Физиология растений, 2019, T. 66, № 6, стр. 441-451

ВВЕДЕНИЕ

Изучение адаптации и стрессоустойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды – одно из востребованных направлений современной биологии, особенно экологической физиологии растений [1]. Чрезвычайно актуальными для исследований являются вопросы повышения устойчивости культурных растений, которые зачастую оказываются в экстремальных условиях под воздействием абиотических и биотических стрессоров [2]. Горные агробиоценозы в этом плане представляют собой уникальные природные модели для исследования приспособительных возможностей различных форм культурных растений, так как условия произрастания изменяются не только сообразно смене времен года, но также напрямую зависят от высоты расположения над уровнем моря. Произрастание в горных экосистемах сопряжено с рядом особенностей. Растительный покров в горах сильно препятствует теплообмену со свободно циркулирующим атмосферным воздухом, поэтому днем благодаря высоким дозам инсоляции на поверхности почвы могут возникать тропические температуры. В ясные ночи тепловая отдача сильно понижает температуру поверхности растительных насаждений по сравнению с температурой воздуха, что может повлечь за собой значительные повреждения мембран клеток и их внутренних компартментов. Комплексное воздействие рельефа и микроклимата подвергает растения воздействию температур и сильной солнечной радиации, в особенности жесткому ультрафиолетовому облучению [3]. С увеличением высоты произрастания над уровнем моря сочетание и контрастность перечисленных абиотических факторов среды будут иметь все больший спектр воздействия на организм растения. Таким образом, данные динамические изменения условий произрастания в горах могут оказывать широкое комплексное воздействие на растительные организмы на различных уровнях их организации. Тем не менее, адаптивные возможности культиваров в столь сложных условиях горных агробиоценозов в настоящее время изучены недостаточно и заслуживают большего внимания. Кроме фундаментальной ценности таких исследований, они необходимы и для разработки методологических подходов по сохранению генофонда, отбору наиболее приспособленных форм растений, их интродукции и выращивания в условиях культуры, а также адаптивного сельского хозяйства в зонах рискованного земледелия и техногенных ландшафтов. В связи с этим, модельным объектом для исследования мы выбрали плоды яблони домашней Malus domestica Borkh. (Rosaceae) как одного из наиболее широко распространенных культиваров, исторически возделываемого в горных агроландшафтах и имеющего большое экономическое и продовольственное значение.

Структурная организация и функциональные особенности плодов, несмотря на относительную их консервативность, выступают как индикаторы адаптивных преобразований. Эти особенности плодов так же, как и семян, расцениваются многими исследователями как “информационная память” о прошлых эколого-географических условиях произрастания растений [4]. По мнению А.Л. Тахтаджяна [5], плод является венцом приспособительной эволюции покрытосеменных и его значение выходит далеко за пределы этих растений. Плоды не просто органы в пределах тела растения, которые, как и многие другие части, выполняют определенные функции, они также наделены важной ролью (функциональностью) в системе фитосферы и биосферы в целом.

Цель работы – выявление некоторых цитофизиологических приспособлений тканей плода Malus domestica к условиям высотной поясности по накоплению веществ фенольной природы и составу жирных кислот суммарных липидов как возможных структурно-функциональных и биохимических маркеров ответа на совокупность основных абиотических воздействий горной среды.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. В качестве объекта исследования были использованы плоды яблони домашней (Malus domestica Borkh.) позднезимнего сорта Ренет Симиренко, произрастающей на высотах 300, 500, 700 и 1200 м над уровнем моря в центральной части предгорий Северного Кавказа, в частности Кабардино-Балкарии (табл. 1) [6, 7].

