листе (ARI_mod), и площадь ассимилирующей листовой поверхности (ALAS) коэффициенты корреляции были средними положительными (0.47, 0.29 и 0.56, соответственно). Для несвязанных со структурой листа признаков SIPI (индекс отношения суммы каротиноидов к сумме хлорофиллов) и PRI_mod (индекс фотохимической активности фотосинтетического аппарата) – средними отрицательными (–0.38 и ‒0.45, соответственно). Полученные результаты корреляционного анализа практически совпадают с результатами QTL анализа. Исключение составляет R₈₀₀ – изменение этого признака в зависимости от уровня азотного питания не является достоверным по результатам корреляционного анализа. В целом, результаты корреляционного и QTL анализов подтверждают друг друга, что указывает на достоверность эффектов влияния внесения азотного удобрения на проявление изучаемых показателей отражения листовой пластинки у яровой мягкой пшеницы в строго контролируемых условиях агроэкополигона.

ОБСУЖДЕНИЕ

Качественные и количественные изменения физиолого-биохимического внутриклеточного состава и внутренней морфофизиологической структуры листьев в неблагоприятных условиях среды, а также при адаптации растений к условиям произрастания сопровождаются изменением их оптических характеристик. Направленность и степень таких изменений характеризуют физиолого-генетическую устойчивость растений и позволяют изучить механизм ответной реакции на действие стрессора. Регистрация оптических характеристик, в данном случае спектров диффузного отражения листовых пластинок, не требует разрушения тканей листа и может быть выполнена как контактно, так и дистанционно.

В данной работе впервые предпринята попытка оценки влияния внесения азотного удобрения на проявление физиологических индексов отражения листовой пластинки у яровой гексаплоидной пшеницы. В условиях агробиополигона на примере 114 рекомбинантных инбредных линий пшеницы картирующей популяции ITMI in situ с помощью неразрушающих ткани листьев оптических контактных и дистанционных методов получены экспериментальные данные об изменчивости признаков, связанных с интенсивностью работы фотосинтетического аппарата: площади листовой ассимилирующей поверхности, индексов хлорофилла и антоцианов, отношения суммы каротиноидов к сумме хлорофиллов, фотохимической активности, рассеяния света, обусловленного структурными особенностями тканей листа, и признаками семенной продуктивности растений (число семян в колосе и масса 1000 семян). Показано существенное варьирование всех изучаемых признаков в пределах популяции исследуемых линий пшеницы. Отличительной чертой осуществленных экспериментов было то, что они проводились одновременно в строго контролируемых условиях агроэкобиополигона, что позволило исключить влияние каких-либо неконтролируемых факторов внешнего воздействия, например, неравномерности солнечного освещения, выпадения осадков, перепада температуры и ряда других, непосредственно влияющих на проявление изучаемых нами показателей.

Растения пшеницы линий картирующей популяции ITMI существенно отличались как по продуктивности, так и по оптическим характеристикам листьев и площади листовой ассимилирующей поверхности. Обнаружена статистически достоверная (p < 0.05) корреляционная связь между числом семян в колосе главного побега и измеряемыми контактно или дистанционно характеристиками листьев. Коэффициенты корреляции между показателями 0.31–0.51 (табл. 2) свидетельствуют о средней степени связи между ними. Следует учитывать, что измерения оптических характеристик листьев и площади листовой ассимилирующей поверхности были выполнены в начале стадии “выход в трубку” сразу по завершении стадии “кущение”, число зерен в конце вегетации после завершения налива зерна (продолжительность периода “выход в трубку – созревание” у линий популяции ITMI в эксперименте 1 варьировала от 30 до 56 дней). Можно сделать вывод, что применение неинвазивных оптических методов на ранних этапах онтогенеза позволяет сделать предварительный прогноз продуктивности без уничтожения или повреждения растений. Чтобы увеличить точность прогноза продуктивности, по-видимому, необходимо выполнить измерения также и в более поздние сроки вегетации, например, на стадии колошения растений.

Ранее мы установили, что возникновение окислительного стресса под влиянием различных неблагоприятных факторов внешней среды, сопровождающееся снижением эффективности фотохимических процессов фотосинтеза и, как следствие, торможением роста, может быть обнаружено до появления внешних симптомов угнетения растений по изменению ряда индексов отражения (хлорофилла, каротиноидов, антоцианов, флавоноидов) и других оптических показателей, характеризующих активность процессов “down regulation” фотосистемы II [6, 9]. Данные изменения регулируют спектральный состав, количество проникающей в лист солнечной радиации и эффективность фотохимических процессов фотосинтеза, запуская процесс адаптации растений к изменившимся условиям среды обитания. Дефицит минерального питания сопровождается увеличением количества отраженной от листьев радиации, наиболее заметным в зеленом и ближнем ИК диапазоне.

Основной симптом азотного голодания растений известен очень хорошо. Это хлороз листьев, в первую очередь нижних ярусов, обусловленный потерей хлорофилла. При проведении данного исследования регистрировали спектры отраженной радиации у полностью закончивших рост листьев верхних ярусов, сформированных к началу стадии “выход в трубку”, и, тем не менее, при более низком уровне азотного питания ChlRI был достоверно меньшим, о чем свидетельствует также наличие положительной корреляционной зависимости между ChlRI и уровнем азотного питания (табл. 4). Индекс, использованный в этой работе, разработанный и апробированный при определении содержания хлорофилла у растений различных видов, отличающихся структурными особенностями листьев [11], не требует утомительной калибровки для каждого вида и в настоящее время широко применяется в качестве критерия содержания хлорофилла как при контактной, так и дистанционной диагностике состояния растений и посевов, в особенности для раннего выявления дефицита азота, с целью принятия решений о необходимости внесения удобрений [20].

Как и следовало ожидать, низкий уровень азотного питания стал причиной существенной потери урожая зерна, главным образом из-за формирования меньшего числа зерен в колосе. Мы наблюдали наличие высоко статистически значимой связи между интенсивностью фотосинтетического аппарата, сформированного к началу стадии “выход в трубку”, которую оценивали по величине площади сформированный ассимилирующей поверхности листьев и содержанием в них хлорофилла, и числом семян в колосе главного побега (табл. 2). В отличие от этого, статистически значимой взаимосвязи между массой 1000 семян и оптическими характеристиками листьев, измеренными на стадии “выход в трубку”, в экспериментах 1 и 2 не обнаружено.

Помимо хлорофиллов к универсальным и основным пигментам ассимиляционных тканей относятся каротиноиды, которые так же, как хлорофилл, поставляют энергию фотосинтетической системе, являясь неотъемлемой частью светособирающих комплексов пластид. Перекрывание спектров поглощения каротиноидов и хлорофилла в синей области затрудняет их количественную оценку по спектральным характеристикам отраженной от листа радиации в данном диапазоне. В связи с этим мы пользовались индексом, характеризующим отношение суммы каротиноидов к сумме хлорофиллов – SIPI. Как правило, SIPI при стрессе возрастает вследствие потери хлорофилла и/или накопления каротиноидов [12]. Полученные результаты – уменьшение SIPI при увеличении ChlRI (отрицательный и положительный коэффициенты корреляции с уровнем азотного питания, табл. 4), которое мы наблюдали в эксперименте 2, – не позволяют сделать однозначный вывод об изменении суммы каротиноидов в листьях в ответ на внесение дополнительного азота в почву, поскольку наблюдаемое существенное возрастание концентрации хлорофилла должно неизбежно привести к уменьшению SIPI.

