Физиология растений, 2022, T. 69, № 1, стр. 105-112

ВВЕДЕНИЕ

Диатомовые водоросли представлены большим количеством видов, порядка 100 тысяч [1]. Важным этапом в жизни диатомовых является половая репродукция, необходимая для сохранения вида [2]. При этом следует заметить, что жизненный цикл подавляющего большинства остается неизученным, хотя именно он обусловливает развитие природных популяций, в том числе предопределяет, предположительно, периоды массового развития (“цветения”). В Мировом океане широко распространены представители рода Pseudo-nitzschia H.Peragallo. Отдельные виды этого рода способны продуцировать токсичную домоевую кислоту. В период “цветения” этот нейротоксин, накапливаясь в тканях моллюсков, передается по пищевым цепям [3], вызывая амнезийное отравление [4–6]. Для Черного моря указано семь потенциально опасных видов Pseudo-nitzschia [7], некоторые встречаются в планктоне в прибрежной зоне вблизи Карадага (юго-восточное побережье Крымского полуострова). В пробах нам чаще всего попадались P. pungens (Grunow ex Cleve) Hasle и P. calliantha Lundholm, Moestrup et Hasle. Если вид P. pungens известен с начала прошлого века (он выбран в качестве типового для рода Pseudo-nitzschia), то название P. calliantha появилось не так давно. В 2003 году была опубликована статья, описывающая новый вид [8], показано, что он встречается в Черном море у берегов Турции [9]. Однако первые данные о половом воспроизведении и отдельных элементах жизненного цикла этого вида (под другим названием) были получены задолго до этого [10]. О половом воспроизведении P. pungens стало известно позднее [11]. Сегодня мы имеем достаточно полное представление о жизненных циклах диатомовых водорослей [11–16], и это позволяет при наличии фактического материала анализировать состояние их популяций. Задача данной работы состояла в изучении особенностей жизненного цикла, его продолжительности, минимальных и максимальных размеров клеток характерных для P. calliantha и P. pungens, клоны которых были выделены из планктонных проб, отобранных у берегов Крымского полуострова.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлись планктонные пеннатные диатомовые водоросли рода Pseudo-nitzschia H. Peragallo, 1900: P. calliantha Lundholm, Moestrup et Hasle (рис. 1) и P. pungens (Grunow ex Cleve) Hasle (рис. 2). Отбор проб проводили в нескольких местах вдоль восточного, юго-восточного и юго-западного побережья Крыма: Керченский пролив (г. Керчь), восточная оконечность мыса Опук, Карадагская бухта, бухта Ласпи, Севастопольская бухта (Графская пристань), Каламитский залив (вблизи г. Евпатория), оз. Донузлав (рис. 3). Для отбора проб использовали малую планктонную сеть Джедди. Диаметр входного отверстия сети – 25 см, ячея газ-сита, изготовленного из синтетических нитей, – 74 мкм (ГОСТ 4403-91, ЗАО “Рахмановский шелковый комбинат”, Россия). Микропипеточным способом [17] с использованием инвертированных оптических микроскопов Nib-100 и Bif-100 (Biobase, Китай) из проб выделены одиночные клетки и введены в клоновые культуры. Измерение размеров клеток производили на микроскопе Biolar PI (PZO, Польша) с помощью окулярной линейки, калиброванной по объект-микрометру. Фотографии сделаны при помощи микроскопа NIB-100 и фотокамеры Canon PoverShort A95. Электронные фотографии панцирей получены с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЭМ) Carl Zeiss LIBRA-120 (Carl Zeiss Group, Германия). Фотографии использованы для биометрических измерений и для определения видов, встречающихся в исследуемых районах. Постоянные препараты панцирей, залитые высокопреломляющей средой, готовили, используя упрощенный метод [13], при котором живые клетки культуры выдерживали в дистиллированной воде до разрушения содержимого клеток, затем панцири заливали этанолом, используя капиллярную пипетку, переносили на покровное стекло и поджигали. Повторяли манипуляцию с новой порцией. Очищенные панцири заключали в высокопреломляющую смолу Naphrax (Naphrax Ltd. United Kingdom). Культуры содержали в стеклянных чашках Петри диаметром 10 см и колбах Эрленмейера объемом 100 мл в изолированном помещении с постоянной температурой 20 ± 2°C и естественном освещении от окон с северной стороны. Для смешанных посевов использовали чашки Петри диаметром 5 см. В качестве культуральной среды применяли модифицированную искусственную среду ESAW [18]. Пересев в свежую среду осуществлялся с периодичностью 10 дней. Зависимость длины клеток от времени содержания в культуре и размера инициальных клеток от размера родительских аппроксимировали линейным уравнением вида:

Рис. 1.