Образцы для исследований (зрелые плоды на стадии съемной зрелости) были собраны в 3‑кратной повторности из средней части кроны, где отсутствует прямое солнечное облучение, трех модельных деревьев в специально заложенных опытных и коллекционных посадках Северо-Кавказского научно-исследовательского института горного и предгорного садоводства (ФГБНУ СевКавНИИГиПС). В степной зоне (300 м над уровнем моря) использовали площадки Терского – “Урожайненские сады” и Урванского – КФХ “Долов” районов; в предгорной (500 м) – Затишьенский опытный полигон ФГБНУ СевКавНИИГиПС (г. Нальчик); лесогорной (700 м) – ОАО “Кенже”, Баксанский и Зольский районы; горностепной (1200 м) – Черекский и Эльбрусский районы. Сроки наступления съемной зрелости плодов существенно изменяются в зависимости от экологических условий. Съемная зрелость сорта Ренет Симиренко после полного цветения (10–16 мая) наступает в разные сроки: на высоте 300 м через 149–162 дня (28 сентября–13 октября); 500 м – 155–169 дней (08–25 октября); 700 и 1200 м – 162–176 дней (10–20 октября).

Микроскопические исследования клеток плодов M. domestica проводили на микроскопе AxioImager D1 (“Carl Zeiss”, Германия) в проходящем свете. Срезы для анатомических и гистохимических исследований изготавливали из 3–4 секций наружных тканей (эпидерма, гиподерма) и паренхимной части, взятых с противолежащих участков в области экватора плода на одинаковом расстоянии от долей чашечки и плодоножки, с помощью микротома с вибрирующим лезвием Microm HM 650V (“Thermo Scientific”, Германия), толщина срезов 30–50 мкм. Для визуализации фенольных соединений (ФеС) срезы обрабатывали хлоридом железа (III) (FeCl₃), бихроматом калия (K₂Cr₂O₇) [8] или 4-(Dimethylamino)cinnamaldehyde (DMACA, “Sigma-Aldrich”, США) [9]. Микрофотографии получали с помощью камеры AxioCam MRc (“Carl Zeiss”, Германия). Изображения обрабатывали в программе ZEN lite 2012. Для обсчетов использовали не менее 50 микрофотографий для каждой из трех биологических повторностей.

Электронно-микроскопические исследования осуществляли на трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ) JEM-1400 (“JEOL Ltd.”, Япония). Подготовку материала проводили по модифицированной ранее методике [10]. Материал фиксировали глутаровым альдегидом (на 0.1 М фосфатном буфере, pH 7.2) и 1% раствором четырехокиси осмия. Затем образцы обезвоживали в серии спиртов и ацетонов возрастающей концентрации и заливали в Эпон-812. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-III-8801A (“LKB Bromma”, США). Срезы контрастировали 2% водным раствором уранил-ацетата (37°С) и цитратом свинца по Рейнольдсу.

Определение состава ЖК суммарных липидов. Полностью препарированные наружные ткани и всю паренхимную часть плода M. domestica фиксировали по отдельности в кипящем изопропаноле (предварительно смыв поверхностные воска хлороформом), содержавшем 0.001% ионола в качестве антиоксиданта, и гомогенизировали. Абсолютное содержание и состав ЖК суммарных липидов в полученных гомогенатах определяли, как описано ранее [11]. Идентификацию и определение количественного содержания метиловых эфиров ЖК (МЭЖК) выполняли с помощью ГЖХ-МС на приборе Agilent 7890A GC (“Agilent Technologies Inc.”, США) с 60-метровой капиллярной колонкой с внутренним диаметром 0.25 мм (DB-23, № US8897617H). Для оценки уровня ненасыщенности ЖК в липидах околоплодника рассчитывали индекс ненасыщенности (ИН) [12]. Абсолютное содержание липидов выражали в мкмолях этерифицированных ЖК в расчете на 1 г сырой массы [13].

Все опыты были выполнены в трех биологических и трех аналитических повторностях. В таблицах и на графиках представлены средние значения и их стандартные отклонения. Достоверность различий между средними значениями оценена по t-критерию Стьюдента при Р ≤ 0.05. Количественные данные обрабатывали с помощью однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа, достоверно различающиеся между собой величины обозначены разными буквами.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Толщина кутикулы

Наиболее толстая кутикула была отмечена у плодов M. domestica на высоте 300 м (~14 мкм). У образцов, собранных с деревьев на других высотах, она была более тонкой и достоверно между собой не различалась (рис. 1а).