Фотохимический индекс отражения (PRI) был разработан для оценки скорости изменения относительного уровня пигментов ксантофиллового цикла, который является активным регулятором светового потока в пигмент-белковых комплексах [12]. PRI обеспечивает быструю, не требующую разрушения тканей листа, диагностику связанных с фотосинтезом физиологических свойств листьев и растительного покрова многих видов [21, 22]. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о тесной взаимосвязи между PRI и показателем фотохимической активности фотосистемы II – ΔF/$F_{{\text{m}}}^{'}$, определяемым с помощью флуоресцентного анализа [22]. На примере растений Vitis vinifera L., при сравнении изменений параметров флуоресценции и PRI было показано, что PRI связан в большей степени с нефотохимическим, чем с фотохимическим тушением [23].

Изменение PRI во время вегетации растений может быть результатом сочетания работы ксантофиллового цикла и изменения общего пула хлорофиллов и каротиноидов, который формируется в ответ на долговременную акклиматизацию растений к условиям их обитания [24]. Результаты исследования линий яровой пшеницы популяции ITMI выявили наличие тесной отрицательной связи между числом сформированных в колосе семян и величиной PRI_mod листьев верхних ярусов, измеренных на стадии “выход в трубку” лишь в эксперименте 2, когда уровень азотного питания был наиболее высоким.

Величина индексов отражения SIPI и PRI не зависит от структуры листа, а определяется содержанием каротиноидов и активностью их превращения в ксантофилловом цикле и поэтому может служить мерой эффективности использования энергии фотосинтетического света и превращения ее в химическую в фотосистеме II [12]. В отличие от SIPI и PRI, показатель рассеяния света R₈₀₀ зависит от внутренней структуры листа, границ раздела воздух – вода, размеров клеток и органелл [25] и, прежде всего, от величины межклеточного воздушного пространства и отношения площади поверхности мезофилла к площади листа [26]. Данный показатель при внесении азота менялся незначительно, различия величины этого показателя в экспериментах 1 и 2 были статистически недостоверными. Это свидетельствует, что внесение дополнительного азота не вызывало существенных изменений структуры тканей листа. Однако связь R₈₀₀ с числом семян, сформированном в колосе опытных растений, была статистически значимой (p ≤ 0.047).

Помимо содержания хлорофиллов и каротиноидов, спектральные характеристики отражения листьев определяются и содержанием фенольных соединений, например, антоцианов, присутствие которых изменяет как качество, так и количество света, попадающего на хлоропласты. Антоцианы накапливаются в листьях растений в ответ на действие субоптимальных температур [27], недостатка элементов минерального питания [28, 29] и других неблагоприятных факторов среды, проявляя свойства антиоксидантов [30].

Картирование локусов хромосом, вовлеченных в проявление изучаемых физиологических признаков отражения листовой пластинки, позволило установить не только группы сцепления, на которых расположены идентифицированные QTL, но и то, какой формой – отцовской или материнской – был привнесен тот или иной аллель, а также процент фенотипической изменчивости, определяемый выявленным и картированным QTL. Необходимо отметить, что все изученные физиологические показатели отражения листовой пластинки, как и следовало ожидать, проявили нестабильность в их локализации на группах сцепления в зависимости от того вносилось или нет азотное удобрение. По данным QTL анализа проявление всех изученных нами оптических показателей зависело от внесения азотного удобрения, что указывает на физиологическую роль привнесенного минерального азота и его влияние на показатели отражения листовой пластинки яровой гексаплоидной пшеницы.

Полученные результаты свидетельствуют, что примененные неинвазивные оптические методы позволяют оценить интенсивность фотосинтетического аппарата растений и могут быть использованы для отбора перспективных генотипов пшеницы. Данные методы применимы и в полевых условиях, но наиболее эффективно они могут быть использованы в условиях регулируемого агроэкобиополигона, обеспечивая высокую пропускную способность при анализе фенотипических признаков, исследовании взаимосвязи генотипа и фенотипа, а также их изменчивости при реализации эволюционно-адаптивного и физиолого-генетического взаимодействия “генотип – среда”.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований № 16-04-00311а.