Физиология растений, 2021, T. 68, № 1, стр. 103-112

ВВЕДЕНИЕ

За последние десятилетия была показана высокая биологическая ценность веществ, синтезируемых в клетках микроводорослей, таких как: пигменты, липиды и углеводы [1–3]. Именно благодаря этому биотехнология микроводорослей получила новое направление развития, когда выращивание осуществляют для получения биологически активных компонентов биомассы. Высокая ценность и востребованность таких пигментов, как хлорофиллы, каротиноиды и фикобилипротеины, позволила поставить вопрос о промышленном получении натуральных пигментов из микроводорослей [4–6].

Одноклеточная красная микроводоросль Porphyridium purpureum (Bory) Drew et Ross привлекает внимание исследователей широким спектром синтезируемых веществ различной природы. С прикладной точки зрения эта микроводоросль, в первую очередь, представляет интерес как источник сульфатированных экзополисахаридов, эссенциальных жирных кислот, а также пигментов, относящихся к группе фикобилипротеинов (ФБП), которые у красных водорослей входят в состав фикобилисом [2, 3, 5, 7–9]. Все это, а также отсутствие данных о наличии токсичных веществ в биомассе P. purpureum, позволяет использовать продукты синтеза в качестве биологически активных добавок (БАД), а отсутствие целлюлозной клеточной стенки значительно облегчает и удешевляет процесс извлечения ценных компонентов [1, 2, 5, 8, 10, 11].

Использование натуральных природных пигментов приобретает все большее значение для косметологии, фармакологии и производства продуктов питания. Доказано, что пигменты микроводорослей оказывают выраженное положительное влияние на организм человека, обладая антиоксидантным, антиканцерогенным, противовоспалительным действием, а также антиангиогенным и нейропротекторным эффектами. С практической точки зрения, ФБП являются ценными природными веществами, биотехнологический потенциал которых уже используется или перспективность которого показана при использовании в нутрицевтике, фармацевтике, пищевой и косметической промышленности, а также в биомедицинских исследованиях и клинической диагностике [1, 3, 4, 8, 9].

Известно, что биохимический состав и скорость роста культур микроводорослей отличается у разных видов и штаммов, при этом на выход ценных компонентов также оказывают влияние множество различных факторов, важнейшие из которых: тип и конструкция фотобиореактора, параметры культивирования (состав питательной среды, освещённость, условия аэрации, pH, температура и др.) [2, 4, 6, 7, 12, 13]. Свет является главным фактором среды, который определяет скорость протекания реакций фотосинтеза, излучение и спектральный состав могут изменить метаболизм и биохимический состав культур микроводорослей. В клетках микроводорослей свет поглощается светособирающими пигментными комплексами (ССК) и далее предается в реакционные центры первой (П₇₀₀) и второй (П₆₈₀) фотосистем. Общая тенденция, представленная в литературе: микроводоросли с фикобилисомами, как правило, предпочитают низкую освещенность (~10–50 моль фотонов/(м² с), в то время как многие другие виды водорослей, например, большинство динофлагеллят или зеленые, обычно нуждаются в более высокой интенсивность света (~60–100 моль фотонов/(м² с) [3, 10, 14–17]. ФБП Porphyridium (B-фикоэритрин, R-фикоцианин и аллофикоцианин), входящие в состав ФС II, являются пигментами белковой природы, и их количество в клетках, в первую очередь, определяется уровнем облученности и обеспеченности азотом. Одним из наиболее изученных ФБП является B-фикоэритрин (B-ФЭ), входящий в состав ССК P. purpureum и придающий красную окраску его культуре [10, 15]. В экспериментах с P. purpureum довольно часто оценивают динамику численности клеток и содержание фотосинтетических пигментов [7–9, 11, 12, 18]. Однако в большинстве экспериментов плотность культуры невысока, хотя известно, что у данного вида она может достигать и 10 г/л сухого вещества [10].

В связи с вышеизложенным, целью данной работы являлось изучение особенностей накопления и продукции ФБП в плотной культуре P. purpureum при различной освещённости.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования выполнялись на базе Отдела биотехнологий и фиторесурсов ФИЦ ИнБЮМ (г. Севастополь). Объектом исследования являлся штамм IBSS-70 красной микроводоросли Porphyridium purpureum (Bory) Drew et Ross (Rhodophyta) из коллекции Научно-образовательного центра коллективного пользования ФИЦ ИнБЮМ “Коллекция гидробионтов Мирового океана”.

Выращивание осуществляли на питательной среде для морских красных водорослей [15]: (состав: NaNO₃ – 1.2 г/л, NaH₂PO₄ ⋅ 2H₂O – 0.45 г/л, EDTA-Na₂ – 0.037 г/л, FeC₆H₅O₇ ⋅ 3H₂O – 0.0265 г/л, MnCl₂ ⋅ 4H₂O – 0.004 г/л, Co(NO₃)₂ ⋅ 6H₂O – 0.0031 г/л, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ ⋅ 4H₂O – 0.0009 г/л, K₂Cr₂(SO₄)₂ ⋅ 4H₂O – 0.0017 г/л). Среду готовили на стерилизованной морской воде.

Культуру P. purpureum, которая была использована в качестве инокулята, предварительно выращивали в фотобиореакторах плоскопараллельного типа при освещённости 5 кЛк. Далее, культивирование продолжили в фотобиореакторах того же типа с рабочим объемом 1 л и толщиной слоя 2 см при круглосуточном искусственном освещении. В качестве осветителя использовали световую решетку из 18 Вт люминесцентных ламп; средняя освещённость на поверхности фотобиореакторов составляла 5, 10 и 15 кЛк. Интенсивность освещения на поверхности фотобиореактора регистрировали при помощи люксметра Ю-116 с погрешностью не более 5% от измеряемой величины. Температуру поддерживали на уровне 26–28°С, рН среды – 8–9. Барботаж культур осуществляли аквариумным компрессором Hailea ACO-308 воздухом без дополнительного введения углекислого газа; скорость подачи воздуха была одинакова для фотобиореакторов и составляла около 0.5 л/л культуры в минуту. Барботаж осуществляли через аквариумный распылитель воздуха, представляющий собой пластиковую трубку длиной 5 см, диаметром 5 мм, у которой диаметр пор не превышает 0.1 мм.

Молекулярно-генетические исследования проводились на базе лаборатории молекулярной систематики водных растений ИФР РАН. ДНК исследуемого штамма IBSS-70 экстрагировали с помощью набора Helix^TM (“Bio-Rad Laboratories”, США) в соответствии с протоколом производителя. Амплификацию баркодингового участка V4 ядерного гена 18S рДНК длинной 435 п.н. проводили с помощью пары праймеров D512 и D978 [19]. Условия амплификации: начальная денатурация – 5 мин при 95°С, последующие 35 циклов: денатурация при 94°С – 30 с, отжиг праймеров – 40 с при 52°С, элонгация – 50 с при 72°С; окончательное удлинение – 5 мин при 72°С.

Полученный ПЦР-продукт визуализировали методом горизонтального электрофореза в агарозном геле (1%) и окрашивали SYBR® Safe (“Life Technologies”, США). Очистку ПЦР-продукта проводили смесью FastAP, 10× FastAP Buffer, Exonuclease I (“Thermo Fisher Scientific”, США) и воды.

Редактирование и сборку полученной консенсусной последовательности осуществляли путем сопоставления прямых и обратных хроматограмм при помощи программ Ridom TraceEdit (ver. 1.1.0) и Mega7. Нуклеотидные последовательности выравнивали с помощью программы Mafft v7, используя модель E-INS-i. После этого проводили окончательное выравнивание – визуально определяли и удаляли неспаренные участки в начале и в конце полученной матрицы. Общая длина выравнивания составила 464 п.н.

Филогенетические деревья строились методами максимального правдоподобия (ML) и Байеса (BI). Набор молекулярно-генетических данных анализировался с использованием байесовского метода, реализованного в программе Beast ver. 1.10.1. [20]. Для выравненной нуклеотидной матрицы наиболее подходящая модель нуклеотидных замен, параметр формы α и доля неизменных сайтов (pinvar) оценивались с использованием байесовского информационного критерия (BIC) с помощью программы jModelTest 2.1.10 [21]. В качестве модели видообразования использовалось дерево-предшественник типа Yule. Расчетная сходимость параметров, эффективный размер выборки (ESS) и период выгорания проверялись с помощью программы Tracer ver. 1.7.1. [20]. Байесовский анализ проводился со следующими параметрами: случайное начальное дерево, количество запусков – 2, число параллельных цепочек – 4, количество поколений – 1 × 10⁷, запись параметров каждого сотого поколения и параметр отжига – 25%. Деревья ML строили в онлайн программе RA×ML [22] с проверкой их устойчивости 1000 бутстреп-репликами. Просмотр и редактирование деревьев осуществляли в программах FigTree (ver. 1.4.2) и Adobe Photoshop CC (19.0).

Содержание сухого вещества в культуре определяли ежедневно весовым, а также фотометрическим методами [23]. Оптическую плотность культуры P. purpureum измеряли на фотометре Unico 2100 в кюветах с рабочей длиной 5 мм. Пробы для определения содержания ФБП отбирали через 2–3 суток на различных фазах роста накопительной культуры после тщательного перемешивания. Суспензию культуры P. purpureum, полученную в эксперименте, центрифугировали в течение 10 мин, надосадочную жидкость сливали, осаждённую биомассу использовали для определения ФБП. Количественное содержание ФБП определяли спектрофотометрическим методом [23]. Для этого проводили экстракцию биомассы P. purpureum фосфатным буфером (0.05 М; рН = = 7–7.5). Спектры экстрактов пигментов промеряли на регистрирующем спектрофотометре СФ-2000 в диапазоне длин волн 400–800 нм с шагом 0.1 нм. Регистрировали оптическую плотность полученных экстрактов в области характеристических максимумов поглощения В-фикоэритрина (545 нм), R-фикоцианина (615 нм) и аллофикоцианина (650 нм), а также при 750 нм (для учета неспецифического поглощения раствора). Концентрацию пигментов в водном экстракте определяли по [15], используя значения оптической плотности для соответствующих длин волн.

Рассчитывали средние арифметические ($\bar {x}$), стандартные отклонения (S), основные ошибки средних, доверительные интервалы для средних (Δ$\bar {x}$). Все расчеты проводили в программах Libre Office и Scidavis для уровня значимости α = 0.05. В таблицах и на графиках представлены средние значения и рассчитанные доверительные интервалы ($\bar {x}$ ± Δ$\bar {x}$) для трех повторностей. В некоторых случаях, чтобы избежать загромождения рисунков, доверительные интервалы на графиках не обозначены, а ошибка не превышала 10%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проверка таксономического статуса исследуемого штамма IBSS-70 проводилась реконструкцией филогенетических связей методами максимального правдоподобия (ML, где LB – значение бутстрепа) и Байеса (BI, где PP – апостериорная вероятность). Как и в предыдущих исследованиях, касающихся вопросов филогении красных водорослей [24, 25], все включенные в анализ последовательности P. purpureum образовали единую кладу с максимальной статистической поддержкой (LB 100, PP 100) (рис. 1). В состав этой клады вошел как штамм IBSS-70, так и наиболее часто используемые в филогении Porphyridiophyceae штаммы P. purpureum CCAP 1380/3, Porphyridium sp. UTEX 637, P. purpureum IAG R-1, P. purpureum NZmm3W2 и P. purpureum CBS 153599. Остальные виды красных водорослей, содержащиеся в выборке, разбились на клады, соответствующие современному пониманию филогении Rhodophyta [24].

Начальная плотность культуры P. purpureum для всех вариантов эксперимента составляла около 0.5 г/л сухого вещества. За первые 5 суток выращивания прирост биомассы для варианта с самой низкой поверхностной освещенностью составил 1.8 г/л сухого вещества, а для двух остальных вариантов – в 3 раза ниже (0.6 и 0.7 г/л сухого вещества соответственно). Таким образом, за 5 суток выращивания культуры P. purpureum ее плотность увеличилась в 2.4, 2.5 и 4.7 раза (при освещенности 15, 10 и 5 кЛк соответственно) (рис. 2).

По литературным данным для синтеза 1 г биомассы P. purpureum (при оптимальных условиях) с нормальным содержанием белка (40–50%) необходимо около 70 мг азота [10]. Поэтому возможный прирост биомассы Porphyridium за весь период выращивания по расчетам мог составить 2.0–2.4 г/л сухого вещества [10, 26]. Близкие к расчетным значения этого параметра (2.1 г/л сухого вещества) наблюдались только для варианта эксперимента с освещённостью 5 кЛк. При повышении освещённости наблюдаемый прирост был значительно ниже потенциально возможного (в 2.3 и 3.3 раза для 10 и 15 кЛк соответственно) (табл. 1).

При освещенности 5 кЛк максимальная и средняя продуктивность культуры P. purpureum на линейном участке роста, а также прирост биомассы были значительно выше (в среднем, в 2.5–3.5 раза), чем в вариантах с более высокой освещенностью. Увеличение освещенности вызывало снижение продуктивности культуры, что, в итоге, приводило к существенной потере урожая биомассы P. purpureum. В большинстве случаев при интенсивном выращивании микроводорослей факторами, ограничивающими рост культуры, являются освещенность и обеспеченность элементами минерального питания клеток культуры. По литературным данным для выращивания P. purpureum предпочтительнее использовать более низкие освещенности [3, 10]. Ранее полученные данные показали возможность получения плотной культуры данного вида с продуктивностью около 0.5 г/(л сут) сухого вещества при поверхностной освещенности 20 кЛк, однако, в этом случае толщина рабочего слоя культуры была в 2.5 раза больше, чем в данном эксперименте [18]. По-видимому, увеличение поверхностной освещенности и, соответственно, удельной освещенности клеток, вызвало фотоингибирование роста культуры P. purpureum, даже при условии оптимальности прочих условий выращивания [10]. Кроме того, была отмечена коричневая окраска клеток культуры, наиболее интенсивная для варианта с максимальной освещённостью что, как правило, свидетельствует о нарушении процессов синтеза пигментов группы ФБП вследствие воздействия стрессовых условий.

Полученные данные свидетельствуют о негативном влиянии повышенного уровня облученности, нарушающего процессы биосинтеза ФБП в клетках культуры P. purpureum, несмотря на достаточное обеспечение элементами минерального питания (табл. 1).

В проведенном эксперименте некоторое лимитирование процессов роста и биосинтеза культуры P. purpureum начальной концентрацией азота в среде могло наблюдаться только для варианта с максимальной продукцией биомассы (5 кЛк) (табл. 1). О дефиците азота в среде в этом варианте также свидетельствовало наблюдаемое снижение содержания B-ФЭ в биомассе и в культуре P. purpureum (рис. 3) после 6-х суток и завершения стадии активного роста [3, 10].

За 3 суток накопительного культивирования изменение содержания B-ФЭ в клетках P. purpureum для всех вариантов эксперимента имело разнонаправленный характер: при освещенности 5 кЛк оно увеличилось в 1.9 раза, при 10 кЛк – существенно не изменилось, а при 15 кЛк – снизилось в 3.4 раза по сравнению с первоначальными значениями (рис. 3а). При дальнейшем выращивании содержание B-ФЭ в клетках P. purpureum продолжало повышаться только в условиях минимальной освещенности (5 кЛк); таким образом, за 6 суток концентрация пигмента выросла в 2.6 раза (рис. 3а). Последующее снижение содержания B-ФЭ в клетках P. purpureum для этого варианта после 6-х суток культивирования совпадает с переходом культуры на стадию замедления роста и стационарную (рис. 3). В соответствии с приведенными выше расчетами, концентрация азота в питательной среде, по-видимому, была исчерпана, что вызвало как остановку роста культуры, так и процессов синтеза ФБП.

После 3 суток выращивания P. purpureum содержание B-ФЭ (в клетках и в культуре) при 10 кЛк несколько снизилось и далее до окончания эксперимента оставалось стабильным. При освещённости 15 кЛк после значительного снижения содержания B-ФЭ к 3-м суткам наблюдалось его повышение в 2 раза с последующей стабилизацией до окончания эксперимента.

Динамика изменения B-ФЭ в культуре P. purpureum, в основном, совпадала с направленностью изменения содержания данного пигмента в биомассе микроводоросли. Наибольший рост концентрации пигмента также был зарегистрирован для варианта с освещенностью 5 кЛк: содержание B-ФЭ увеличилось в 3.3 раза с 1 по 6 сутки культивирования, достигнув 74 мг/л, что являлось максимальным для условий данного эксперимента (рис. 3б). Снижение B-ФЭ после перехода культуры P. purpureum на стадию замедления роста и стационарную отмечено многими исследователями и связано с исчерпанием азота в среде и наблюдающейся на этом фоне деградацией ФБП, представляющих собой белковые комплексы [3, 6, 27]. Следует отметить, что снижение содержания B-ФЭ, обусловленное азотным лимитированием, наблюдалось только для варианта с минимальной освещенностью. Для двух других вариантов, учитывая, что прирост биомассы составил 25 и 38% от расчетного (для вариантов 15 и 10 кЛк соответственно), характер изменения содержания данного пигмента, по-видимому, определялся не концентрацией элементов минерального питания в среде, а уровнем освещенности клеток культуры. Заданный в эксперименте уровень освещенности 10 и 15 кЛк, по-видимому, являлся завышенным и ингибировал как ростовые процессы, так и процессы синтеза ФБП. Признано, что содержание в клетках P. purpureum фотосинтетических пигментов, особенно B-ФЭ, ввиду его локализации в антеннах, может являться чувствительным индикатором уровня освещенности клеток [12, 16]. Снижение содержания B-ФЭ, входящего в светособирающие комплексы ФС II, в клетках P. purpureum к 6-м суткам в вариантах эксперимента с повышенной освещенностью до крайне низких величин на фоне остановки роста культуры, указывает на серьезные нарушения процессов биосинтеза в клетках, что может приводить даже к гибели культуры [10].

Относительное содержание пигментов в клетках или биомассе микроводорослей является не только непостоянной величиной и может изменяться в десятки раз, но и характеризуется значительной нелинейностью в процессе роста культуры [28]. Ранее была предложена модель, которая позволяет прогнозировать динамику содержания пигментов, в том числе фикобилиновой природы, при культивировании микроводорослей с заданной внешней освещенностью [28]. Модель основана на предположении, что наблюдаемая скорость изменения концентрации пигмента является алгебраической суммой скоростей синтеза, фотодеструкции и восстановления части фотоокисленных пигментов:

где β_st – стационарное значение относительного содержания пигмента, β₀ – начальное содержание пигмента в клетках культуры микроводорослей, μ_m – максимальная удельная скорость роста культуры микроводорослей, μ_π – константа деградации или константа перехода пигмента в окисленное состояние, μ_i – константа возбуждения или константа перехода пигмента из основного в возбужденное состояние, определяемая внешней освещённостью, с – константа, определяемая значениями μ_π, μ_i, μ_m, а также t_ext – временем, соответствующим экстремуму функции.

Предлагаемая модель позволяет описать явление “ложного старта”, наблюдаемое при резком повышении освещенности клеток микроводорослей. В этом случае функция имеет явно выраженный минимум, который характеризуется параметрами β_ext и t_ext и совпадает с полученными экспериментальными данными (рис. 4).

Анализируя характер кривой, следует отметить, что на начальном этапе фотодеструктивное окисление B-ФЭ преобладает над его синтезом, поэтому величина β уменьшается. Момент запуска накопительной культуры P. purpureum сопровождается резким увеличением облученности, приходящейся на единицу биомассы. В таких условиях помимо изменения содержания пигментов происходит перестройка всего фотосинтетического аппарата клеток [13]. Высокое соответствие теоретических и экспериментальных данных (R² = 0.95) позволяет сделать вывод о том, что именно при учете процессов фотодеструктивного окисления пигментов с возможностью их последующего восстановления можно объяснить явление так называемого “ложного старта” динамики относительного содержания B-ФЭ при резком изменении облученности клеток P. purpureum. Таким образом, предлагаемая модель может быть использована для прогнозирования динамики содержания пигментов при культивировании P. purpureum с заданной внешней освещенностью.

Известно, что продукция ФБП зависит как от скорости роста культуры, так и от содержания данных пигментов в клетках микроводоросли [7, 18]. Наибольшая продуктивность по B-ФЭ накопительной культуры P. purpureum зарегистрирована для варианта эксперимента с поверхностной освещенностью 5 кЛк (табл. 2).

Поскольку повышение поверхностной освещенности в 3 раза (от 5 до 15 кЛк) приводит к уменьшению как содержания B-ФЭ в клетках P. purpureum, так и скорости роста культуры в 3 раза, то и продуктивность по данному пигменту снижается более чем в 6 раз, что также свидетельствует об угнетении биосинтеза ФБП. В общем, характер изменения продуктивности культуры P. purpureum по B-ФЭ совпадал с таковым у ранее рассчитанных ростовых параметров: средняя наблюдаемая скорость синтеза B-ФЭ и суммарный выход данного пигмента при освещённости 5 кЛк значительно превышают значения аналогичных характеристик культуры при повышенной освещенности (табл. 2).

На основании экспериментальных данных была получена классическая зависимость содержания B-ФЭ от удельной облученности: концентрация пигмента гиперболически снижалась с ростом удельной освещенности клеток P. purpureum (рис. 5). При малых интенсивностях света содержание пигмента (β) достигало максимального значения β_max. С увеличением интенсивности света значения β снижались и в пределе достигали некоторого минимального значения β_min. При удельной облученности около 10 Вт/(м² г) наблюдался “компенсационный пункт” фотосинтеза: дальнейшее снижение облученности приводило к “выцветанию” пигмента [29]. Отметим, что каждая точка такой кривой является квазистационарным состоянием, которое определяется уровнем внешней освещенности и плотности культуры. Однако это состояние достигается в течение некоторого времени, при этом динамика переходного процесса во времени носит сложный нелинейный характер согласно (1).

Ранее была предложена модель, которая позволяет прогнозировать содержание пигментов при культивировании микроводорослей с заданной внешней освещенностью [30]. В стационарном процессе (непрерывная культура) величина относительного содержания пигмента в биомассе водоросли определяется отношением установившихся концентраций пигмента и биомассы. Отношение содержания пигмента к максимально возможному (без процесса деструкции) определяется отношением концентраций пигментов: наблюдаемых и максимальных. Наблюдаемая концентрация определяется балансом синтезированных и разрушенных пигментов. Сведение математических форм записи происходящих процессов в единое целое приводит к следующей математической модели светозависимого содержания пигментов в клетках микроводорослей с учетом скорости роста:

где β – относительное содержание пигмента в биомассе (%), β_max – коэффициент, максимальное содержание пигмента в биомассе (%), µ – удельная скорость роста/сут, F_d – коэффициент, деструктивная доза световой энергии для пигмента, I_a – интенсивность освещения (Вт/м²).

Среда обитания водорослей характеризуется неоднородностью и постоянно изменяющимися световыми условиями. В результате адаптации к свету происходит структурно-функциональная перестройка фотосинтетического аппарата, направленная на более эффективное использование энергии светового потока. Концентрация пигментов в клетках является важнейшим показателем, который характеризует способность растительных клеток поглощать световую энергию. Модель (2) позволяет прогнозировать содержание B-ФЭ при различной освещенности и демонстрирует, что максимальное накопление пигментов будет в диапазоне освещенности 7–10 Вт/(м² г). Продуктивность культуры была также значительно выше при освещенности 10–20 Вт/(м² г) (в среднем, в 3–5 раз), чем в вариантах с более высокой освещённостью. Таким образом, при низкой освещённости клеток микроводоросли P. purpureum, незначительно превышающей компенсационный пункт фотосинтеза, наблюдается как рост продуктивности культуры, так и рост содержания B-ФЭ, что предопределяет высокую продукцию пигментов культурой, а низкий уровень поверхностной освещённости является предпочтительным для выращивания P. purpureum.

Существенные различия по условиям освещенности клеток отражались не только на содержании ФБП в культуре P. purpureum, но и на их соотношениях. При этом значения соотношений B-ФЭ/R-ФЦ и BВ-ФЭ/АФЦ при 5 кЛк были значительно выше (в среднем, в 2–3 раза) на всем протяжении эксперимента, по сравнению с вариантами с более высоким уровнем освещенности, что свидетельствует о более высокой доле B-ФЭ при низкой освещенности (рис. 6).

Следует отметить, что изменение содержания ФБП P. purpureum происходило неравномерно. Значения соотношения B-ФЭ/R-ФЦ на протяжении эксперимента снижались для вариантов эксперимента 10 и 15 кЛк, причем максимальное снижение (на 60%) и минимальные значения данного соотношения (2.5) зарегистрированы для освещенности 15 кЛк (рис. 6а). Соотношение B-ФЭ/АФЦ для вариантов эксперимента 10 и 15 кЛк также имело тенденцию к снижению на протяжении всего периода культивирования, причем минимальное значение (3.5) также зарегистрировано для варианта с максимальной освещенностью (рис. 6б). При освещенности 5 кЛк соотношение B-ФЭ/ R-ФЦ оставалось достаточно стабильным на протяжении всего эксперимента, несмотря на значительные изменения содержания B-ФЭ как в культуре, так и в клетках P. purpureum, что свидетельствует об отсутствии выраженного влияния световых условий на соотношение этих пигментов. В целом, культура P. purpureum при низкой освещенности (5 кЛк) характеризовалась значительно более высокой долей B-ФЭ по отношению к R-ФЦ и АФЦ по сравнению с другими вариантами эксперимента, что соответствует современным представлениям о влиянии освещённости на количественные соотношения ФБП. Повышенная освещенность в эксперименте вызывала уменьшение значений соотношений B-ФЭ/R-ФЦ и B‑ФЭ/АФЦ в культуре P. purpureum до крайне низких значений (рис. 6). Уменьшение значения соотношения B-ФЭ/АФЦ для варианта с освещенностью 5 кЛк отмечено после 8-х суток эксперимента, что совпадало с переходом культуры на стационарную фазу роста и вероятным исчерпанием элементов минерального питания в среде. Уменьшение индекса B-ФЭ/АФЦ в 2–4 раза, наблюдаемое при развитии азотного дефицита у P. purpureum (рис. 6б, 5 кЛк), свидетельствует о преимущественной деградации B-ФЭ по сравнению с АФЦ, находящимся в сердцевине антенных структур, что согласуется с литературными данными о большей лабильности фикоэритрина как светособирающего пигмента [16, 18].

Ранее было показано, что продуктивность P. purpureum по биомассе может достигать 0.5 г/(л сут), а по B-ФЭ – 30–50 мг/(л сут) [7, 18, 27]. Следует отметить, что продуктивность P. purpureum в проведенном эксперименте при 5 кЛк достигала 0.4 г/(л сут) и получена при освещенности в 4 раза ниже, чем в указанном выше опыте [18], а также без дополнительного введения СО₂ в газовоздушную смесь. Полученные результаты демонстрируют возможность значительно уменьшить затраты на энергетическую составляющую при выращивании P. purpureum с сохранением высокой скорости роста культуры. Успешное решение задачи повышения скорости синтеза B-ФЭ позволит повысить рентабельность выращивания P. purpureum как источника этого ценного природного пигмента.

В заключении, следует отметить, что проведенный молекулярно-генетический анализ подтвердил таксономическую принадлежность штамма IBSS-70 к P. purpureum. Определены продукционные характеристики накопительной культуры P. purpureum в диапазоне поверхностной освещенности 5–15 кЛк. Прирост плотности культуры микроводоросли, соответствующий расчетной концентрации азота в питательной среде, получен только для варианта эксперимента с освещенностью 5 кЛк. Самое высокое содержание B-ФЭ как в клетках, так и в культуре P. purpureum (5.5% сухого вещества и 74 мг/л) также наблюдалось при минимальной освещённости (5 кЛк). Определён характер изменения содержания B-ФЭ в культуре P. purpureum в зависимости от удельной освещённости клеток микроводоросли: максимальное содержание пигмента наблюдалось при освещенности порядка 10 Вт/(м² г). Предложена модель, позволяющая прогнозировать содержание B-ФЭ при различной освещенности. Показано, что световой параметр культивирования оказывал значительное влияние на скорость роста микроводоросли P. purpureum, скорость синтеза и выход B-ФЭ: более низкий уровень поверхностной освещенности являлся предпочтительным для выращивания P. purpureum. Предложенный подход позволяет получать 0.4 г/(л сут) биомассы P. purpureum, содержащей значительные количества B-ФЭ. Таким образом, в условиях эксперимента важнейшим фактором, определяющим продукционные характеристики культуры P. purpureum, являлся световой, что нужно учитывать при его культивировании.

Работа выполнена в рамках темы Госзадания Федерального исследовательского центра “Институт биологии южных морей имени А. О. Ковалевского Российской академии наук” № АААА-А18-118021350003-6, а также при поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 18-74-00095).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.