Рис. 1.

Морфометрические показатели наружных тканей плода Malus domestica: (а) – толщина кутикулы на разных высотах, * – достоверно отличающиеся величины; (б) – площадь клеток эпидермы не содержащих (1) и содержащих (2) ФеC, гиподермы не содержащих ФеС (3) и с ФеC (4), разными буквами обозначены достоверно отличающиеся величины; (в) – поверхность не экранированная (1) и экранированная (2) ФеС.

Фенольные соединения

Гистохимический скрининг общего содержания ФеС с помощью FeCl₃ [14], а также проантоцианидинов (танинов) – бихроматом калия (рис. 2б–д, темно-коричневое окрашивание) или DMACA (рис. 2е–ж, синее окрашивание) [9, 15–17] показал значительное накопление в клетках наружных тканей плодов яблони веществ фенольной природы. Клетки, содержащие ФеС, не отличались по размеру от обычных (рис. 1б), т.е. являлись неспециализированными клетками эпидермы и гиподермы, в которых индуцирован синтез и накопление ФеС. С увеличением высоты (до 500, 700 и 1200 м над уровнем моря) происходило уменьшение размеров клеток эпидермы и гиподермы, причем первой в большей степени (рис. 2в–д). Несмотря на мелкоклеточность (рис. 1б), с увеличением высоты количество клеток, содержащих ФеС, становилось больше (рис 2б–д), особенно в эпидермальной ткани, где на высоте 1200 м этими веществами экранировано более 50% поверхности плода (рис. 1в).

Рис. 2.

Гистологические срезы плода Malus domestica с разных высот над уровнем моря: (a) – неокрашенный (700 м); (б, в, г, д) – окрашенные K₂Cr₂O₇ (300, 500, 700 и 1200 м, соответственно), темно-коричневое окрашивание; (е, ж) – окрашенные DMACA (700 и 1200 м, соответственно), синее окрашивание. Масштабная шкала – 50 мкм.

Проведенные электронно-микроскопические исследования наглядно показали, что увеличение высоты произрастания над уровнем моря изменяло не только количество клеток с ФеС (рис. 1в), но и характер отложений этих веществ в клетке (рис. 3). Так, на высоте 300 м над уровнем моря в клетках наружных тканей плода M. domestica электронно-плотный материал (ЭПМ) был немногочисленным, встречался главным образом на тонопласте центральной вакуоли в виде отдельных небольших образований (рис. 3а) и более крупных скоплений в цитоплазме (рис. 3б), или же накапливался в мелких цитоплазматических вакуолях (рис. 3в). У яблок с высоты 500 м над уровнем моря ЭПМ так же представлен отдельными мелкими образованиями на тонопласте и крупными танноглобулами (ТГ) [14] в центральной вакуоли (рис. 3г) либо более крупными отдельными или сгруппированными отложениями (рис. 3д). На высоте 700 м ЭПМ сконцентрирован в центральной вакуоли, либо в виде ТГ (рис. 3е–ж), либо на тонопласте слоем из мелких сливающихся образований (рис. 3ж, указано стрелками). На 1200 м ЭПМ располагался в виде множества отдельных крупных конгломератов на тонопласте (рис. 3з, указано стрелками), либо образовывал на нем сплошной слой (рис. 3и, указано стрелками) наряду с содержанием в центре вакуоли ТГ (рис. 3з–и). Подобную картину в виде сплошного синего канта по периметру клетки можно было наблюдать и при окрашивании препаратов плода DMACA (рис. 2ж), что является дополнительным свидетельством в пользу полифенольной природы ЭПМ, наблюдаемого на ТЭМ-микрографиях (рис. 3а–и).

Рис. 3.

Микрографии (a–и) и морфометрические характеристики (к) плода Malus domestica с разных высот над уровнем моря: (a) – 300 м, масштабная шкала (МШ) = 50 мкм; (б) – 300 м, МШ = 10 мкм; (в) – 300 м, МШ = 0.2 мкм; (г) – 500 м, МШ = 50 мкм; (д) – 500 м, МШ = 20 мкм; (е) – 700 м, МШ = 1 мкм; (ж) – 700 м, МШ = 50 мкм; (з) – 1200 м, МШ = 5 мкм; (и) – 1200 м, МШ = 10 мкм; (к) – площадь клеток эпидермы (1), гиподермы (3) и занимаемая ФеС в них площадь (2 и 4, соответственно). Разными буквами обозначены достоверно отличающиеся величины. В – вакуоль, К – кутикула, КС – клеточная стенка, ПГ – пластоглобула, ТГ – танноглобула, ХЛ – хлоропласт, ЭПМ – электронно-плотный материал, Я – ядро.

Морфометрический анализ электронных микрографий показал, что в абсолютных величинах (мкм²) площадь, занимаемая ФеС в клетке, становилась меньше с увеличением высоты (рис. 3к) произрастания плодовых деревьев, но при этом следует учесть, что в предгорной, лесогорной и горно-степной экологических зонах наблюдалась мелкоклеточность наружных тканей (рис. 1б). Поэтому в пересчете на процент от площади одной клетки количество полифенолов постепенно возрастало с увеличением высоты над уровнем моря (на 300 м – ЭПМ занимал 15 и 4% от площади клетки эпидермы и гиподермы, соответственно; на 500 м – 18 и 4%; на 700 м – 24 и 3%; на 1200 м – 27 и 13%).

ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ литературных данных показал, что все экологические зоны, в которых произрастали модельные плодовые растения, с которых собирали образцы, характеризуются широкой амплитудой значений множества климатических показателей [6, 7]. С повышением высоты происходит снижение средних показателей температур и, напротив, возрастает освещенность (табл. 1). На высоте 300 м над уровнем моря гидротермический коэффициент увлажнения (ГКТ) [18] в разные годы колеблется около единицы, что является краем границы степной зоны, однако в условиях данного агробиоценоза M. domestica успешно произрастает и плодоносит. С увеличением высоты произрастания количество осадков за вегетационный сезон неуклонно возрастает. Кроме того, с повышением высоты над уровнем моря на каждые 100 м величина солнечной радиации возрастает на ~1.5% [19], поэтому для образцов, собранных с площадки 1200 м индекс УФ-облучения более чем на 10% выше, чем для плодов M. domestica с высоты 300 м. Учитывая также, что количество солнечных дней с повышением высоты практически не изменяется в предгорной, лесогорной и горно-степной зонах (табл. 1), плоды на высоте 1200 м подвергаются большему облучению в сравнении с образцами, собранными с других высот. Таким образом, основными ограничивающими факторам в условиях высотной поясности Северного Кавказа можно считать температуру и УФ-излучение.

С повышением высоты произрастания над уровнем моря происходит понижение температуры воздуха, увеличивается влажность и уровень солнечной радиации, в особенности ультрафиолета-В (УФ-В) [20]. Первым препятствием для проникновения УФ в ткани плода является кутикула, которая может рассеивать свет и снижать интенсивность облучения в среднем на 20% [21]. Однако нами не было обнаружено достоверных различий в толщине кутикулы с повышением высоты произрастания. Более толстая кутикула на поверхности эпидермы M. domestica с высоты 300 м связана, вероятнее всего, с большим количеством суховеев за вегетационный период (70 дней) в данной экологической зоне (табл. 1). Таким образом, эта адаптационная особенность плодов с наименьшей высоты способствует сохранению определенного константного уровня оводненности (100% – сухой вес) их клеток как в наружных тканях (табл. 2), так и в паренхиме (табл. 3).

По многочисленным литературным данным, облучение клеток растений УФ [22], в частности листьев винограда Vitis vinifera L. [23] и плодов M. domestica [21, 24] приводит к образованию и накоплению в них ряда фенольных соединений [25, 26]. Действительно, с увеличением высоты произрастания мы зарегистрировали увеличение количества ФеС в наружных слоях плодов яблони. Причем следует отметить важный факт, что изменения носят двойственный характер, а именно увеличивается как количество клеток, содержащих ФеС, так и процент, занимаемый ФеС от площади каждой такой клетки.

В ходе исследования нами была обнаружена мелкоклеточность наружных тканей плодов M. domestica, произрастающих на площадках 500, 700 и 1200 м. Можно было бы предположить, что это ксероморфный признак, но с увеличением высоты количество осадков и показатель ГКТ возрастает (табл. 1) и, вероятнее всего, обнаруженные изменения размеров клеток вызваны низкими температурами среды (табл. 1) и большими энергетическими затратами клеток по накоплению пластического материала (ФеС).

Таким образом, чем больше высота произрастания M. domestica над уровнем моря, тем больше в наружных слоях плода, непосредственно подвергающихся УФ-облучению, содержится ФеС. Благодаря этому, плоды M. domestica с подъемом в горы приспосабливаются к увеличивающейся солнечной радиации вследствие экранирования клеток наружных слоев фенольными соединениями [21, 25, 26]. Особенно актуальна такая защита на больших высотах с более низкими среднесуточными температурами, где ферментативные системы деактивации активных форм кислорода, образуемые при УФ-облучении, функционируют слабее [27]. Эта особенность обусловлена приспособлением растительного организма к увеличению УФ-облучения [28] с изменением высоты произрастания над уровнем моря плодовых деревьев. Известно, что ФеС обладают выраженными антиоксидантными свойствами, а высокие дозы УФ вызывают окислительный стресс в растительной клетке. Следовательно, увеличение количества ФеС является защитным механизмом, позволяющим тканям плода M. domestica успешно завершить программу созревания на высотах с контрастными почвенно-климатическими условиями, сохраняя при этом генетический материал семян от вредного воздействия высоких доз УФ.

УФ-излучение может приводить к изменениям в составе ЖК липидов мембран клеток [22, 29]. Из анализа полученных результатов состава МЭЖК ацилсодержащих суммарных липидов следует, что качественные и количественные отличия в паренхиме плодов M. domestica на всех высотах (300–1200 м над уровнем моря) носят минимальный характер, а явные различия обнаружены нами снова в их наружных слоях. Также с повышением высоты произрастания M. domestica до 1200 м в наружных тканях плода наблюдается увеличение значения индекса ненасыщенности (ИН) по сравнению с высотой 300 м (1.455 и 1.084, соответственно) (табл. 2). Эта закономерность объясняется повышением содержания в наружных слоях плодов M. domestica полиненасыщенных С_18:2 и С_18:3 жирных кислот. Как известно, с повышением высоты понижается среднесуточная температура (табл. 1), что может вызывать изменение состояния клеточных мембран (снижение текучести). Однако из-за способности растений адаптироваться к холоду происходит гомеостатирование текучести мембраны путем синтеза полиненасыщенных ЖК [30], благодаря чему клетки наружных слоев плодов поддерживают физиологические параметры текучести своих мембран.

Таким образом, в ходе исследования был выявлен ряд приспособительных возможностей тканей плодов M. domestica в условиях высотной поясности: прежде всего, накопление в клетках наружных слоев ФеС и увеличение ИН. Причем эти адаптационные механизмы работают взаимосвязанно, приспосабливая плоды M. domestica к изменяющимся сублимитирующим факторам окружающей среды. Накопление ФеС, по нашему мнению, в первую очередь связано с возрастающим в горах индексом УФ-облучения, а рост доли полиненасыщенных ЖК суммарных липидов – с резкими колебательными изменениями температур в горах. Мы видим, что с увеличением высоты произрастания накопление ФеС и изменение ИН происходит сообразно изменениям каждого из ограничивающих развитие факторов среды, и так как модуляция погоды в горах обусловлена изменением ряда климатических факторов, то и невозможно представить, что какой-то один адаптационный механизм сможет обеспечить результативное приспособление. Следовательно, именно комплексное приспособление на клеточном и биохимическом уровнях определяет не только успешное произрастание M. domestica в жестких климатических условиях высотной поясности, но дает возможность для продуктивного завершения вегетационного периода, а именно программы созревания плода.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.