Pseudo-nitzschia cf. calliantha Lundholm, Moestrup et Hasle, клетки клона 8.0123-G. (а) – общий вид клеток, (б–д) – фрагменты створок, показывающие фибулы и штрихи; (а) – световая микроскопия, (б–д) – трансмиссионная электронная микроскопия. Масштаб линейки – 2 мкм.

где y – длина клеток; x – дата; а, b – коэффициенты.

Методом наименьших квадратов [19] были рассчитаны значения коэффициента b уравнения, показывающего скорость уменьшения размеров клеток. В таблицах и тексте средние значения приводятся с указанием ошибки среднего и количества измерений (n).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изученные клоны Pseudo-nitzschia проявили способность к гетероталлическому половому воспроизведению. За период наблюдений, с августа 2017 года по настоящее время, внутриклоновое (гомоталлическое) воспроизведение не отмечалось. В ходе экспериментов по скрещиванию клонов, выделенных из локальных природных популяций, у Pseudo-nitzschia calliantha наиболее сексуально активными оказались клоны 8.0123-E, 8.0123-G, 7.0804-L и 7.0804-Si5; у P. pungens – 8.0123-D и 7.1023-А (табл. 1). Продемонстрировано отсутствие межвидовой гибридизации.

Рис. 2.

Pseudo-nitzschia pungens (Grunow ex Cleve) Hasle, клетки клона 7.1023-A. (а) – общий вид клеток, (б–д) – фрагменты створок, показывающие фибулы и штрихи, (в) – фрагмент поясковых ободков; (а) – световая микроскопия, (б–д) – трансмиссионная электронная микроскопия. Масштаб линейки – 2 мкм.

Рис. 3.

Станции отбора проб вдоль побережья Крымского полуострова: Керченский пролив (г. Керчь), восточная оконечность мыса Опук, Карадагская бухта, бухта Ласпи, Севастопольская бухта (Графская пристань), Каламитский залив (вблизи г. Евпатория), озеро Донузлав.

Данные, полученные в ходе наблюдения за уменьшением апикальной длины клеток в клонах, позволили расширить диапазон размерных характеристик вида P. calliantha. С 20.05.2018 по 16.01.2019 были измерены 153 инициальные клетки, полученные в процессе межклонового полового воспроизведения. В весенне-летний период в смешанных посевах репродуктивно совместимых клонов была измерена самая длинная инициальная клетка (147 мкм). Среднее значение размера инициальных клеток в этот период – 130.5 ± 1.0 мкм (n = = 143). При этом длина родительских клеток в среднем составила 61.4 ± 1.4 мкм (n = 100). В процессе скрещивания зимой отмечен минимальный размер инициальных клеток – 119 мкм, среднее значение – 125.1 ± 4.3 мкм (n = 10). Длина родительских клеток изменилась и составила в среднем 47.7 ± 2.3 мкм (n = 60). При этом у P. calliantha отсутствует значимая корреляция между размером инициальных и родительских клеток (рис. 4).

Рис. 4.

Зависимость размера инициальных клеток в смешанных посевах клоновых культур Pseudo-nitzschia calliantha от родительских.

Во всех выделенных черноморских клонах, содержавшихся в культурах, происходило постепенное равномерное уменьшение апикальной длины клеток (рис. 5). Полученные данные позволили оценить скорость уменьшения размеров клеток при содержании в заданных условиях (табл. 2). Наименьшего размера (21 мкм) достигли клетки клона 7.0804-D5, которые продолжали делиться вегетативно, но уже потеряли способность воспроизводиться половым путем. Культуры, достигавшие этого размера, погибали независимо от условий содержания.

Рис. 5.

Изменение длины клеток (а) Pseudo-nitzschia calliantha (клоны: 8.0123-E, 8.0123-G, 7.0804-Si5, 7.0804-D5, 7.0804-N, 7.0804-F) и (б) P. pungens (клоны: 8.0123-D, 8.0123-C, 7.1018-В, 7.1018-С, 7.1018-Т, 7.1023-А) при содержании в культуре (среда ESAW) в условиях постоянной температуры 20 ± 2°C при естественном освещении со стороны северного окна.

В природной популяции самая крупная клетка вида, который нами был идентифицирован на основании морфологических признаков как P. calliantha [20], была найдена в марте 2020 года. Ее длина составила 157 мкм. Средний размер инициальных клеток был равен 136.7 ± 7.4 (n = 44) мкм. Длина родительских клеток лежала в диапазоне 66–91 мкм, среднее значение длины – 83.6 ± 6.3 мкм (n = 81).

