Физиология растений, 2020, T. 67, № 5, стр. 451-469

ВВЕДЕНИЕ

Название семейства хлоридных каналов (CLC – ChLoride Channel) произошло от первого открытого белка этого семейства CLC-0, обнаруженного в электрическом органе ската Torpedo californica и оказавшегося потенциал-зависимым хлоридным каналом [1]. Долгое время считалось, что белки этого семейства участвуют только в пассивном транспорте хлорид-иона, то есть как и CLC-0 являются хлоридными каналами. Клонирование похожих генов из других организмов и исследование функций кодируемых ими белков путем экспрессии в ооцитах шпорцевой лягушки [2] привело к открытию многих родственных генов [3]. Обнаружили, что семейство CLC включает не только анионные каналы, но и анион/протонные антипортеры. Последние могут осуществлять вторично-активный транспорт анионов в обмен на протоны, используя в качестве источника энергии градиент электрохимического потенциала протонов.

Белки семейства хлоридных каналов являются мембранными интегральными белками, которые включают 10−12 трансмембранных доменов [4]. Все эукариотические CLC содержат два гидрофильных регуляторных CBS-домена (цистатионин-β-синтетазных домена) [5]. Еще одной особенностью белков семейства CLC является наличие трех аминокислотных мотивов, участвующих в формировании анион-проводящего пути: (1) GxGxPE, (2) GKxGPxxH, (3) PxxGxLF [6–8]. Мотив (1) является селективным фильтром [8, 9]. Присутствие в нем серина (GSGxPE) определяет его хлоридную специфичность [10, 11], а пролина (GPGxPE) – нитратную специфичность [12, 13]. Анион/протонным антипортерам свойственно наличие двух ключевых консервативных глутаматов − “воротного” и “протонного”. У Escherichia coli воротный и протонный глутаматы занимают положения 148 (E148) и 203 (E203) соответственно [9, 14]. Воротный глутамат отвечает за воротный процесс, контролирующий его ионную проводимость [9]. У анионных каналов этого семейства может присутствовать лишь один, а именно воротный глутамат. Протонный глутамат участвует в сопряжении переноса аниона с противоположно направленным транспортом протона [14]. Воротный глутамат находится в мотиве (2) – GKEGPxxH. Протонный глутамат расположен в четвертой позиции, следующей за мотивом (3) – PxxGxLFxxxE [4]. Белки CLC могут функционировать в мономерной и гомодимерной формах. Каждый мономер образует ион-проводящий путь [5].

Представители семейства CLC широко распространены среди организмов, они найдены у прокариот, грибов, животных и растений. Девять представителей этого семейства обнаружено у млекопитающих [15], семь найдено у Arabidopsis thaliana [7]. Цитрусовые, соя, кукуруза, рис и тополь содержат в своих геномах от 5 до 9 генов СLC [16]. Семнадцать генов CLC идентифицировано у Nicotiana tabacum [17] и 22 гена у Brassica napus [18].

Филогенетический анализ последовательностей белков семейства СLC у растений показывает, что бóльшая часть известных белков этого семейства образует “эукариотическую” ветвь. Остальные белки CLC растений в наибольшей степени родственны бактериальным CLC и формируют далеко отстоящую от эукариот “прокариотическую” ветвь. На рис. 1 представлена дендрограмма, построенная нами на основе последовательностей белков CLC, кодируемых клонированными из растений генами. Обе ветви присутствуют на дендрограмме, как и в работе [19].

Рис. 1.

Филогенетическое дерево, иллюстрирующее степень сходства между белками семейства CLC S. cerevisiae, E. coli и растений (A. thaliana, O. sativa, N. tabacum, G. max, Z. mays, P. trifoliate, T. halophila, S. altissima). EcCLCA (P37019), E-cCLCB (P76175.2), Gef1p (P37020.2), AtCLCa (NP_198905.1), AtCLCb (NP_189353.1), AtCLCc (NP_199800.1), AtCLCd (NP_197996.1), AtCLCe (NP_001190924.1), AtCLCf (Q8RXR2.2), AtCLCg (NP_198313.2), NtCLC1 (NP_001312418.1), NtCLC2 (AAD29679.1), OsCLC-1 (BAB97267.1), OsCLC-2 (BAB97268.1), GmCLC1 (AAY43007.1), GmCLCb1 (KRH06955.1), GmCLCb2 (XP_003553925.1), GmCLCc1 (XP_003533268.2), GmCLCc2 (XP_006599656.1), GmCLCd1 (XP_003517583.1), GmCLCd2 (XP_006590397.1), GmCLCg (XP_003542650.1), ZmCLCc (AAP04392.2), ZmCLCd (AGR03817.1), PtrCLC1 (Cs2g25150), PtrCLC2 (Cs3g03450), PtrCLC3 (Cs4g05340), PtrCLC4 (Cs4g07570), PtrCLC5 (Cs9g06580), PtrCLC6 (orange1.1t03372), ThCLC-a (ADD09860.1), SaCLCa1 (ANG09048.1), SaCLCc1 (AVQ93350.1). Все последовательности белков взяты из NCBI, за исключением последовательностей P. trifoliate, полученных из базы данных (http://citrus.hzau.edu.cn/cgi-bin/orange/search). Подгруппа I – “эукариотическая” ветвь, подгруппа II – “прокариотическая” ветвь. Филогенетическое дерево построили в программе MEGA X v. 10.0.1 (https://www.megasoftware.net/) методом максимального правдоподобия, основанном на модели Джонса-Тейлора-Торнтона. Проведено 100 бутсреп-репликаций, в узлах указаны значения бутстреп-поддержки.

Являясь анионными каналами и анион/протонными антипортерами, белки семейства CLC участвуют во множестве процессов и физиологических функций. О важной роли белков CLC свидетельствуют генетические болезни млекопитающих, вызываемые нарушениями в первичной структуре генов CLC, такие, например, как идиопатическая эпилепсия, синдром Баттера, болезнь Дента, остеопетроз и многие виды миопатии [3]. У растений белки CLC вовлечены в устьичные движения, в транспорт анионов из цитоплазмы в вакуоль, осморегуляцию и поддержание тургора, формирование устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам. Так же как представители CLC других царств, CLC растений играют важную роль в везикулярном транспорте, регулируя рН люменов органелл и их мембранный потенциал [20, 21].

Лучше всего изучены белки семейства CLC у млекопитающих. Данные о них представлены в ряде исчерпывающих обзоров [15, 22–25]. Меньше известно о представителях семейства CLC растений. Вместе с тем за время, прошедшее после опубликования последних обзоров, посвященных семейству CLC растений [7, 26], о нем появилось много новой информации. Значительная часть новых данных традиционно получена с использованием модельного растения A. thaliana. Наряду с этим существенно увеличился перечень видов растений, у которых представители CLC идентифицированы на молекулярно-генетическом и функциональном уровнях. Полученная за это время информация о семействе CLC растений нуждается в систематизации и обобщении, что и явилось мотивацией для написания данного обзора. В настоящем обзоре приводятся и обсуждаются данные о белках семейства CLC из A. thaliana и других видов растений с акцентом на результаты, полученные в последнее десятилетие. Рассматриваются функциональные и структурные аспекты растительных CLC-белков, их физиологическая роль в нормальных и стрессовых условиях.

СЕМЕЙСТВО БЕЛКОВ CLC У ARABIDOPSIS THALIANA

Семейство CLC у A. thaliana включает 7 белков, которые локализованы во внутриклеточных мембранах: AtCLCa, AtCLCb, AtCLCc, AtCLCd, AtCLCe, AtCLCf и AtCLCg [27–29] (рис. 2.). Уровень экспрессии генов AtCLCa-g в значительной степени зависит от ткани и органа растения, а также от стадии его развития [19]. Почти все представители семейства AtCLC экспрессируются в сосудистых тканях, что предполагает участие этих белков в дальнем транспорте ионов [19]. Исключением являются AtCLCc и AtCLCe. AtCLCc экспрессируется преимущественно в замыкающих клетках устьиц [19, 30], а AtCLCe – в фотосинтезирующих тканях [19]. AtCLCa-AtCLCc и AtCLCg локализованы в вакуолярных мембранах [19, 29–32], AtCLCe – в тилакоидах хлоропластов [28], а AtCLCd и AtCLCf – в аппарате Гольджи [19, 20, 28].

Рис. 2.

Внутриклеточная локализация белков семейства CLC у A. thaliana (по [7] с изменениями). Все белки семейства CLC локализованы во внутриклеточных мембранах: AtCLCa-c и AtCLCg – в тонопласте, AtCLCd и AtCLCf – в мембранах АГ, AtCLCe – в тилакоидах.

Функции белков семейства CLC у A. thaliana остаются до конца не выясненными. Транспорт анионов и анионная селективность в прямых экспериментах продемонстрированы только для двух представителей этого семейства – AtCLCa и AtCLCb [31, 32]. В аминокислотных последовательностях AtCLCa-AtCLCd содержатся оба консервативных глутамата, как протонный, так и воротный [26]. AtCLCg содержит только протонный глутамат, а AtCLCe и AtCLCf – только воротный глутамат. Это дает основание предположить, что AtCLCa-AtCLCd функционируют как анион/протонные антипортеры, а у AtCLCe-AtCLCg – другой механизм транспорта анионов [19, 26]. Ниже приведено подробное описание каждого представителя семейства CLC у A. thaliana.

AtCLCa был первым исследованным на функциональном уровне потенциал-зависимым ${\text{NO}}_{3}^{ - }$/H⁺-антипортером семейства хлоридных каналов у A. thaliana [31, 33].

На растениях дикого типа (ДТ) и нокаут-мутантах clca методом локальной фиксации потенциала на выделенных вакуолях был продемонстрирован перенос анионов через мембрану белком AtCLCa. Перенос анионов был сопряжен со встречным потоком протонов, стехиометрия ${\text{NO}}_{3}^{ - }$/H⁺ обмена составляла 2 : 1. Селективность AtCLCa убывала в ряду ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ ≈ I^– > Br^– > Cl^– > ${\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$ > глутамат. AtCLCa транспортировал ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в вакуоль при физиологических значениях мембранного потенциала и концентрациях ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в цитозоле (–40…–20 мВ и 4.2–19.2 мМ соответственно) [31].

Методом локальной фиксации потенциала также показано, что замена воротного глутамата Glu-203 AtCLCa на аланин (E203A) путем сайт-направленного мутагенеза привела к разобщению анион/H⁺-проводимости. Транспорт аниона у этого мутанта не сопровождался транспортом H⁺ [12]. Замещение протонного глутамата Glu-270 аланином (E270A) привело к прекращению переноса ионов AtCLCa [12]. Однако замена обеих аминокислот в последовательности белка AtCLCa (E203A, E270A) привела к тому же эффекту, что и замена только воротного глутамата. Транспорт Сl^–, разобщенный с переносом H⁺, у белка A-tCLCa (E203A, E270A) восстанавливался [12]. Предполагается, что Glu-270 важен для транспорта и аниона, и протона [7]. Пролин в положении 160 отвечает за нитратную селективность белка AtCLCa и его проводимость. Замена пролина у AtCLCa на серин в положении 160 привела к изменению селективности белка. AtCLCa(P160S) транспортировал Сl^– с большей эффективностью, чем ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ [13]. Результаты цитированных работ указывают на вовлечение AtCLCa в ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ гомеостаз и pH-статирование цитоплазматического и вакуолярного компартментов, а также на участие ключевых глутаматов и мотива селективного фильтра в регуляции анион/протонного обмена через тонопласт.

На важную функциональную роль белка AtCLCa указывают результаты исследования экспрессии и активности промотора его гена. AtCLCa экспрессируется во всех органах и на всех стадиях онтогенеза A. thaliana. Наибольший уровень транскрипции гена наблюдается в листьях. Показано, что количество транскриптов AtCLCa было наибольшим у 2-недельных растений и заметно снижалось с их возрастом [19]. Активность промотора AtCLCa, измеренная с помощью репортерного фермента β‑глюкуронидазы, проявлялась уже у проростков A. thaliana и обнаруживалась во всех органах взрослых растений [19]. Наибольшая активность промотора гена была найдена в устьичных клетках семядолей и зрелых листьях [34].

Экспрессия AtCLCa в 5–10 раз выше экспрессии остальных генов семейства AtCLC [32]. Количество транскриптов AtCLCa возрастает в корнях и надземных органах в ответ на добавление нитрата в среду культивирования [32, 33]. Экспрессия AtCLCa изменяется в течение суток. На протяжении почти всего темнового периода количество транскриптов AtCLCa было в 2–3 раза больше, чем в световой период. Предполагается, что AtCLCa участвует в запасании нитрат-иона в вакуолях в течение ночи, когда восстановление ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ подавлено [32].

Помимо регуляции экспрессии гена AtCLCa на транскрипционном уровне имеются данные о регуляции активности этого транспортера некоторыми метаболитами. Фосфатидилинозитол-3,5-бисфосфат (PI(3,5)P₂) подавляет активность AtCLCa, что стимулирует закисление вакуолярного люмена [36]. Методом локальной фиксации потенциала на выделенных из клеток A. thaliana вакуолях продемонстрировано, что АТФ обратимо ингибирует транспортную активность AtCLCa. АДФ и АМФ не подавляют активность AtCLCa. С-конец белка AtCLCa, обращенный в цитозоль и содержащий два CBS-мотива, участвует в узнавании и связывании АТФ. Однако АМФ конкурирует с АТФ за сайт связывания AtCLCa, препятствуя ингибиторному эффекту АТФ. Подобного эффекта не обнаружено для АДФ. Аффинность нуклеотидов к белку AtCLCa убывает в ряду АТФ ≈ АМФ > АДФ. Сайт-направленный мутагенез AtCLCa, приводящий к замене аспартата на аланин (D753A), полностью нивелировал ингибиторный эффект АТФ, что свидетельствует о непосредственном участии аспартата в положении 753 в регуляторном связывании с АТФ. Таким образом, размер запасного пула нитрата, определяемого активностью AtCLCa, может регулироваться изменением отношения АТФ/АМФ, которое определяется скоростью метаболических процессов, например, фотосинтеза и ассимиляции нитрата [37].

AtCLCa принимает непосредственное участие в ближнем транспорте нитрата, осуществляя перенос этого аниона из цитоплазмы в вакуоль, а также в накоплении нитрата в целом растении. Нокаут-мутанты clca обладают ярко-выраженным фенотипом. Содержание нитрата при стандартной концентрации этого аниона в питательной среде (10−50 мМ) в корнях и надземных органах мутантов было в 2 раза ниже, а содержание нитрита и малата в 1.5–2 раза выше, чем у растений ДТ [33, 38]. Мутация clca приводит к перераспределению нитрата между внутриклеточными компартментами. Накопление нитрата снижается в вакуоли, и, соответственно, увеличивается концентрация ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в цитозоле клеток [39]. Предполагается, что увеличение содержания нитрата в клетках корня является индуктором экспрессии нитратного транспортера AtNRT1.5, участвующего в загрузке нитрата в ксилему, и подавляет экспрессию AtNRT1.8, отвечающего за обратное поступление нитрата в клетку из ксилемы [39]. В результате изменения экспрессии этих генов увеличивается содержание нитрата в ксилемном соке и в цитозоле клеток надземных органов мутанта clca, что вызывает повышение активности нитратредуктазы и глутаминсинтетазы. Повышение активности этих ферментов, в свою очередь, приводит к возрастанию эффективности утилизации азота (NUE – Nitrogen Use Efficiency) у мутантов clca по сравнению с растениями ДТ [18, 39] (рис. 3). Наряду с этим в корнях мутанта clca подавляется экспрессия генов нитратных транспортеров AtNPF6.3(NRT1.1), AtNRT2.1 и AtNRT-2.5, отвечающих за поглощение нитрата из почвы, что может быть следствием повышения концентрации нитрата и/или нитрита в цитозоле клеток корня [38].

Рис. 3.

Гипотеза, объясняющая участие транспортера AtCLCa в дальнем транспорте нитрата (по [39] с изменениями). AtCLCa отвечает за ближний транспорт нитрата, регулируя его распределение между вакуолью и цитозолем. Транспортеры AtNRT1.5 и AtNRT1.8 осуществляют транспорт нитрата в ксилему и из ксилемы, соответственно. При повышении концентрации ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в цитоплазме AtNRT1.5 загружает нитрат в ксилему, при снижении цитоплазматической концентрации ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ последний переносится из ксилемы в цитоплазму белком AtNRT1.8. Обозначения: НР – нитратредуктаза, ГС – глутаминсинтетаза.

Мутация clca приводит к изменению уровней экспрессии остальных генов семейства CLC, что, вероятно, связано с потребностью восстановить ионный баланс тканей. Экспрессия AtCLCb-AtCLCd, AtCLCf и AtCLCg возрастает в 2−10 раз, а экспрессия AtCLCe в 2−3 раза снижается. Механизмы, лежащие в основе зависимости экспрессии генов CLC и нитратных транспортеров от экспрессии AtCLCa, остаются невыясненными [38].

AtCLCa осуществляет не только компартментацию нитрата в вакуолях. Wege с соавторами показали, что во время закрывания устьиц, происходящего в ответ на действие АБК, через AtCLCa происходит обратный выход анионов из вакуоли в цитозоль [34]. Направление переноса ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ (вход/выход) через белок AtCLCa зависит от фосфорилирования/дефосфорилирования треонина в положении 38 (Thr³⁸) на N-конце AtCLCa, обращенном в цитоплазму. Thr³⁸ является основной мишенью киназы OST1 (Open Stomata1 kinase) и необходим для модуляции активности AtCLCa в ответ на действие АБК. Фосфорилирование Thr³⁸ киназой OST1 приводит к увеличению выходящего анионного тока через вакуолярную мембрану, что является необходимым условием для закрывания устьиц [34]. В этой работе, а также в фосфопротеомном исследовании [40] обнаружен второй сайт фосфорилирования AtCLCa (Ser⁴⁰) на N-конце, расположенный рядом с первым. Однако до настоящего времени функция Ser⁴⁰ не определена.

Направление анионного транспорта через AtCLC-a может регулироваться фосфатазой PP2A (Protein Phosphatase 2A). Показано взаимодействие каталитической субъединицы С5 этого фермента с AtCLCa [41]. Таким образом, AtCLCa осуществляет транспорт нитрата через тонопласт в двух направлениях: из цитоплазмы в вакуоль и из вакуоли в цитоплазму в зависимости от потребности клетки. Это означает, что физиологическая роль AtCLCa не сводится к созданию вакуолярного нитратного пула, этот белок участвует также в реутилизации накопленного ранее в вакуолях нитрата [42, 43]. AtCLCa также важен для регуляции устьичных движений, как открывания, так и закрывания устьиц.

AtCLCb – второй ${\text{NO}}_{3}^{ - }$/Н⁺-антипортер тонопласта, осуществляющий перенос нитрата через тонопласт. По аминокислотной последовательности AtCLCb в наибольшей степени сходен с AtCLCa [32].

Исследование экспрессии AtCLCb и активности промотора этого гена показало, что паттерны экспрессии AtCLCb отчасти совпадают с таковыми AtCLCa. Однако AtCLCb экспрессируется преимущественно на ранних стадиях развития растений. Наибольшая экспрессия наблюдается в гипокотиле, семядолях и корнях проростков, а также лепестках и тычиночных нитях цветков растений [19, 32].

Повышение концентрации нитрата в питательной среде приводит к небольшой индукции экспрессии AtCLCb [32]. Экспрессия AtCLCb значительно изменяется в течение суток. Количество транскриптов гена постепенно возрастает на протяжении всего темнового периода, достигая максимального значения в предрассветные часы (увеличивается в 20 раз), и затем снижается в течение светового периода до исходного уровня. Это может быть связано с участием AtCLCb в транспорте накопленного в течение ночи нитрата из вакуоли в цитоплазму для последующей ассимиляции этого аниона в световой период [32].

С помощью метода локальной фиксации потенциала было показано, что перенос анионов через AtCLCb сопряжен с противоположно направленным током протонов. Анионная проводимость AtCLCb убывает в ряду ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ > Br^– > Cl^– > малат^– = = I^– [32].

