Физиология растений, 2021, T. 68, № 6, стр. 579-588

Дифференциальная экспрессия генов транс-факторов при старении листьев мутантов по гену АНК2

Из общего пула генов, кодирующих транскрипционные факторы, которые выявили дифференциальную экспрессию у мутантов с инактивированным рецептором АНК2 (50 – у ahk2, 128 – у ahk2ahk3 и 24 – у ahk2ahk4) мы выделили гены ТФ, участвующие в регуляции старения [1, 3, 4]. Далее эти гены, были классифицированы по семействам с использованием списка генов ТФ сайта AtTFDB (http://arabidopsis.med.ohio-state.edu/ AtTFDB/).

Центральными участниками в модуляции транскрипционных изменений при старении принято считать семейства NAC и WRKY [3]. Максимальное число генов NAC, обнаруживших пониженную по сравнению с диким типом экспрессию, отмечено у мутанта ahk2/3 (табл. 1), для которого характерны наиболее замедленные темпы старения [8]. В их число входили не только позитивные (ORE1/6, ANAC046, NAP, NAC019), но и негативные (VNI2/83, JUB1/42) регуляторы старения [9, 4 ]. Возможной причиной подавления экспрессии негативных регуляторов может быть их одновременное участие в регуляторных сетях, не связанных со старением. При этом пониженная экспрессия, выявленная для NAC084 у всех исследованных мутантов, не зависела от типа или числа инактивированных рецепторов. Можно предполагать, что регуляция экспрессии этого гена определяется скорее нарушениями в нормальном восприятии цитокининового сигнала, чем пролонгированным или укороченным периодом вегетации листьев. Более предсказуемой оказалась реакция позитивного регулятора старения NAC060. У мутанта ahk3/4 уровень транскриптов NAC060 был повышен более, чем в 40 раз по сравнению с диким типом (табл. 1). NAC060 в свою очередь, способен регулироваться абсцизовой кислотой через фактор транскрипции ABI4 и ослаблять ее эффект, определяя тем самым нечувствительность к сахарам [10].

Семейство WRKY, так же, как и семейство NAC, включает позитивные и негативные регуляторы старения. Сниженная экспрессия была отмечена лишь у линии ahk2ahk3 и только для позитивных регуляторов старения в соответствии с пролонгированным онтогенезом этого мутанта (табл. 2). Наиболее сильно (до 15 раз) была подавлена экспрессия гена WRKY75, который ускоряет старение, стимулируя, образование салициловой кислоты и частично подавляет транскрипцию CATALASE2 [11]. Несколько слабее оказалась ингибирована экспрессия позитивного регулятора WRKY45, который стимулирует старение за счет взаимодействия с DELLA белком RGL1 [12], а также позитивных регуляторов WRKY6 и WRKY53, способных напрямую связываться с промоторами различных SAG генов, ассоциированных со старением [13, 14]. Негативный регулятор старения WRKY54, который одновременно является позитивным регулятором защитных реакций растений, продемонстрировал значительный рост экспрессии у всех мутантов за исключением ahk2ahk3, и, возможно, эта активация WRKY54 была связана с защитой стареющих листьев растений от инфекций. Заметим в этой связи, что WRKY54 коэкспрессируется с геном ответа на патогены и циркадные ритмы PСС1, увеличенный уровень транскриптов которого по сравнению с диким типом также был выявлен у всех изученных мутантов (9.72 – для ahk2/ДТ, 13.35 – для ahk2ahk3/ДТ и 6.19 – для ahk3ahk4/ДТ).

Помимо ТФ NAC и WRKY измененная экспрессия в транскриптомах стареющих листьев мутанта ahk2ahk3 была характерна также для членов семейств AP2-EREBP, bHLH, C2H2, MYB и GATA. Однако дифференциальная экспрессия генов этих транс-факторов, как и членов семейств NAC и WRKY, выявляемая только у мутанта a-hk2ahk3, могла быть обусловлена его пролонгированным онтогенезом, не интегрированным напрямую с рецептором АНК2, через компенсаторный механизм, связанный с экспрессией генов семейства SAUR (SMALL AUXIN UP RNAs) и пула генов транспорта и сигналинга ауксинов [8]. При этом особенностью транскрипционного профиля мутанта ahk3/4 с активным рецептором АНК2 было отсутствие значимых изменений в экспрессии каких-либо генов ТФ, вовлеченных в контроль естественного старения, за исключением NAC060. Основываясь лишь на профиле транскриптов этого мутанта, предполагать состав транскрипционной регуляторной сети, определяющей его ускоренное старение за счет рецептора AHK2, довольно сложно.

В этой связи мы сосредоточили наше внимание на транскрипционных факторах, которые выявили дифференциальную экспрессию по меньшей мере у двух мутантов с инактивированным геном рецептора АНК2. Среди членов семейств NAC и WRKY только позитивные регуляторы старения ANAC046 и ANAC047 продемонстрировали сниженную экспрессию одновременно у ahk2 и ahk2/3. В списке генов ТФ с резко увеличенной экспрессией у обоих мутантов присутствовали два представителя семейства ERF/AP2 DREB26 и ESE3 (табл. 3). Семейство ERF (ethylene-responsive element-binding factor family) содержит у Arabidopsis 147 членов, сгруппированных в четыре подсемейства: AP2, DREB, ERF и RAV. В качестве транскрипционных факторов белки семейства играют ключевую роль во многих регуляторных процессах и интегрируют метаболические, гормональные и внешние сигналы, связанные с адаптацией к стрессам и ретроградным сигналингом [15].

Значимое превышение у мутантов по сравнению с диким типом (в 53.54 раза для ahk2 и 53.01 для ahk2ahk3) отмечено в уровне транскриптов гена ETC2 (AT2G30420), кодирующего MYB транс-фактор R3-типа (табл. 3). Белок ETC2 участвует в дифференциации клеток эпидермиса A. thaliana, репрессируя образование трихом и индуцируя дифференциацию корневых волосков [16]. Помимо названных функций белки семейства могут оказывать плейотропный эффект на развитие растений и время цветения, одновременно взаимодействуя с регуляторными каскадами, интегрирующими взаимодействие фитогормонов, белков клеточной стенки и структур цитоскелета [17]. Определенный интерес с точки зрения возрастных изменений клеточной стенки представляет сохранение у ahk2 и ahk2/3 умеренно повышенной экспрессии гена GATA4 (At3g60530) из одноименного семейства транс-факторов, который, согласно литературным данным, коэкспрессируется с генами сборки клеточной стенки, включая гены, кодирующие экспансины, арабиногалактановые белки и гликозилгидролазы [18].

Максимальный рост экспрессии у мутантов по сравнению с диким типом (от 137 до 522 раз) был характерен для транскриптов гена bHLH38 (basic helix-loop-helix 38) из подгруппы 1b семейства bHLH, участвующего в регуляции генов поглощения железа [19]. При этом bHLH38 оказался единственным геном из списка транс-факторов, активация или сохранение повышенной экспрессии которого были отмечены у всех трех нокаут мутантов по гену АНК2 (табл. 3). Параллельно старение листьев у растений дикого типа сопровождалось существенным снижением (вплоть до нулевых значений) уровня транскриптов генов, относимых к функциональной подкатегории “iron” – железо.

Еще один член семейства bHLH F11O4.13 с резко повышенным уровнем транскриптов у мутантов ahk2 и ahk2ahk3 (в 37 и 47 раз соответственно) относится к подгруппе транс-факторов bHLH, члены которого способны взаимодействовать с комплексом компонентов SWI/SNF. Этот комплекс обеспечивает ремодуляцию хроматина, лежащую в основе многих онтогенетических программ. F11O4.13 физически связывается с АТФ-азой Brahma (BRM) этого комплекса, которая за счет изменения нуклеосомной позиции или конформации открывает доступ специфичным ДНК связывающим белкам к геномной ДНК [20].

Пониженная экспрессия одновременно у мутантов ahk2 и ahk2ahk3 была выявлена для гена T11P11.2, кодирующего белок, относимый к подсемейству C2H2 семейства транс-факторов с доменами типа “цинковые пальцы” (табл. 3). Белки, содержащие домены цинкового пальца, играют важную роль в эукариотических клетках, регулируя различные пути передачи сигналов и контролируя развитие и программируемую гибель клеток [21].

Избирательная проверка методом ОТ ПЦР РВ относительного уровня транскриптов генов, обнаруживших наиболее значимые изменения в экспрессии, подтвердила данные, выявленные при секвенировании транскриптомов, хотя значения, полученные при использовании ОТ ПЦР РВ, были, как правило, ниже, чем следовало из результатов RNA-seq анализа. На рисунке 1 приведены графики полученных результатов. По сравнению с растениями дикого типа у мутантов с инактивированным геном АНК2 была достоверно увеличена экспрессия генов семейства bHLH (bHLH38 и F11O4.13), а также генов семейства ERF/AP2 (ETC2, DREB26 и ESE3). Следует, однако, отметить, что уровень транскриптов гена DREB26 был существенно повышен лишь у мутанта ahk2ahk3, а накопление транскриптов F11O4.13, ETC2 и ESE3 оказалось, кроме того, достоверно выше у мутанта ahk2ahk4.

Рис. 1.

Избирательная проверка методом ОТ ПЦР РВ относительного уровня транскриптов генов, обнаруживших значимые изменения в экспрессии у мутантов с инактивированным геном АНК2 по сравнению с растениями дикого типа. РНК выделяли из шестого листа 7-недельных растений A. thaliana. Данные представлены в виде средних значений трех биологических повторностей и ошибки среднего. Достоверность различий оценивалась по критерию Стьюдента. * P ≤ 0.05.

Подводя итоги проведенного анализа, следует заключить, что транскрипционные факторы с дифференциальной экспрессией у мутантов по гену АНК2 различались по своим функциям. Все они могли участвовать в контроле продолжительности жизненного цикла мутантов и подчинялись прямой или опосредованной регуляции со стороны рецепторов ЦК.

Анализ генов, коэкспрессирующихся с генами АНК2-зависимых транскрипционных факторов, при старении листьев A. thaliana

Для выявления возможных функций транскрипционных факторов в регуляции старения нами был проведен анализ in silico коэкспрессирующихся с ними генных сетей (bar.utoromto.ca) и последующее сопоставление баз данных с транскриптомными профилями мутантов. Повышенный уровень экспрессии двух представителей семейства ERF/AP2 DREB26 и ESE3 сопровождался активацией гена AGP17 (AT2G23130), который кодирует арабиногалактановый белок, локализованный в плазматических мембранах и нитях Гекта (Hechtian strands) [22]. AGP участвуют в различных процессах, например, в пролиферации клеток, передаче клеточных сигналов, нацеливании на пыльцевые трубки во время прогамной фазы развития растений, а также в запрограммированной гибели клеток, опадении органов и во взаимодействиях с микробами и регуляторами растений. Резко повышенный уровень транскриптов AGP17 в листьях мутантов (табл. 4), подтвержденный данными ОТ ПЦР РВ (рис. 1), свидетельствует о несомненной роли рецептора АНК2 в ускоренной деградации клеточной стенки. Таким образом, ЦК могут влиять на процесс старения, контролируя не только донорно-акцепторные отношения за счет активности инвертазы клеточной стенки и гексокиназы [23], но и регулируя синтез арабиногалактановых белков.

Среди генов, корегулируемых с геном семейства bHLH F11O4.13, выраженное изменение уровня транскриптов отмечалось для гена негативного ответа на брассиностероиды и удлинение клеток IBL1 (INCREASED LEAF INCLINATION1 BINDING bHLH1, AT4G30410) и гена BEE2 (BR-ENHANCED EXPRESSION 2, AT4G36540), кодирующего компонент передачи сигнала брассиностероидов и также участвующего в регуляции удлинения клеток (табл. 4) [24, 25]. Увеличенный уровень транскриптов выявлен, кроме того, для гена AT5G13140 (табл. 4). AT5G13140 кодирует белок аллергена пыльцы и семейства экстенсинов Ole e 1 (Pollen Ole e 1 allergen and extensin family protein) [26]. Можно заключить, что F11O4.13 наряду с GATA4, DREB26 и ESE3 входит в сеть регуляторов модификации компонентов клеточной стенки при участии цитокининов и брассиностероидов, однако детали функционирования этой системы нуждаются в дополнительных исследованиях. К этой системе может также относиться MYB транс-фактор R3-типа ETC2, который, как отмечалось выше, способен интегрировать взаимодействие фитогормонов и белков клеточной стенки [17]. Коэкспрессия этого транс-фактора с геном липазы GDSL (GDSL-like Lipase/Acylhydrolase superfamily protein, AT4G01130) у мутантов (табл. 4) позволяет предполагать участие рецепторов ЦК в регуляции липидного обмена при старении листьев.

В сети генов, корегулируемых с bHLH38, мы нашли два гена bHLH39 и bHLH100 из пoдгруппы 1b bHLH с дифференциальной экспрессией в листьях мутантов по гену АНК2 (табл. 4). Все эти транс-факторы, принимают участие в обеспечении поглощения железа и поддержания его гомеостаза. Совместно с ключевым bHLH белком FIT (FER-LIKE DEFICIENCY INDUCED) они активируют гены FRO2 и IRT1, кодирующие Fe- редуктооксидазу и транспортер железа, соответственно [19]. Однако, согласно данным RNA-seq анализа библиотек стареющих листьев, названные гены (FIT, FRO2 и IRT1), а также еще ряд генов, связанных с метаболизмом железа, не отличались по уровню экспрессии у мутантов и дикого типа. Вместе с тем, два гена из пула регуляторов ответа на дефицит железа FEP2 (AT1G47395) и FEP3 (AT1G47400) (FE-UPTAKE-INDUSING PEPTIDE 2 и 3) оказались существенно ингибированы у растений дикого типа по сравнению с нокаут мутантами ahk2 и ahk2ahk3 (табл. 4). Эти особенности экспрессии генов, регулирующих метаболизм железа, соответствовали данным ОТ ПЦР РВ анализа, но изменения в уровне их относительной экспрессии у мутантов (рис. 1), были, как правило, ниже, чем следовало из результатов RNA-seq анализа. Как и для генов F11O4.13, ETC2 и ESE3, уровень транскриптов FEP2 и FEP3 оказался достоверно выше у мутанта ahk2ahk4, по сравнению с растениями дикого типа.

Полученные нами данные в определенной степени согласуются с работой Hyrayama и коллег [27], которые впервые обнаружили участие продуктов генов FEP в регуляции экспрессии ответа на недостаточность железа. Эти исследователи установили, что три гена FEP кодировали короткие полипептиды (менее 100 аминокислот), способные при дефиците железа индуцировать экспрессию bHLH38 и bHLH39 независимо от FIT. При этом у мутанта fep1 и только в побегах активировались bHLH38, bHLH39 и FEP2, но не FRO2 и IRT1. Параллелизм в характере регуляции генов метаболизма железа в стареющих листьях Arabidopsis и у мутанта с недостаточностью пептида, индуцирующего поглощение железа, свидетельствует, что FEР-зависимый регуляторный механизм ответа на обеспеченность железом функционирует и при ремобилизации питательных компонентов, накопленных в стареющем листе. При этом уровень экспрессии генов FEP может определяться уровнем гема или других молекул, координирующих содержание железа.

Физиологическая взаимосвязь между рецептором ЦК АНК2 и метаболизмом железа в стареющих листьях несомненна, хотя она может быть непрямой. Не исключено, что она связана с влиянием этого рецептора на возрастные параметры листа, детерминирующие отток железа, однако конкретные цепочки, объединяющие эти взаимозависимые сигналы, нуждаются в дополнительных исследованиях. Ранее было показано, что при регуляции поглощения железа корнями экзогенный цитокинин репрессирует гены FIT, FRO2 и IRT1 на уровне накопления транскриптов, и это подавление опосредовано рецепторами АНК3 и АНК4 [28]. Однако сигналы ЦК и дефицита железа действовали через различные метаболические пути, поскольку негативная регуляция цитокининами гена IRT1 не зависела от доступности железа. Цитокинины, по мнению авторов исследования, косвенно воздействовали на аппарат поглощения железа, модифицируя архитектуру корней.

Реализация сигнала ЦК при участии рецепторов происходит с помощью двух групп ТФ ─ ARR типа В (MYB-подобных ДНК-связывающих белков) и CRF (Cytokinin Response Factors) из семейства ERF/AP2. Важно заметить, что анализ промотора гена bHLH38 выявил в пределах последовательности в 500 п.н. вверх от стартового кодона ATG цис-элементы для таких транс-факторов как ARR1, ARR2, ARR11 и ARR14 (AthaMap server). Таким образом, ЦК через рецептор АНК2 может напрямую влиять на метаболизм железа при старении листьев, что не исключает, однако, существование механизмов опосредованной регуляции.