Физиология растений, 2020, T. 67, № 5, стр. 470-474

ВВЕДЕНИЕ

В природных условиях в течение дня растения существуют в различных световых условиях, характеризующихся не только различной энергией падающей радиации, но также и различием спектров [1, с. 21–22; 2, с. 13]. В утренние часы отношение I₆₆₀/I₇₃₀ имеет значение около 1.5, а в послеполуденный период ≤ 1.0. Это, вероятно, может способствовать большей степени активации фитохромной системы в начале светового дня. Переход фитохрома из Фх_КС в Фх_ДКС форму под действием света с длиной волны 660 нм служит регуляторным триггером ряда сложных физиологических процессов, таких как прорастание семян, цветение, плодоношение и др. [3, 4]. Фитохромный контроль также осуществляется и в отношении действия различных стрессовых факторов: пониженных и высоких температур, засухи, УФ-радиации, засоления и сопровождающего их увеличения продукции Н₂О₂ в хлоропластах и при восстановлении кислорода в дыхательных процессах [4–6]. Значительно меньше известно исследований о регуляции ферментов углеродного метаболизма как в восстановительном, так и в окислительном направлениях. Ранее в наших исследованиях было показано, что восстановительная фаза цикла Кальвина находится под положительным контролем фитохрома [7]. С другой стороны, в ряде работ на растительных митохондриях из различных объектов обнаружена отрицательная регуляция активности сукцинатдегидрогеназы через ФхА [8, 9], а также переключение транспорта электронов на альтернативную оксидазу [10], приводящее к снижению продукции пероксида водорода в митохондриях. Снижение пропускной способности ЦТК под действием КС на фоне интенсификации восстановительной фазы ВПФЦ неизбежно ставит вопрос об активности в этих условиях процессов, поставляющих субстрат в митохондрии (ацетил-КоА). Одним из главных поставщиков углерода в цикл Кребса является гликолиз с его энерготрансформирующим ферментом D-глицеральдегид-3-фосфат:НАД⁺ оксидоредуктазой (КФ 1.2.1.12).

Цель работы – выяснение возможного влияния фитохром-активного облучения целого растения на активность цитоплазматической НАД-ФГА-ДГГ, энергетических и временны́х параметров этого процесса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. В экспериментах использовали 15-дневные проростки пшеницы (Triticum aestivum L), которую выращивали на белом свету (16 ч фотопериод и интенсивность света 200 мкмоль квантов/(м² с)) при температуре 20–22/18°С и относительной влажности воздуха 60–70%. Субстратом для выращивания растений служил тщательно промытый песок с питательным раствором Кнопа.

Облучение монохроматическим светом. Для контролируемого и строго дозируемого облучения целых растений красным (КС) и дальним красным (ДКС) светом использовали матрицы светодиодов. Спектральные характеристики излучателей были измерены с помощью спектрометра S100 (“Solar Laser Systems”, Беларусь). Были получены величины для КС: λ_max = 656 нм, λ_1/2 = 26 нм, I = 80 мкмоль квантов/(м² с) и для ДКС: λ_max = 737 нм, λ_1/2 = 30 нм, I = 30 мкмоль квантов/(м² с). Дозирование КС осуществляли с помощью варьирования времени облучения, 1 мин = = 0.88 кДж/м². ДКС облучали в течение 20 мин (5.84 кДж/м²).

Измерение ферментативной активности. Измерение активности сопряженной системы ферментов (КФ 2.7.2.3 – фосфоглицераткиназа и КФ 1.2.1.12 – глицеральдегид фосфат НАД-оксидоредуктаза) цитоплазматического НАД-зависимого ФГА-дегидрогеназного комплекса (в направлении реакций 3-ФГК → 1,3-бисФГК → 3-ФГА) проводили в суммарном белковом экстракте из листьев пшеницы. Для этого среднюю часть второго листа (100 –150 мг) гомогенизировали при температуре 4–6°С в HEPES-KOH буфере (рН 7.6), содержащем 2 мМ MgSO₄, 1 мМ ЭДТА*Na₄, 5 мМ ДТТ и 0.5% нерастворимого ПВП. Центрифугирование при 10 000 g длилось 20 мин. Реакцию проводили по стандартной методике [11, с. 111] с небольшой адаптацией к измерению активности в суммарном белковом экстракте в среде HEPES-KOH буфера (рН 7.6), содержащей 2 мМ MgSO₄, 1 мМ АТФ, 5 мМ 3-ФГК и 0.2 мМ НАД*Н на спектрофотометре GENESYS 10 (“Termo Spectronic”, США). Скорость реакции выражали в микромолях окисленного НАД*Н за 1 мин на 1 г свежего веса листа (СВЛ). Фоновое окисление НАД*Н в реакционной смеси, содержащей все, кроме 3-ФГК, составляло 0.05–0.07 мкмоль/(мин г СВЛ) и было постоянным во всех вариантах эксперимента.

Статистическую обработку данных и построение графиков осуществляли с помощью SigmaPlot 11.0. Результаты представлены как среднее значение из трех биологических (выращивание растений) и 3–4 аналитических (получение суммарного белкового экстракта) повторностей в каждой биологической со среднеквадратической ошибкой. Латинскими буквами обозначено статистически достоверное отличие результатов при P < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Измерения активности ФГА-дегидрогеназного (ДГГ) ферментного комплекса сразу после темнового периода показали 6.0−7.0 мкмоль окисленного НАД*Н/(мин г СВЛ). После облучения КС в течение 20 мин (17.6 кДж/м²) адаптированных в темноте растений, регистрировали снижение активности фермента, в среднем, до 5.0–6.0 мкмоль окисленного НАД*Н/(мин г), что составляло, в среднем, снижение на 25−40% от темнового контроля. При последовательном экспонировании растений на КС и ДКС (20 минут) активность ферментного комплекса не отличалась от темнового варианта измерений (рис. 1).

Рис. 1.

Активность ФГА-дегидрогеназного комплекса (% от темнового варианта) в суммарном белковом экстракте вторых листьев пшеницы после 8-часовой адаптации в темноте, после облучения нативных растений красным светом (КС) и дальним красным светом (20 мин ДКС) сразу после КС.

Далее необходимо было исследовать зависимость активности ферментного комплекса от дозы КС-облучения. Этот параметр показывает, имеет ли процесс сигнальную природу и насколько он энергоемкий. В листьях растений, экспонированных на белом свету в течение 2–3 ч после темнового периода, активность ФГА-ДГГ комплекса была на 10−15% ниже, чем в листьях, адаптированных к темноте в течение 8 ч. При облучении растений КС в течение минимально возможного в эксперименте времени (5 мин, 4.4 кДж/м²) регистрировали снижение активности ферментной системы на 18−20% (рис. 2). При увеличении времени КС-обработки растений до 10 (8.8 кДж/м²), 15 (13.2 кДж/м²) и 20 мин (17.6 кДж/м²) наблюдалось дальнейшее линейное снижение активности ферментной системы вплоть до 60% от контрольной величины. Более длительное действие фитохром-активной радиации (30 мин, 26.4 кДж/м² и дольше) не давало никаких дополнительных изменений в исследуемой системе.

Рис. 2.

Активность ФГА-дегидрогеназного комплекса (% от темнового варианта) в суммарном белковом экстракте вторых листьев пшеницы после 8-часовой адаптации в темноте и облучения различными дозами красного света (в течение 5, 10, 15, 20 и 30 мин) растений, адаптированных в темноте.

Существенной характеристикой модифицированного фитохромной системой функционирования фермента является время полужизни его модифицированного состояния. Этот параметр наряду с данными дозовой зависимости процесса может характеризовать последовательность молекулярно-биохимических процессов, которые приводят к изменению активности того или иного фермента: затрагиваются ли какие-то реакции транскрипции и трансляции фермента, на что тратится значительное количество времени, или модуляция активности происходит на каком-то посттрансляционном этапе, как это было показано для пероксидазы [12]. Мы осуществили серию экспериментов, в которых измеряли активность ФГА-ДГГ комплекса сразу после облучения максимально эффективной дозой КС (17.6 кДж/м²) и спустя определенные периоды времени в темноте после КС-облучения (рис. 3). Как и в других сериях, облучение КС приводило к подавлению ферментативной реакции 3-ФГК → → 1,3-бисФГК → 3-ФГА приблизительно на 40% (рис. 1, 2). При экспонировании растений в темноте после облучения КС регистрировали уменьшение степени ингибирования ферментной системы. Возвращение величины скорости реакции к темновому уровню линейно зависело от времени экспозиции в темноте. Полное возвращение к исходной величине, определенной в темновых условиях, происходило приблизительно через 60–90 мин. Экспонирование в темноте до 2 ч не давало каких-либо отличий от 60-минутной экспозиции. Таким образом можно определить, что время полужизни инактивированного состояния данной ферментной системы составляет около 30–45 мин.

Рис. 3.

Активность ФГА-дегидрогеназного комплекса (% от темнового варианта) в суммарном белковом экстракте листьев пшеницы после 8-часовой адаптации в темноте, после облучения 20 мин красным светом (КС) с последующим выдерживанием растений различное время в темноте (15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч и 2 ч).

ОБСУЖДЕНИЕ

При облучении интактных листьев пшеницы красным светом дозой 17.6 кДж/м² после длительного периода темновой адаптации происходило снижение активности цитоплазматического ФГА-ДГГ-комплекса на 35−40% (рис. 1). На этом же рисунке видно, что облучение растений дальним красным светом в течение 20 мин сразу после КС приводило к полному нивелированию эффекта последнего. Такая последовательность событий может свидетельствовать о том, что наблюдаемые изменения активности цитоплазматического ферментного комплекса при последовательном облучении КС → ДКС модулируются фитохромной системой при ее переходе Фх_КС → Фх_ДКС → Фх_КС. Действие ДКС в течение 20 мин может быть интерпретировано также следующим образом: за такое достаточно длительное время возможна самопроизвольная деградация Фх_ДКС. Однако в работе [13] было показано, что время полужизни Фх_ДКС составляет 1−2 ч в то время как в наших экспериментах полное обращение ингибирующего действия КС происходило при облучении ДКС за время, меньшее в 3−5 раз. Регуляторный потенциал фитохрома зависит, по крайней мере, от двух параметров: 1) его общего количества и 2) отношения содержания его активной формы к общему пулу ( Фх_ДКС/(Фх_ДКС+Фх_КС)) [14]. Синтез de novo белковой части фоторегулятора происходит одинаково и в темноте, и при освещении объекта [15]. Вследствие КС-облучения происходят два процесса: фотохимическое образование активной формы фитохрома (Фх_ДКС) и ферментативное образование убиквитин-Фх_ДКС комплекса с последующим его протеолизом [14–16], на два порядка превышающим скорость деградации Фх_КС. Функционирование ФГА-ДГГ комплекса при выдерживании растений в темноте после КС-облучения восстанавливается до исходного уровня за 1 ч, а величина полужизни этого состояния равна приблизительно 30−45 мин (рис. 3). Этот экспериментальный факт также позволяет нам отнести ингибирующее действие КС на счет фитохромной системы, вероятно – ФхВ, учитывая обратимость эффекта КС последующим ДКС.

На рис. 4 представлены объединенные результаты данных и ранее опубликованных [7] исследований по хлоропластному ФГА-ДГГ комплексу. При увеличении дозы КС-облучения интактных листьев происходило разнонаправленное линейное изменение активности хлоропластного и цитоплазматического ФГА-ДГГ комплексов. В относительном выражении активация НАДФ-зависимого фермента достигала 200%, тогда как НАД-зависимый фермент инактивировался только на 40%. Однако, исходная (сразу после темновой адаптации растений) активность этих ферментных систем составила 1.0–1.2 и 6.0–7.0 мкмоль НАД(Ф)*Н/(мин г), соответственно. Из этого следует, что в абсолютном выражении максимальные разнонаправленные изменения активности энерготрансформирующих систем в хлоропластах и цитоплазме имели приблизительно одинаковые значения: 2.0–2.4 и 2.4–2.8 мкмоль НАД(Ф)*Н/(мин г), соответственно.

Рис. 4.

Зависимость активности ФГА-дегидрогеназного комплекса (% от темнового варианта) в суммарном белковом экстракте листьев пшеницы после 8-ч адаптации в темноте от дозы КС-облучения. 1 – хлоропластный НАДФ-зависимый фермент, 2 – цитоплазматический НАД-зависимый фермент. Точки – значения, полученные в эксперименте, линии – линейная регрессия по экспериментальным точкам и бары – среднеквадратические ошибки среднего.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследования можно резюмировать следующим образом.

Градуальное снижение активности цитоплазматического ФГА-дегидрогеназного комплекса при действии узкополосного КС (656 нм) осуществляется под контролем фитохромной системы, вероятно – ФхВ, и количественно зависит от отношения (Фх_ДКС/(Фх_ДКС + Фх_КС)).

Кинетика темновой реактивации НАД-ФГА-ДГГ идентична таковой для энзиматической деградации фитохрома [13], что также может свидетельствовать о контроле фитохромной системы над цитоплазматическим ферментным комплексом.

Предполагается наличие фитохром-зависимой регуляции дыхания и фотодыхания растений [19], а также фотосинтетических процессов [14]. Из наших данных следует, что одинаковые количественные и энергетические показатели зависимости снижения гликолитической и увеличения хлоропластной ФГА-ДГГ [7] активности фитохромной системы можно интерпретировать как частичное фоторегуляторное переключение метаболизма и энергетики фотоавтотрофной клетки с дыхания на фотосинтез.

Работа выполнена при поддержке грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 20-04-00512а.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.