Нокаут-мутанты clcb не отличаются от растений ДТ по морфологическим признакам и содержанию ионов при выращивании растений на средах с разным ионным составом и при разной продолжительности фотопериода. На основании того, что у мутанта clcb повышена экспрессия гена AtCLCa [32], можно предположить, что отсутствие белка AtCLCb компенсируется бóльшим количеством AtCLCa. Вероятно, белок A-tCLCb, как и AtCLCa, участвует в накоплении нитрата в вакуолях [32].

По-видимому, активность AtCLCb модулируется путем фосфорилирования/дефосфорилирования аминокислотной последовательности. Показано, что серин в положении 39 (S³⁹) на N-конце AtCLCb является сайтом фосфорилирования [40]. Необходимо также отметить присутствие треонина в аминокислотной последовательности AtCLCb в положении 37 (Thr³⁷), аналогичного Thr³⁸ белка AtCLCa. Очень вероятно, что Thr³⁷ AtCLCb, так же как Thr³⁸ AtCLCa, является сайтом фосфорилирования протеинкиназы OST1 [34]. В работе [41] выявлено взаимодействие AtCLCb с субъединицей С5 фосфатазы PP2A. Вышеприведенные данные дают основание предположить, что AtCLCb, как и AtCLCa, может переносить нитрат в двух направлениях, регулируя его концентрацию в вакуоли и цитозоле в зависимости от внешних факторов, потребностей и физиологического состояния растительного организма. По-видимому, два ${\text{NO}}_{3}^{ - }$/Н⁺-антипортера тонопласта AtCLCa и AtCLCb могут функционально замещать друг друга.

AtCLCc – хлоридный транспортер тонопласта, локализованный преимущественно в устьичных клетках [30]. Обнаружено, что AtCLCc играет важную роль в регуляции движения устьиц, солеустойчивости растений и, вероятно, может участвовать в гомеостазе нитрата [30, 45]. Показано, что AtCLCc экспрессируется преимущественно в клетках устьиц и пыльце. Обработка эпидермы листьев АБК индуцирует экспресcию AtCLCc как в клетках эпидермы, так и в замыкающих клетках устьиц [30].

Нокаут-мутанты clcc (Col-0, Ws) отличаются нарушенной регуляцией устьичной проводимости при действии света и АБК. После 2 ч освещения апертура устьиц у мутантов была на треть меньше, чем у растений ДТ. Обработка АБК не приводила к закрыванию устьиц у мутанта. Вследствие нарушения регуляции движения устьиц температура листьев у clcc была выше, чем у растений ДТ. Содержание Cl^– в клетках устьиц у мутанта было меньше, по сравнению с таковым у растений ДТ [30].

Мутация clcc не влияет на развитие растений и их морфологию, а также на фертильность пыльцы. Однако мутанты clcc характеризуются повышенной чувствительностью к NaCl [30]. Надземные органы мутантных растений при засолении содержали больше хлорид-иона, чем растения ДТ [29].

QTL-анализ (Quantitative Trait Loci), направленный на поиск локусов хромосом, ответственных за накопление нитрата, показал, что AtCLCc может участвовать в гомеостазе этого аниона [45]. В подтверждение этому в побегах растений clcc A. thaliana экотипа No-0 было снижено содержание ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ и цитрата и увеличено содержание малата [45].

Белок AtCLCc (Col-0) содержит 2 сайта фосфорилирования, в частности серины S²⁷ и S⁶⁷² на N- и C-концах, соответственно [40, 46]. Фосфорилирование S⁶⁷² индуцировалось обработкой растений хлористым натрием [46]. Показано также взаимодействие N- (1-92) и C-(562-779) концевых частей белка AtCLCc с субъединицей С5 фосфатазы PP2A [41], что предполагает регуляцию активности AtCLCc за счет фосфорилирования/дефосфорилирования его аминокислотной последовательности.

AtCLCd был первым анионным транспортером растений, который обнаружили в компартментах, участвующих в эндоцитозном мембранном трафике. Показано, что AtCLCd находится в мембранах транс-Гольджи сети, где он колокализован с Н⁺-АТФазой V-типа, [19, 20, 27, 28]. Наиболее вероятно, AtCLCd вовлечен в регуляцию рН и концентрации хлорида в люмене транс-Гольджи сети и поздних эндосом. Предполагается, что этот белок участвует в транспорте Cl^– в эндосомальный люмен для компенсации накапливающихся там положительных зарядов вследствие функционирования H⁺-АТФазы и стимулирует этим закисление люмена, которое необходимо для эндоцитозного и секреторного процессов [20].

Активность промотора гена AtCLCd наблюдалась во всех органах и тканях, уровень активности промотора зависел от стадии развития и органа растений. Наиболее заметной активность промотора AtCLCd была в корнях и семядолях проростков, гидатодах и цветках, особенно в пыльниках и пыльце [20]. С помощью вестерн-блоттинга белок AtCLCd детектировали во всех органах, наибольшее количество этого белка было в стручках [27].

Нокаут-мутанты clcd не отличаются от растений ДТ по морфологии, ростовым параметрам и содержанию ионов при разных концентрациях Cl^– и ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в среде. Однако рост корней мутантов подавляется на слабо кислых средах (рН 6.8−6.2). Мутанты clcd характеризуются повышенной чувствительностью к блокатору Н⁺-АТФазы V-типа конканамицину А [20].

Обнаружено, что AtCLCd выполняет роль негативного регулятора PAMP-индуцируемого (Pathogen-Associated Molecular Pattern) иммунитета растений, по-видимому, за счет участия в трафике рецептора FLS2 (Flagellin-Sensitive 2) [47]. Мутанты clcd отличались большей устойчивостью к вирулентному штамму бактерий Pseudomonas syringae. Мутация clcd приводила к усиленным ранним и поздним ответам при действии элиситоров (flg22, elf18 или хитина). Обработка элиситорами привела к повышению уровня АФК в тканях и большему отложению каллозы у мутанта clcd по сравнению с растениями ДТ. Вместе с этим, экспрессия PAMP-индуцируемых генов (FRK1 – Flg22-induced Receptor-like Kinase 1, At1g51890, At2g17740), а также гена позднего ответа (PR1 – Pathogenesis-Related gene 1) значительно возрастала у мутанта clcd после обработки flg22 по сравнению с растениями ДТ. Сверхэкпрессия AtCLCd в растениях A. thaliana привела к противоположным эффектам, растения становились более восприимчивыми к действию патогена. Показано, что экспрессия AtCLCd регулируется сигнальными комплексами, включающими PAMP-распознающий рецептор FLS2 и киназы SERK3 и SERK4 (Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase). Связывание элиситоров с этими комплексами приводит к подавлению экспрессии как AtCLCd, так и остальных представителей семейства CLC A. thaliana [47].

AtCLCe локализован в тилакоидных мембранах хлоропластов [28]. Исследование флуоресценции хлорофилла у мутантов clce и растений ДТ выявило участие белка AtCLCe в световых реакциях фотосинтеза [19, 28]. При этом мутация clce не влияла на параметры роста растений [28]. Исследования кинетики индукции флуоресценции и темновой релаксации возбужденного состояния хлорофилла a продемонстрировали у мутанта clce лишь незначительные изменения в свето-зависимом переносе е^– в ЭТЦ хлоропластов. У мутантов, однако, наблюдались изменения в соотношении электрической (Δψ) и химической (ΔрН) составляющих протондвижущей силы (Δρ), которая формировалась на свету, а также нарушения в ультраструктуре хлоропластов [48]. Авторы высказали предположение, что AtCLCe участвует в экспорте хлорид-иона из тилакоидного люмена при переходе от условий освещения к темноте и играет лишь второстепенную роль в транспорте Сl^– в люмен тилакоидов в световых реакциях фотосинтеза [48].

Кроме того, имеются данные, свидетельствующие об участии белка AtCLCe в гомеостазе нитрата. Мутация clce приводит к фенотипическим проявлениям, сходным с таковыми у мутантных растений clca. Мутанты clce характеризуются пониженным содержанием нитрата и повышенным содержанием нитрита и малата по сравнению с растениями ДТ. На возможное участие белка AtCLCe в гомеостазе нитрата указывают также данные, которые были получены при поиске у A. thaliana локусов хромосом, ответственных за накопление нитрата (QTL-анализ) [45]. Тем не менее функции белков AtCLCa и AtCLCe не дублируют друг друга, на что указывает участие AtCLCe в процессах ионного гомеостатирования тилакоидов [38]. Ген AtCLCe экспрессируется, главным образом, в надземных органах – листьях, розетках и стручках. Уровень экспрессии AtCLCe сопоставим с уровнем экспрессии AtCLCf и значительно ниже, чем уровень экспрессии генов AtCLCa-AtCLCd [19, 38]. Высказано предположение, что существует взаимодействие (“cross-talk”) между генами AtCLCe, AtCLCa и генами семейств нитратных транспортеров [38].

AtCLCf локализован преимущественно в цис-Гольджи компартментах и в меньшем количестве – в транс-Гольджи сети [28]. Комплементация геном AtCLCf мутантного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Δgef1 (мутант по единственному гену семейства CLC в этом организме, кодирующему Cl^– транспортер Gef1p) показала, что продукт гена AtCLCf также, по-видимому, транспортирует хлорид-ионы [28]. AtCLCf экспрессируется во всех органах A. thaliana [19]. Согласно результатам этой же работы, содержание транскриптов гена AtCLCf в органах зависит от возраста растений, оно увеличивается в ходе онтогенеза. Предполагается участие этого белка во внутриклеточном везикулярном трафике через его вовлечение в ионное гомеостатирование аппарата Гольджи и транс-Гольджи сети. Функция AtCLCf может отчасти совпадать с функцией AtCLCd [28]. Наряду с этим, имеются данные QTL-анализа, свидетельствующие о возможном участии продукта гена AtCLCf в накоплении нитрата у A. thaliana [45]. A-tCLCf остается наименее изученным на сегодняшний день белком семейства AtCLC, не до конца выяснены его транспортная функция и физиологическая роль.

AtCLCg локализован в тонопласте и может участвовать в депонировании Сl^– в вакуоли при солевом стрессе [19, 29]. Нокаут-мутанты по этому гену имеют ярко выраженный фенотип. Параметры роста – сырая масса, длина корня, количество боковых корней – у мутантов clcg снижены по сравнению с растениями ДТ при выращивании на засоленных средах. Мутанты накапливают больше Сl^– в надземных органах и SO₄^2- в корнях в условиях засоления [29].

AtCLCg по аминокислотной последовательности наиболее сходен с AtCLCc. Экспрессия AtCLCg подавляется в мутанте clcc, и наоборот, экспрессия AtCLCс снижается в мутанте clcg, что предполагает взаимодействие этих генов [29]. Физиологические функции белков AtCLCg и AtCLCс не дублируют друг друга, каждый из них вносит свой специфический вклад в солеустойчивость растения: двойной мутант clccclcg не отличается повышенной чувствительностью к NaCl по сравнению с мутантами по одному из генов, clcc или clcg [29].

Наибольшая активность промотора AtCLCg наблюдается в клетках мезофилла, флоэме, в клетках паренхимы зоны корневых волосков, гидатодах и прилегающих к ним зонах листовой пластинки. Высокая активность промотора AtCLCg в гидатодах может свидетельствовать об участии AtCLCg в экскреции Cl^–-ионов во внешнюю среду в условиях засоления. Наличие активности промотора гена в клетках флоэмы наряду с высоким содержанием хлорида в побегах мутантов дают основание предположить, что AtCLCg может быть вовлечен в рециркуляцию Cl^–. Возможно также участие этого белка в загрузке ксилемы хлоридом. AtCLCg в клетках паренхимы корня, расположенных в зоне корневых волосков, может регулировать цитозольную концентрацию Cl^– и способствовать компартментации этого аниона в вакуоли в условиях засоления [29].

СЕМЕЙСТВО CLC БЕЛКОВ У ДРУГИХ РАСТЕНИЙ

Полноразмерные последовательности генов семейства CLC клонированы не только из A. thaliana, но также и из ряда других растений: табака (Nicotiana tabacum) [21, 49, 50], риса (Oryza sativa) [51, 52], сои (Glycine max) [16, 53], (Glycine soja) [16], кукурузы (Zea mays) [54–56], понцируса трехлисточкового (Poncirus trifoliate) [57, 58], солеисключающего галофита Thellungiella halophila [59] и э-угалофита Suaeda altissima [60, 61].

Первым клонированным геном CLC из растений был NtCLC1, продукт которого близок по аминокислотной последовательности AtCLCc [49]. NtCLC1 экспрессировался во всех органах N. tabacum. Наибольшая экспрессия наблюдалась в стеблях. Белок NtCLC1, экспрессированный в ооцитах лягушки, опосредовал медленно активируемый входящий ток в ответ на гиперполяризацию плазматической мембраны и был проницаем для Сl^–, ${\text{NO}}_{3}^{ - }$, I^–, Br^– и в меньшей степени для малата, ${\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$ и глутамата [49, 50]. Белок NtCLC1 локализован в эндоплазматичеком ретикулуме (ЭПР) и, как показали эксперименты с pH-чувствительным флуоресцентным красителем pHluorin, слитым с тетрапептидом HDEL (pHluorin-HDEL), удерживающим белки в ЭПР, участвует в регуляции pH люмена ЭПР, приводя к его защелачиванию [21]. С помощью секретируемой формы GFP (secGFP) было продемонстрировано участие NtCLC1 в секреции белков [21]. Промоторную активность NtCLC-1 детектировали во всех органах растений. Вероятно, NtCLC1 участвует в росте и развитии растений. Об этом свидетельствует тот факт, что высота растений и размер цветков двойного нокаут-мутанта nbclca nbclcb по гомологичным NtCLC1 генам близкородственного вида N. benthamiana меньше, чем у растений ДТ [21]. NtCLC1 вовлечен также в вирусный патогенез растений табака. Показано взаимодействие NtCLC1 с белком 6К2 потивируса PVY (Potato virus Y). Предполагается, что вирус PVY, связываясь с транспортером NtCLC1, активирует последний, что вызывает изменение рН люмена ЭПР и последующее образование из ЭПР вирус-содержащих везикул, доставляющих вирусные частицы к плазмалемме и способствующих этим системной инфекции [21].

Связь белков семейства CLC c вирусным патогенезом была обнаружена также у растений томата Solanum lycopersicum, пораженных вироидом веретеновидности клубней картофеля. Транскрипция гомолога AtCLCb у томата, SlCLCb, замалчивалась малыми РНК вироида за счет деградации мРНК SlCLCb [62]. Вирус-индуцируемый сайленсинг SlCLCb вызывал замедление роста и курчавость листьев [62], что предполагает важную роль белка SlCLCb в росте и развитии растений. Однако функцию SlCLCb на клеточном уровне еще предстоит изучить.

В геноме N. tabacum, кроме вышеописанного NtCLC1, обнаружено еще 16 генов семейства CLC, NtCLC2-NtCLC17 [17]. Однако транскрипты пяти из них (1, 4, 11, 14, 16) не были обнаружены в органах и тканях растений в этой работе. Гены 6, 7, 9, 10, 17 экспрессировались главным образом в стебле, 3, 5, 8, 12, 13 – в почках, 15 – в пестике. В условиях солевого стресса количество транскриптов всех генов возрастало в надземных органах, а генов 2, 3 и 12 также в корнях. Подавление в растениях N. benthamiana экспрессии генов, гомологичных генам 2 и 13 из N. tabacum, привело к снижению и увеличению, соответственно, содержания хлорида в надземных органах [17], что предполагает участие этих генов в дальнем транспорте Сl^–-иона.

Из риса (O. sativa) клонировано 2 гена семейства CLC, OsCLC-1 и OsCLC-2, гомологичных гену NtCLC1. OsCLC-1 экспрессировался во всех тканях, тогда как OsCLC-2 – только в корнях, узлах и междоузлиях стебля, а также в листовом влагалище. Белки OsCLC-1 и OsCLC-2 локализованы в тонопласте и участвуют в транспорте Сl^– через вакуолярную мембрану [52]. Эти белки важны для роста и развития растений риса, на что указывает подавление роста нокаут-мутантов по генам OsCLC-1 и OsCLC-2. Уровень транскриптов OsCLC-1 возрастал в корнях и листьях проростков риса при наличии в среде NaCl, экспрессия OsCLC-2 не зависела от присутствия NaCl в среде. Высказано предположение, что OsCLC-1 участвует в процессах, ответственных за солеустойчивость растений, осуществляя, по-видимому, компартментацию ионов Сl^– в вакуоли [52]. Физиологическая роль OsCLC-2 остается невыясненной.

Семейство хлоридных каналов полностью клонировано из умеренно-солеустойчивого культурного вида сои G. max и солеустойчивого дикорастущего вида сои G. soja [16]. Оно включает 8 генов: CLC1, b1, b2, c1, c2, d1, d2 и g. Все гены семейства CLC G. max и G. soja экспрессировались в корнях, стеблях и листьях растений. Индукция экспрессии CLC1, b1, b2, c1 и c2 в условиях солевого шока в органах сои предполагает участие продуктов этих генов в процессах, ответственных за формирование свойства солеустойчивости [16].

GmCLC1 более детально был исследован в работах [53, 63, 64]. В электрофизиологических экспериментах с использованием ооцитов лягушки установлено, что GmCLC1 является Сl^–/Н⁺-антипортером. Белок GmCLC1 локализован в тонопласте, участвует в компартментации ионов Сl^– в вакуолях клеток и играет важную роль в солеустойчивости этого вида растений. GmCLC1 транспортирует Сl^– и ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ [16, 63]. Экспрессия GmCLC1 повышает солеустойчивость трансгенных растений A. thaliana за счет снижения поступления иона Сl^– в надземные органы [64]. Повышенная устойчивость к солевому стрессу наблюдалась также в растениях тополя, экспрессирующих GmCLC1 [65].

GsCLCc2 является потенциал-зависимым, вакуолярным транспортером, участвующим в переносе Сl^– в вакуоль и вносящим вклад в устойчивость растений G. max к солевому стрессу. Проводимость GsCLCc2 убывала в ряду Br^– ≥ I^– > Сl^– > ${\text{NO}}_{3}^{ - }$. Трансгенные растения G. max с оверэкспрессией GsCLCc2 отличались большей солеустойчивостью [16]. Несмотря на присутствие в последовательности белка GsCLCc2 обоих консервативных глутаматов, перенос ионов, опосредованный этим транспортером, не зависел от рН. GsCLCc2 функционировал как анионный канал [16].

Клонированы полноразмерные кодирующие последовательности генов белков ZmCLCc и ZmCLCd из кукурузы [54–56]. ZmCLCc локализован в митохондриях. Предполагается, что ZmCLCc участвует в транспорте Сl^–, на что указывает снижение потоков Сl^– и I^– через внутреннюю мембрану митохондрий антителами к этому белку. Показано также вовлечение ZmCLCc в обеспечение устойчивости Z. mays к низким температурам. Установлено, что холодовой стресс индуцирует экспрессию этого белка в проростках кукурузы. Экспрессия ZmCLCc была выше у линий кукурузы, отличавшихся большей холодоустойчивостью при прорастании семян и развитии растений [54].

Было обнаружено, что ZmCLCd экспрессируется в листьях, корнях и стеблях. Наибольший уровень транскрипции ZmCLCd наблюдался в листьях. Растения A. thaliana со сверхэкспрессией ZmCLCd отличались повышенной устойчивостью к холодовому стрессу, засолению, засухе и окислительному стрессу [56]. Транспортная функция и локализация ZmCLCd не исследованы до настоящего времени.

Шесть генов семейства CLC, PtrCLC1-PtrCLC6, обнаружены в геноме понцируса трехлисточкового P. trifoliate и клонированы [57, 58]. Гены PtrCLC экспрессируются во всех тканях, наибольшая экспрессия была в листьях, наименьшая – в корнях, а также экспрессия PtrCLC изменялась в ответ на варьирование концентраций нитрата в среде и на засоление [58]. Гетерологичная экспрессия PtrCLC2 в растениях A. thaliana дикого типа и нокаут-мутанта clcc приводила к повышению солеустойчивости трансгенных растений по сравнению с нетрансформированными растениями за счет снижения содержания Сl^–-иона в побегах. Предполагается, что белки семейства PtrCLC вовлечены в ${\text{NO}}_{3}^{ - }$- и Сl^–-гомеостатирование [57].

Из солеисключающего галофита Thellungiella halophila – растения, как и A. thaliana, принадлежащего семейству Brassicaceae, клонирован ген ThCLC-a [59]. ThCLC-a локализован в вакуолярной мембране, где он, по-видимому, участвует в транспорте ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ через тонопласт и накоплении этого аниона в вакуолях. ThCLC-a экспрессировался во всех органах галофита, уровень его экспрессии в корнях был выше, чем в побегах. Экспрессия ThCLC-a индуцировалась в ответ на добавление ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в среду культивирования. Содержание ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ было снижено в побегах и корнях растений T. halophila c пониженной экспрессией ThCLC-a по сравнению с растениями ДТ. Содержание ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в тканях у растений A. thaliana со сверхэкспрессией ThCLC-a было больше, чем у растений ДТ в условиях дефицита ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ [59].

Секвенирование транскриптома листьев соле- и засухоустойчивого растения Arabidopsis pumila позволило идентифицировать гены ApCLCa, ApCLCс и ApCLCd. На основании того, что экспрессия A-pCLCa значительно индуцировалась в ответ на солевой стресс, предполагается участие продукта этого гена в формировании свойства солеустойчивости A. pumila [66].

Клонированы два гена, SaCLCa1 и SaCLCc1, семейства хлоридных каналов из эугалофита Suaeda altissima [60, 61]. Белок SaCLCc1 участвует в транспорте Сl^– [60], а SaCLCa1, вероятно, – в транспорте ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ [61]. Экспрессия SaCLCc1 в клетках мутанта Δgef1 S. cerevisiae приводила к комплементации мутации (восстановлению роста мутанта на селективных средах) [60], в то время как экспрессия S-aCLCa1 – не приводила. Замена пролина в селективном фильтре SaCLCa1 на серин (P188S) привела к частичному восстановлению роста клеток Δgef1 [61]. SaCLCa1 и SaCLCc1 экспрессируются в корнях и листьях S. altissima. Экспрессия SaCLCa1 индуцировалась в корнях дефицитом нитрата в среде или засолением среды хлористым натрием, что предполагает участие SaCLCa1 в регуляции поступления ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в надземные органы. Экспрессия SaCLCc1 возрастала в листьях в ответ на засоление NaCl, что может быть связано с участием SaCLCc1 в накоплении Сl^– в надземных органах [61].

В геноме Cucumis sativus идентифицированы гены CsCLCa, CsCLCc и CsCLCg, гомологичные генам вакуолярных белков AtCLCa, AtCLCc и AtCLCg [67]. В корнях наибольший уровень экспрессии наблюдали у CsCLCa и CsCLCg, наименьший – у CsCLCc. Дефицит ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в среде подавлял экспрессию CsCLCa и CsCLCg и не влиял на экспрессию CsCLCc. Внесение ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в питательную среду растений, выращивавшихся при дефиците NO₃, приводило к индукции CsCLCa и CsCLCc в корнях [67]. Предполагается, что CsCLCa играет ведущую роль в накоплении ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в вакуолях клеток огурца [67], как это показано и для AtCLCa.

В геноме чайного растения Camellia sinensis обнаружено 8 представителей семейства CLC – C-sCLC1-8 [68]. Предполагается участие белков семейства CLC в накоплении ионов F^– в листьях C. sinensis, обладающего устойчивостью к этому аниону и относящегося к гипераккумуляторам фторид-ионов [68]. Результаты исследования экспрессии генов CsCLC при обработке растений ионами Сl^– или F^– позволяют предположить, что CsCLC4-8, CsCLC6 и CsCLC7 участвуют в транспорте и депонировании в вакуолях Сl^–, а C-sCLC1-3 – фторид-иона. Однако необходимы дальнейшие исследования для подтверждения предполагаемых функций белков CsCLC [68].

В геноме аллотетраплоидного рапса Brassica napus (B. rapa x B. oleracea) обнаружено 22 гена семейства CLC: BnaCLCa1-4, BnaCLCb1-4, BnaCLCc1-4, BnaCLCd1-2, BnaCLCe1-2, BnaCLCf1-4, BnaCLCg1-2 [18]. Идентифицирована их экзон-интронная структура, выявлены предполагаемые цис-действующие элементы в промоторах генов этого семейства и консервативные мотивы соответствующих им белков [18]. По-видимому, белки BnaCLCa и BnaCLCb, аналогично белкам AtCLCa и AtCLCb, играют важную роль в гомеостазе нитрата. Так же как AtCLCa, экспрессия BnaCLCa1-4 индуцировалась в корнях и побегах при добавлении ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в среду. BnaCLCa3 отводится ведущая роль в транспорте ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ через вакуолярную мембрану, как это предполагается для AtCLCa, поскольку экспрессия этого гена в ответ на добавление ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ возрастала больше, чем экспрессия других генов BnaCLCa [18]. Внесение нитрата в среду индуцировало также экспрессию BnaCLCb в побегах. Следует отметить, что в корнях в условиях дефицита ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в среде экспрессия генов BnaCLCb1, BnaCLCb3 и BnaCLCb4 была на высоком уровне и снижалась в ответ на добавление к среде ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ [18]. В корнях экспрессия BnaCLCb4 также индуцировалась у линии B. napus с высоким NUE в условиях дефицита нитрата в среде [69].

В таблице 1 суммированы вышеприведенные данные о белках семейства CLC у A. thaliana и других растений.

ПРЕДПОЛАГАЕМОЕ УЧАСТИЕ Cl^–/H⁺-АНТИПОРТЕРОВ ЭНДОСОМ В ПРОЦЕССАХ, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ К NaCl

Локализованные в эндосомальных мембранах Cl^–/H⁺- и Na⁺/H⁺-антипортеры, такие, например, как AtCLCd, AtCLCf [20, 27, 19, 28 ], AtNHX5 и AtNHX6 [70] могут быть непосредственно вовлечены в Cl^–- и Na⁺-гомеостатирование цитоплазмы клеток растений в условиях солевого стресса. Эндосомы, поглощающие ионы Cl^– и Na⁺ с помощью Cl^–/H⁺- и Na⁺/H⁺-антипортеров, могут сливаться с тонопластом и/или плазмалеммой, экспортируя Cl^– и Na⁺, соответственно, в вакуоль и/или апопласт.

Активность электрогенного Cl^–/H⁺-антипортера была продемонстрирована нами во фракции, обогащенной мембранами аппарата Гольджи (АГ), выделенной из корня эугалофита S. altissima [71]. Как было показано с помощью флуоресцентного pH-индикатора пиранина, загруженного в везикулы, и сафранина О, индикатора электрического потенциала (∆ψ), при создании на выделенных везикулах концентрационного градиента Cl^– (∆рCl), направленного из наружной среды в везикулярный люмен, происходил выход H⁺ наружу (защелачивание люмена) и генерация ∆ψ, отрицательного внутри везикул. Поддержание длительного ∆рCl-зависимого транспорта H⁺ из везикул требовало присутствия в среде проникающих катионов, тетрафенилфосфония⁺ или трис⁺, которые нейтрализовывали отрицательные заряды, поступающие в везикулярный люмен в ходе Cl^–/H⁺-обмена [71].

В соответствии с предполагаемым везикулярным транспортом Cl^– и вовлечением в этот процесс Cl^–-транспортеров, электронно-микроскопические исследования ультраструктуры клеток S. altissima обнаружили в цитоплазме клеток растений, выращенных в условиях засоления, интенсивное образование мембранных структур разного размера, в том числе мультивезикулярных тел. Больше всего их скапливалось в зонах, прилегающих к тонопласту и плазмалемме. Методом электронной цитохимии, основанном на формировании электронно-плотных гранул AgCl после обработки тканей ионами серебра, в этих же зонах была обнаружена аккумуляция Cl^–, что, возможно, указывает на стимулированное хлористым натрием слияние наружной мембраны Cl^–-содержащих эндосом с тонопластом и плазмалеммой [72].

Стимуляция образования мембранных структур в цитоплазме под действием NaCl и их слияние с вакуолями было показано также в клетках интактных растений и суспензионной культуры A. thaliana [73–76], суспензионных культур мангрового растения Bruguiera sexangula и ячменя [77] и в клетках интактного растения Chenopodium a-lbum [78]. Существенный вклад в их формирование вносили мембраны АГ и пост-Гольджи везикулы – именно те структуры, в которых были локализованы AtCLCd [20], AtNHX-5, AtNHX-6 [70].

Выше приведенные данные предполагают следующий механизм согласованного функционирования Cl^–/H⁺-антипортера, Na⁺/H⁺-антипортера и H⁺-АТФазы V-типа в эндосомах (рис. 4). V‑АТФаза транспортирует Н⁺ внутрь эндосом, в результате чего на эндосомальной мембране образуются концентрационный градиент Н⁺ (ΔрН) и электрический потенциал (Δψ). Для поддержания работы АТФазы необходимо нейтрализовывать положительные заряды, накапливающиеся на внутренней стороне эндосомальных мембран. Эту функцию выполняет Cl^–/H⁺-антипортер, переносящий внутрь везикул отрицательно заряженные хлорид-ионы, а в обратном направлении положительно заряженные протоны. В результате создаваемый АТФазой Δψ конвертируется в ΔрН. Последний используется как источник энергии электронейтральным Na⁺/H⁺-антипортером для аккумуляции ионов Na⁺ ранними эндосомами, которые после созревания в поздние эндосомы переносятся к соответствующей мембране-акцептору и, сливаясь с ней, экспортируют Na⁺ и Cl^– из цитоплазмы. Вовлечение пост-Гольджи структур в различные ветви везикулярного транспорта, по-видимому, играет важную роль в Cl^–- и Na⁺-гомеостатировании цитоплазматических органелл в условиях солевого стресса. Известно, что транс-Гольджи сеть является клеточным компартментом, в котором пересекаются эндоцитозный и секреторный пути; через транс-Гольджи сеть осуществляется рециркуляция эндоцитозных везикул к плазмалемме; первичные транспортные везикулы, образующиеся из плазмалеммы при эндоцитозе, сливаются также с мембранами транс-Гольджи сети. Часть ранних эндосом и продуктов их слияния с транспортными везикулами созревает в поздние эндосомы (ПЭ) /мультивезикулярные тела (МВТ)/превакуолярные компартменты (ПВК), отсортировывая мембранные белки и липиды для доставки в тонопласт или плазмалемму, а часть белков и липидов в вакуолярный люмен или периплазматическое пространство [79–81]. Ионы Na⁺ и Cl^–, поглощенные клеткой в условиях солевого стресса, могут быть компартментализованы структурами транс-Гольджи сети и ее производными при участии эндосомальных форм ионных транспортеров, таких как AtCLCd [20], AtNHX-5, AtNHX-6 [70], и экспортированы затем из цитоплазмы эндосомами в вакуоль или периплазматическое пространство.

Рис. 4.

Предполагаемый механизм вовлечения эндосомальных форм ионных транспортеров в экспорт Cl^– и Na⁺ из цитоплазмы в вакуоль. Ранние эндосомы накапливают Cl^– и Na⁺ в результате согласованного функционирования эндосомальных форм Cl^–/H⁺-антипортера, Na⁺/H⁺- антипортера и H⁺-АТФазы V-типа и созревают в поздние эндосомы. Наружная мембрана поздних эндосом сливается с тонопластом, доставляя Cl^– и Na⁺ в вакуоль. В нижней левой части рисунка изображена ранняя эндосома, в мембране которой функционируют Cl^–/H⁺-антипортер, Na⁺/H⁺- антипортер и H⁺-АТФаза V-типа. В верхней правой части рисунка изображена поздняя эндосома на стадии слияния ее наружной мембраны с тонопластом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенные в обзоре данные свидетельствуют о вовлечении белков семейства CLC у растений во множество процессов и физиологических функций. Важнейшим из них является нитратное и хлоридное гомеостатирование, участие белков CLC в котором на уровне клетки и целого организма хорошо доказано. ${\text{NO}}_{3}^{ - }$- и Cl^–-гомеостатирование необходимо для роста и развития растений, а также для обеспечения устойчивости растений к хлоридному засолению, водному дефициту и другим неблагоприятным факторам среды. Одной из важнейших задач является поиск и исследование изоформ CLC, локализованных в мембранах АГ и пост-Гольджи везикул и участвующих таким образом в везикулярном транспорте ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ и Cl^– в клетке. Подавляющая часть исследований транспорта NO₃^– и Cl^– белками CLC проведена на модельном растении A. thaliana. Функции и физиологическая роль представителей семейства CLC у других растений только начинают изучаться. Имеются лишь отрывочные сведения об участии этих белков в распределении ионов ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ и Cl^– в системе целого растения. До конца непонятен механизм, с помощью которого белки CLC регулируют трансмембранный электрический потенциал (Δψ) и рН люменов органелл у растений, включая A. thaliana, а также у дрожжей. Имеющиеся на этот счет сведения и выдвинутые на их основе гипотезы противоречивы. Необходимость исследования механизмов, с помощью которых такая регуляция осуществляется, представляется очевидной. Регуляция рН люменов цитоплазматических компартментов, в частности транс-Гольджи сети, ответственной за внутриклеточное распределение белков (sorting), чрезвычайно важна для везикулярного транспорта. Последний играет ключевую роль в ремоделировании белкового и липидного состава мембран, которое происходит в ответ на внутренние и внешние стимулы. К последним относятся стрессовые факторы биотической и абиотической природы. Регуляция везикулярного транспорта белками семейства CLC поэтому является важной составляющей процессов, определяющих устойчивость растений к этим факторам. Исследование роли белков семейства CLC в регуляции везикулярного транспорта является одной из актуальных задач клеточной физиологии.

Авторы выражают благодарность д.б.н., в.н.с. лаборатории транспорта ионов и солеустойчивости ИФР РАН Поповой Л.Г. за критическое чтение рукописи, сделанные замечания и рекомендации.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.