Принимая в расчет установленные в лабораторных условиях кардинальные размеры клеток и скорость уменьшения размеров, рассчитали продолжительность дорепродуктивной фазы и всего жизненного цикла, которые составили 12 и 35 мес. (табл. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее уже была отмечена способность рода Pseudo-nitzschia к гетероталлическому половому воспроизведению [10]. Применяя биологическую концепцию вида, утверждающую, что “виды представляют собой группы фактически или потенциально скрещивающихся природных популяций, которые репродуктивно изолированы от других таких групп” [21], мы можем определить видовые границы большинства гетероталлически воспроизводящихся диатомовых водорослей. В конце 90-х годов XX столетия из Черноморской природной популяции в районе Карадага были выделены и введены в культуру клоны Pseudo-nitzschia, на тот момент идентифицированные как P. pseudodelicatissima. Попытки скрещивания выделенных клонов с другими, принадлежащими к этому виду, результатов не дали [10]. Это инициировало описание нового вида P. calliantha Lundholm, Moestrup et Hasle [8].

Изучение размерных характеристик P. calliantha показало вариабельность границ, от 40 до 110 мкм [8, 22, 23]. Следует заметить, что эти данные были получены на природных популяциях, и вероятнее всего, не отражают изменения размеров во всем жизненном цикле, поскольку при изучении природных популяций в большинстве случаев обычно не удается установить максимальные видоспецифические размеры в силу редкости событий ауксоспорообразования и связанной с этим сложности обнаружения инициальных клеток. В лабораторных условиях, напротив, можно инициировать половой процесс с появлением инициальных клеток, самых крупных, находящихся в начале жизненного цикла, и определить клетки минимального жизнеспособного размера. Данные, полученные нами в лабораторных условиях, позволили существенно расширить известный диапазон размеров, до 21–147 мкм. Примечательно, что в природной популяции были найдены клетки еще большего размера. Однако идентификация вида в этом случае производилась на основании световой микроскопии в прижизненном состоянии, что могло привести к неточности определения вида.

Границей перехода к репродуктивной фазе стало уменьшение клеток предыдущей генерации до 60–70% от максимально видоспецифического размера [25]. Ранее уже была отмечена граница перехода в 63–70% для других видов Pseudo-nitzschia [2, 26]. У представителей этого рода критическая граница, таким образом, выше, чем у большинства изученных диатомовых [27]. Следовательно, продолжительность дорепродуктивной фазы оказывается существенно более короткой.

Согласно полученным нами данным дорепродуктивная фаза для P. calliantha составляет приблизительно 12 мес. (табл. 3). Если использовать данные о максимальной длине клеток и значения кардинального размера, обуславливающего переход из дорепродуктивной в репродуктивную фазу, известные из литературных источников, то продолжительность дорепродуктивной фазы у P. calliantha и P. pungens должна составить 15 и 14 мес., а всего жизненного цикла – 18.5 и 19 мес. соответственно.

Заметим, что продолжительность отдельных фаз зависит от скорости уменьшения размера клеток, которая в свою очередь определяется толщиной панциря и темпом вегетативного деления [13]. Отмеченная нами разница в скорости уменьшения длины клеток Pseudo-nitzschia pungens и P. calliantha, по нашему мнению, связана в первую очередь с толщиной панциря в зоне перекрытия эпитеки и гипотеки, а не темпом деления.

P. calliantha, как и другие представители рода [28], имеет выраженный сезонный цикл развития. Мониторинг динамики численности в Карадагской бухте показал, что максимумы приходились на ранневесенний (март–апрель) и позднелетний (август–сентябрь) периоды. Массовое развитие, по-видимому, является необходимым условием для успешного полового воспроизведения, поскольку вероятность слияния гамет в трехмерном пространстве возрастает при большой численности [10].

Таким образом, представленные нами размерные характеристики позволяют не только уточнить диагноз вида P. calliantha, имеющего важное практическое значение с точки зрения токсикогенности, но и дают дополнительную информацию для понимания закономерностей протекания жизненного цикла, анализа природных популяций, моделирования динамики численности.

Работа выполнена в рамках госзадания Карадагской научной станции им. Т. И. Вяземского – природного заповедника Российской академии наук – филиала Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Институт биологии южный морей имени А.О. Ковалевского Российской академии наук” – “Изучение фундаментальных физических, физиолого-биохимических, репродуктивных, популяционных и поведенческих характеристик морских гидробионтов”, номер гос. регистрации 121032300019-0. Электронные фотографии диатомей получены в Центре коллективного пользования “Дальневосточный центр электронной микроскопии” Национальный научный центр морской биологии им. А. В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследования.