Физиология растений, 2019, T. 66, № 2, стр. 156-160

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что биологическая фиксация азота в растениях происходит в симбиосомах, представляющих собой бактероиды, окруженные симбиосомным пространством и симбиосомной мембраной (СМ) [1, 2]. К настоящему времени установлено, что функционирование симбиосом в сильной степени зависит от транспорта через СМ различных ионов и метаболитов, среди которых существенную роль способны играть ионы кальция как мощные регуляторы самых разнообразных процессов в животных и растительных клетках [3, 4]. Достаточно давно показано, что СМ снабжена системами активного транспорта ионов, представленными Н⁺- и Са²⁺-АТФазой, транслоцирующими ионы Н⁺ и Са²⁺, соответственно, внутрь симбиосом [5, 6]. Совсем недавно в ходе наших исследований было установлено, что локализованная на СМ Са²⁺-АТФаза способна функционировать как Са²⁺/nH⁺ антипортер, прямо энергизуемый за счет гидролиза АТФ [7–9].

Получены первые результаты в пользу такого механизма функционирования данного фермента [8, 9]. В частности, было показано, что Са²⁺-индуцируемый щелочной сдвиг рН внутри симбиосом, развиваемый из-за активности Са²⁺-АТФазы на СМ, можно наблюдать независимо от способа предварительной генерации на этой мембране ΔрН, то есть снижения рН внутри симбиосом в присутствии FCCP или за счет работы на СМ протонного насоса, Н⁺-АТФазы. Кроме того, в исследованиях действия различных концентраций свободного кальция на гидролитическую активность этого фермента было установлено, что она характеризуется кажущейся К_м для Са²⁺ в области 10^–7 М [7], то есть величиной, как правило, свойственной Са²⁺-АТФазам, характеризующимся высокой аффинностью для ионов Са²⁺. Вместе с тем остается неясным вопрос о том, соответствует ли эта величина аффинности для Са²⁺ транспортной активности фермента, поскольку, несмотря на ожидаемую здесь тесную сопряженность ее с гидролитической активностью, в определенных условиях, например, диктуемых слишком низкой и высокой концентрациями Н⁺ и Са²⁺, соответственно, внутри симбиосом, эти две активности кальциевого насоса могут быть разобщены [10]. В этом случае они могут показывать различные концентрационные зависимости по отношению к Са²⁺. Следует также иметь ввиду то обстоятельство, что этот эффект может усугубляться действием ряда факторов внутри симбиосом, очевидно создающих экспериментальные трудности в изучении транспортных свойств такого рода ферментов в их нативном окружении in vivo. Другой важный аспект, касающийся транспортной активности исследуемой Са²⁺-АТФазы и остающийся еще далеко не полностью исследованным, состоит в ее модуляции величиной рН среды инкубации симбиосом. В работе Krylova с соавт. [9] соответствующая рН-зависимость была выявлена в результате слежения за Са-зависимой диссипацией ΔрН на СМ, генерируемого активностью Н⁺-АТФазы на той же мембране, и оказалась сходной с ИТФ-гидролазной активностью фермента. Однако представляется существенным также выяснить, согласуется ли она с рН-зависимостью ИТФ-энергизованного щелочного сдвига рН внутри симбиосом, развиваемого как диссипация FCCP-индуцированного ΔрН на СМ в бескалиевой среде. Очевидно, что из-за отсутствия в этом случае потенциально мешающего фактора в виде активности Н⁺-АТФазы интерпретация результатов экспериментов может быть более ясной и однозначной.

Принимая во внимание все сказанное выше, в настоящей работе, проведенной на симбиосомах, выделенных из корневых клубеньков бобов, мы попытались также проверить, в какой степени транспортная активность Са²⁺-АТФазы на СМ соответствует ее каталитической активности, если иметь в виду ее зависимость от концентрации свободного кальция в среде. Иначе говоря, выяснить, сравнимы ли аффинности фермента для Са²⁺, его каталитическая и транспортная активности как функции концентрации свободных ионов Ca²⁺ ([Ca²⁺]_free). Другая цель проведенных экспериментов состояла в том, чтобы выяснить, способен ли этот фермент транспортировать через СМ наряду с Са²⁺ и другие катионы двухвалентных металлов, такие как Cd²⁺ и Mn²⁺, первый из которых по своему размеру очень близок к таковому Са²⁺, но обладает токсическим действием, тогда как второй представляет собой существенный, то есть необходимый растениям микроэлемент, способный в некоторых случаях выступать в качестве альтернативного субстратного иона, переносимого Са²⁺-АТФазами через клеточные мембраны [11, 12].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты, проведенные в настоящей работе, выполнены на препаратах симбиосом, выделенных из корневых клубеньков кормовых бобов (Vicia faba L., сорт Русские черные), выращенных после инокуляции растений эффективным штаммом Rhizobium leguminosarum HWM VF 3a, полученным из Института биохимии РАН. Симбиосомы были выделены согласно методике, основанной на дифференциальном центрифугировании гомогената корневых клубеньков с последующей очисткой полученного материала в градиенте плотности перкола [5].

За щелочным сдвигом рН внутри симбиосом, развивающимся в результате активности Са²⁺-АТФазы на СМ, следили по изменению дифференциального (ΔА_492–540) или абсолютного (А₄₉₂) оптического поглощения акридинового оранжевого (АО), проникающего ΔрН-индикатора [13], предварительно индуцируя закисление симбиосомного пространства с использованием двух различных экспериментальных подходов. В первом из них к симбиосомам, инкубированным в бескалиевой среде, добавляли протонофор FCCP, вызывающий ускорение эндогенного К⁺/H⁺ обмена на СМ за счет увеличения ее протонной проводимости [14]. Второй экспериментальный подход включал в себя формирование ΔрН на СМ за счет активности на ней протонного насоса, Н⁺-АТФазы. Все измерения проводили на спектрофотометрах Hitachi-557 (Япония) или Specord M40 (Германия) в стандартных 1 см кюветах без непрерывного перемешивания образцов в процессе измерений. Инкубационная среда содержала 0.4 М сорбита, 20 мМ HEPES/BTP (pH 7.0), 2 мМ MgSO₄, 9 мкМ АО и 200 мкг/мл общего симбиосомного белка. После достижения относительно стабильного градиента рН на СМ его диссипацию инициировали добавлением к симбиосомам 0.5 мМ ИТФ или СаCl₂ в той или иной концентрации, причем среда инкубации в последнем случае была дополнена 20 мМ KNO₃. За активностью Са²⁺-АТФазы следили, оценивая начальную скорость (V₀) Са²⁺-индуцируемой диссипации ΔрН, а ее зависимость от концентрации экзогенного кальция в среде использовали для оценки ее величины К_м для Са²⁺. Концентрацию белка в препаратах оценивали согласно методу Бредфорда [15]. Исследования проводили в трех биологических и трех-пяти аналитических повторностях.

В работе использовали сорбит фирмы “Calbiochem” (США), ди- и тринатриевые соли АТФ и ИТФ, соответственно, а также буферы HEPES и BTP фирмы “Sigma” (США), АО фирмы “Serva” (Германия). Ионы Са²⁺, Сd²⁺ и Mn²⁺ были добавлены к среде инкубации симбиосом в виде солей СаCl₂, CdCl₂ и MnCl₂ квалификации ОСЧ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как было показано нами ранее [9], щелочной сдвиг рН, развиваемый внутри симбиосом в результате ИТФ-зависимой трансмембранной транслокации Са²⁺ в ходе функционирования на СМ Са²⁺-АТФазы, является одним из эффектов, отражающих транспортную активность этого фермента как Са²⁺/nH⁺ антипортера, связанную с выходом ионов Н⁺ из симбиосом в обмен на поступление в них ионов Са²⁺. В описанных здесь экспериментах для исследования кинетики развития такого эффекта следили за ИТФ- или Са-зависимой диссипацией градиента рН на симбиосомной мембране, создаваемого на ней в результате FCCP-ускоряемого трансмембранного К⁺/H⁺ обмена, имеющего место при инкубации симбиосом в бескалиевой среде, либо за счет активности на этой мембране протонного насоса, Н⁺-АТФазы соответственно.

Первый из этих экспериментальных подходов был использован нами для выяснения эффекта рН среды инкубации симбиосом на транспортную активность Са²⁺-АТФазы. Принимая во внимание то обстоятельство, что при использовании АО как ΔрН-индикатора рН внутри симбиосом должен быть всегда ниже, чем рН наружной среды, выбранные значения рН последней (6.5, 7.0 и 8.0), судя по наблюдаемым эффектам, находились еще в области, приемлемой для его применения как индикатора. На рис. 1 показана кинетика F-CCP-индуцированного кислотного сдвига рН внутри симбиосом и его последующая ИТФ-индуцируемая диссипация при их инкубации в среде с рН 7.0. Наблюдаемый в данной работе эффект соответствовал тому эффекту, который был выявлен нами ранее [9]. При умеренно низком (6.5) и при высоком (8.0) значениях рН инкубационной среды кинетика процесса диссипации явно замедлялась, по меньшей мере, качественно отражая соответствующую рН-зависимость как скорости гидролиза ИТФ Са²⁺-АТФазой, так и Са-зависимой диссипации ΔрН на СМ, обусловленной активностью фермента. Эти данные подтверждают еще один сделанный ранее вывод о тесной сопряженности каталитической и транспортной активностей исследуемой Са²⁺-АТФазы [9]. Хорошо известная выраженная рН-зависимость такого типа кальциевых транспортеров как АТФ-энергизуемых Са²⁺/H⁺-обменников во многом объясняется наличием ряда протолитических групп в их Са²⁺-координирующих сайтах и, как следствие, модуляцией рН их Са²⁺-связывающей способности [16].

Рис. 1.

Кинетика ИТФ-зависимой диссипации ΔрН на СМ, генерируемого FCCP при разных значениях рН 7.0 (1), 8.0 (2), 6.5 (3) среды инкубации симбиосом. Где указано, добавлено 2 мкМ FCCP, 0.5 мМ ИТФ и 5 мМ (NH₄)₂SO₄.

При использовании другого экспериментального подхода для выявления транспортной активности Са²⁺-АТФазы следили за Cа-зависимой диссипацией градиента рН, создаваемого на симбиосомной мембране в результате функционирования на ней Н⁺-АТФазы. За кинетикой развития такого эффекта следили при различных концентрациях экзогенного кальция в среде инкубации симбиосом с целью оценки аффинности Са²⁺-связывающего сайта фермента для этого катиона (рис. 2). Концентрационная зависимость кинетики рассматриваемого процесса, отражаемой в начальной скорости Са-зависимой диссипации ΔрН на СМ, представлена на рис. 3. Можно видеть, что эта зависимость достигает насыщения, то есть стационарного уровня, уже при очень низких, а именно субмикромолярных, концентрациях кальция в среде и качественно сходна с соответствующей концентрационной зависимостью ИТФ-гидролазной активности фермента [7], тем самым снова указывая на высокое сродство его Са²⁺-связывающего сайта к этому катиону. Поскольку рассматриваемая зависимость, построенная как функция концентрации свободного кальция, обнаруживает признаки насыщения даже при более низких концентрациях этого катиона, отсутствие в экспериментах данного типа кальциевого буфера в среде инкубации симбиосом не дает оснований считать сделанное здесь заключение неправомерным. Иначе говоря, в этом случае мы имели бы только более сильный аргумент в пользу нашего вывода. На рис. 3 можно также видеть, что активность Са²⁺-АТФазы заметно снижается при относительно высоких концентрациях кальция в среде, что вероятно обусловлено снижением скорости диссоциации Са²⁺ с Са²⁺-связывающих сайтов фермента, когда концентрация аккумулированного катиона внутри симбиосом приближается к их К_d для Са²⁺ или становится выше этой величины.

Рис. 2.

Генерация на СМ трансмембранного градиента рН Н⁺-АТФазой и его диссипация в присутствии ионов Са²⁺. Где указано, добавлено 1 мМ Na₂АТФ, 0.1 (1), 0.2 (2), 0.3 (3) мкМ СаCl₂, и 5 мМ (NH₄)₂SO₄.

Рис. 3.

Зависимость начальной скорости (V₀) Са²⁺-зависимой диссипации трансмембранного градиента рН на СМ, образованного Н⁺-АТФазой, от концентрации СаCl₂ в среде инкубации симбиосом.

Довольно низкая величина кажущейся К_М Са²⁺-АТФазы для Са²⁺, следующая из анализа концентрационной зависимости кинетики Са-индуцируемой диссипации трансмембранного градиента рН на СМ, образованного Н⁺-АТФазой, подтверждает высокую аффинность исследуемого фермента для этого катиона, ранее установленную в результате определения его ИТФ-гидролазной активности [9]. В свою очередь это означает, что низкоаффинный Са²⁺/nH⁺ антипортер, энергизуемый трансмембранным протонным градиентом, отсутствует на СМ, что согласуется с результатами, полученными нами ранее [5]. В этой связи интересно отметить, что в отношении механизма аккумуляции кальция симбиосома как уникальный мембранный компартмент обнаруживает сходство с саркоплазматическим ретикулумом, мембрана которого снабжена Са²⁺-АТФазой, также функционирующей как Са²⁺/nH⁺-обменник и обеспечивающей эффективную загрузку этой органеллы ионами Са²⁺ [17]. Однако, как и в случае симбиосом, потенциальная физиологическая роль трансмембранной транслокации иона Н⁺ рассматриваемым ферментом остается пока неясной.

Принимая во внимание тот факт, что вопрос о возможной способности Са²⁺-связывающего сайта Са²⁺-АТФазы связывать другие катионы двухвалентных металлов и далее переносить их через СМ в ходе работы данного фермента в настоящее время остается открытым, в дальнейших экспериментах мы попытались выяснить, функционирует ли Са²⁺-АТФаза в присутствии ионов Cd²⁺ и Mn²⁺. Как показано на рис. 4, добавление к симбиосомам субмилимолярных концентраций этих катионов после достижения относительно стационарной величины ΔрН на СМ в ходе функционирования на ней протонного насоса, оставляет ее фактически неизменной, причем кажущийся очень слабый диссипативный эффект, вызываемый катионами Cd²⁺, скорее всего является результатом ингибирования Н⁺-АТФазы, как вполне ожидаемого их сильного токсического действия. Хотя эти данные могут указывать на относительно высокую избирательность Са²⁺-связывающего сайта Са²⁺-АТФазы для ионов Са²⁺, такое заключение нельзя считать окончательным из-за явной ограниченности полученных экспериментальных данных. В частности, в случае Mn²⁺ сродство Са²⁺-связывающего сайта Са²⁺-АТФазы к этому катиону может быть гораздо меньше, чем к Са²⁺ [12], и тем самым обуславливать очень слабый эффект.

Рис. 4.

Эффекты Ca²⁺, Cd²⁺ и Mn²⁺ на кинетику кислотного сдвига рН внутри симбиосом, запускаемого активностью Н⁺-АТФазы на СМ. Где указано, добавлено 1 мМ Na₂АТФ, 100 мкМ СаCl₂, CdCl₂, MnCl₂ и 5 мМ (NH₄)₂SO₄.

Среди представленных в настоящей работе результатов обращает на себя внимание тот факт, что выявленная величина кажущейся К_М Са²⁺-АТФазы для Са²⁺ оказывается сравнимой с той, что была найдена в клетках эукариотов для кальциевых АТФаз, активированных кальмодулином (СаМ) или другими факторами за счет снятия ими эффекта автоингибирования, свойственного этим ферментам [18]. Это обстоятельство предположительно указывает на то, что в выделенных симбиосомах Са²⁺-АТФаза СМ либо остается связанной с эндогенным СаМ или СаМ-подобным белком, либо претерпевает определенную модификацию в ходе их выделения и очистки симбиосомной мембраны, например, в результате активности эндогенных протеаз, приводящей также к диссоциации автоингибиторного домена от активного центра фермента и тем самым к увеличению доступности последнего для ионов Са²⁺. Однако вопрос о справедливости этой гипотезы остается пока открытым и является одним из важных аспектов наших будущих исследований.