Физиология растений, 2022, T. 69, № 1, стр. 3-19

ВВЕДЕНИЕ

Во внутренней мембране растительных митохондрий, наряду с основным (цитохромным) путем транспорта электронов (ЦП), присутствует альтернативный путь (АП) через терминальную оксидазу, названную альтернативной оксидазой (АО). АО катализирует четырехэлектронное восстановление убихинолом кислорода до воды и устойчива к действию цианида. АП транспорта электронов минует два пункта генерации электрохимического градиента протонов (комплексы III и IV), а энергия окисления убихинола кислородом выделяется в виде тепла. Это снижает энергетическую эффективность дыхания, но снимает дыхательный контроль, регулирующий скорость образования АТФ и НАД·Н в зависимости от нужд клетки [1]. АП выявлен не только у высших растений, но и у представителей всех царств (кроме Archaebacteria) – бактерий, водорослей, мхов, папоротников, некоторых грибов и даже животных, ведущих малоподвижный или прикрепленный образ жизни (губки, актинии, нематоды, моллюски и др.) [1].

Первоначально интерес к АО был вызван ее участием в процессе термогенеза тканей цветка у некоторых представителей сем. Araceae. Повышение температуры термогенных тканей способствует испарению соединений, привлекающих насекомых-опылителей. Этот феномен описан еще в XVIII веке Ламарком, а цианидрезистентное дыхание было открыто в 30-х гг. XX века [2]. Нефосфорилирующая особенность АП в течение долгого времени вызывала вопросы о функции АП в нетермогенных тканях. Обсуждению природы, механизмов регуляции и физиологического значения АО в растениях посвящено немало обзоров [1, 3–7]. К настоящему времени большинство исследователей сходятся во мнении, что на клеточном и биохимическом уровне вовлечение АП способствует поддержанию окислительно-восстановительного баланса в митохондриальной ЭТЦ за счет более быстрого окисления НАД·Н и предотвращает генерацию избыточного количества АФК. Это влияет на метаболизм не только митохондрий, но и клетки в целом. Признано, что роль АО заключается в обеспечении метаболической пластичности клетки и растения в изменяющихся условиях среды [6].

Исследование альтернативного пути дыхания вышло из рамок только фундаментальной проблемы. Альтернативную оксидазу предложено использовать в качестве функционального маркера перепрограммирования клетки (“cell reprogramming”) при стрессе в селекции генотипов с высокой продуктивностью и устойчивостью [8], для выявления реакции растений в ответ на изменение условий среды (глобальное потепление, увеличение СО₂ в атмосфере) [9], в борьбе с митохондриальными заболеваниями человека [10]. За последние два десятилетия благодаря применению современных физико-химических и молекулярно-генетических методов достигнут значительный прогресс в исследовании структуры белка, генов и функций AO. Полагают, что АО является не только мишенью, но и регулятором стресс-сигнала [11]. Вместе с тем, исследование различных аспектов сигналинга АО на молекулярном уровне пока только начинаются [1, 7, 12, 13].

В настоящем обзоре приведены известные к настоящему времени сведения о генах АО, сигнальных путях и механизмах индукции их экспрессии, интеграции сигналинга АО с другими клеточными сигнальными путями; проанализирована роль АО в поддержании сигнальных внутриклеточных взаимодействий; обсуждаются механизмы посттрансляционных модификаций белка АО. В обзор также включены собственные экспериментальные данные, свидетельствующие об участии АО в модуляции митохондриальной функции.

ГЕНЫ АО И ИХ ПОЛИМОРФИЗМ

У двудольных растений АО кодируется двумя подсемействами ядерных генов – АОХ1 и АОХ2, у однодольных – одним подсемейством АОХ1 [14], за исключением некоторых представителей древней, рано дивергировавшей группы сем. Araceae [15]. Образование двух подсемейств и варьирование количества генов, по-видимому, является результатом дупликации и дивергенции [14, 15]. АОХ2 присутствует в водорослях и голосеменных растениях, но не найден во мхах, папоротниках и плаунах. В геноме грибов обнаружен ген АОХ только одного из двух подсемейств. Arabidopsis thaliana содержит четыре гена АОХ1(a–d) и один АОХ2, соя Glycine max, напротив, – один ген АОХ1 и два гена АОХ2(а, b) [14]. Рис содержит четыре гена АОХ1(a–d) [14], а у пшеницы идентифицированы только гены АОХ1a и АОХ1c [16], хотя не исключена возможность обнаружения других генов этого подсемейства – AOX1d и AOX1e [17]. Геном моркови Daucus carota L. уникален, он содержит два гена каждого подсемейства: AOX1(a, b) и AOX2(a, b) [18].

Большинство генов имеют консервативную интрон-экзонную организацию, состоящую из четырех экзонов, чередующихся тремя интронами. Вариации структуры генов АОХ среди видов связаны с потерей или включением интрона [14]. Исследования индукции АОХ на уровне транскрипции в основном проведены на растениях с секвенированным геномом – Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., A. lyrata L., Nicotiana tabacum L., Zea mays L. и некоторых других видах, что позволяет определить молекулярные механизмы сигналинга, регуляции активности АО и ее роль в реакции на стресс.

Гены АОХ могут проявлять полиморфизм, как правило, связанный с однонуклеотидными заменами (SNP). SNP в АОХ могут встречаться как в экзонах, так и в интронах [14]. SNP обнаружены в нескольких областях гена АОХ2 в трех сортах Olea europaea L. [19]. Найдены также полиморфные сайты АОХ со вставкой/делецией и копированием фрагментов ДНК. В частности, полиморфизм АОХ моркови (DcAOX2a) выявлен в интроне 3 [20]. Функциональное значение всех найденных SNP в АОХ пока точно не определено. Известно, что замена Лиз (K) на Асн (N) в 96 позиции аминокислоты в белке АО арбуза была результатом SNP в единственном гене АО арбуза – ClAOX [21]. Как показано, этот SNP связан с локусом хозяйственно-полезных количественных признаков, отвечающих за устойчивость к гипотермии [22]. Вариации в последовательности гена АО предложено использовать как молекулярные маркеры стрессоустойчивости вида, в том числе, для селекции в растениеводстве, а также наследственной изменчивости для объяснения индивидуальных различий между растениями одного вида [8, 14]. В результате точечного мутагенеза в гене АОХ1а риса получена однонуклеотидная замена; замена K71 на N71 в белке привела к повышению устойчивости сорта к пониженным температурам [23].

Другой аспект полиморфизма генов АО связан с микрогетерогенностью 3'-нетранслируемой области транскриптов АОХ (3'-UTR) в результате альтернативного полиаденилирования [14]. Модуляция длины 3'-UTR может значительно влиять на регуляцию экспрессии AOX, хотя сведений об этом очень мало. В 3'-UTR АОХ1а кукурузы идентифицирован предполагаемый сайт связывания с микроРНК (miR163) [14, 24]. Этот сайт находится между двумя сайтами расщепления, указывая на то, что только транскрипты с достаточно длинной 3'-UTR могут подвергаться микроРНК-сайленсингу. Около половины молекул мРНК AOX1a в проростках кукурузы, транскрипция которых была индуцирована обработкой H₂O₂, имели короткие 3'-UTR без сайта связывания микроРНК и, следовательно, избегали микроРНК-сайленсинга [24]. В интроне 3 AОХ2a Daucus carota найдена повторяющаяся делеция, которая, предположительно, влияет на сайт связывания с микроРНК [20]. Множественные вариации длины 3'-UTR выявлены в АОХ2 у разных сортов оливы (Olea europaea L.) [19]. Это может быть консервативным признаком среди сортов с разной способностью к укоренению черенков, которое связано со стресс-индуцируемой экспрессией АОХ2 [19].

Хотя информация о полиморфизме генов АО пока фрагментарна, становится все более понятно, что полиморфизм АОХ является эволюционным механизмом регуляции экспрессии АОХ на различные сигналы, повышающим устойчивость растения к стрессу.

ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ И ПОСТТРАНСКРИПЦИОННЫЙ КОНТРОЛЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ АО

Регуляция активности транскрипции гена в значительной степени связана со структурой его промоторной области. Наиболее полно изучены промоторы генов АО A. thaliana [25, 26] и Glycine max [27]. Ген АОХ1а A. thaliana (AtAOX1a) служит моделью для изучения транскрипционного контроля экспрессии АОХ при стрессе [5, 26, 28].

Область промотора содержит цис-регуляторные элементы (CAREs), как правило, находящиеся близко к ССТ (сайт старта транскрипции). Эти элементы могут взаимодействовать с РНК-полимеразой и транскрипционными факторами (ТФ), контролирующими экспрессию генов.

Анализ промотора AtAOX1a с использованием делеций и мутагенеза выявил область длиной 93 п.н. (отрезок между 313 и 406 позицией нуклеотидных оснований выше ССТ; далее все позиции выше ССТ обозначены со знаком “–”), обозначенную как регулятор экспрессии AtAOX1a митохондриального ретроградного пути [13, 28]. Эта область промотора регулирует экспрессию гена при воздействии антимицина – ингибитора комплекса III ЭТЦ, и ингибитора ЦТК (аконитазы) – МФА (монофторацетат). Позже был выявлен CARE, обозначенный как MDM (Mitochondrial Dysfunction Motif), имеющий последовательность CTTGNNNNNCA(A/C)G и регулирующий экспрессию так называемых 24 MDS-генов (Mitochondrial Dysfunction Stimulon), в том числе АОХ1а [29].

Анализ промотора AtAOX1a длиной 1800 п.н. выше ССТ выявил 15 CAREs, из которых 12 были функционально активными (A1, А2, B2, C, D, E, F, G, H, I1, I2, J), участвующими в регуляции транскрипции гена в ответ на воздействие таких стресс-агентов как Н₂О₂ и ротенон (ингибитор комплекса I ЭТЦ), либо обоих [26]. В нормальных условиях промотор AtAOX1a репрессирован под контролем элемента B2 (CGTGAG, –1576 п.н.). Этот элемент является сайтом связывания с ТФ ABI4 (ABA-Insensitive 4). Полагают, что ABI4 – репрессор митохондриальной ретроградной регуляции (MРР), поскольку мутанты abi4 имели повышенный уровень транскриптов гена [30].

CAREs A2, E, I1 и I2 функционируют как активаторы МРР. При воздействии стресс-агентов уровень репрессии снижался и наблюдалась положительная регуляторная активность других CAREs, что свидетельствует о комбинаторной природе регуляции экспрессии генов [26].

Элементы B и I содержат сайт ABRE (ABA-Responsive Element) (ACGT), а элемент I1 (ACGTG, –93 п.н.) находится в непосредственной близости к I2, формируя пару ABRE-ABRE. ABRE распознается ТФ bZIP (лейциновая молния); две копии ABRE, вероятно, обеспечивают высокую чувствительность гена к АБК [26].

CARE I1 в промоторе AtАОХ1а также перекрывается с фоточувствительным элементом G-box (CACGTG), что предполагает существование прямых механизмов, связывающих экспрессию гена с фотосинтетической функцией [26, 31, 32]. Сведения о фоточувствительных элементах промотора АОХ и светозависимом характере индукции АОХ приведены далее в разделе о сигнальных путях.

Генетический скрининг выявил сайты (T/G)CGTGT и W-box ((a/t)TTGAC(a/c/t)) в промоторе AtAOX1a, с которыми связываются ТФ семейства NAC и WRKY соответственно [28, 33]. В A. thaliana ANAC017, ANAC013 и другие ANAC являются положительными регуляторами экспрессии AtAOX1a [29, 34], а WRKY – как положительные, так и отрицательные регуляторы экспрессии AtAOX1a [33].

Анализ промотора длиной 1000 п.н. другого гена АО – AtAOX1c, не проявляющего индукцию в ответ на окислительный стресс, выявил 9 CAREs (A–I), в основном находящихся в области 500 п.н. выше ССТ [25]. Семь элементов из них присутствовали и в промоторной области гена АО сои – GmAOX2b, который не является стресс-индуцируемым [27]. Делеции больших фрагментов и CAREs промоторов AtAOX1c и GmAOX2b показали, что элементы функционировали по-разному, проявляя как негативную, так и позитивную регуляцию экспрессии генов в зависимости от тестируемой ткани и сигналов. Например, все элементы промотора AtAOX1c, кроме C (–342 п.н.), проявляли в линии ΔAt2g19080 (c повышенным уровнем транскриптов AOX1c и белка АО) положительную регуляцию экспрессии, тогда как в суспензии клеток и листьях растений A. thaliana экотипа Col-0 некоторые элементы, в частности E (–230 п.н.), функционировали как негативные регуляторы [25]. Полногеномный анализ на основе программы Expression Angler и ACT выявил общие функциональные элементы в промоторе AtAOX1c и генов, экспрессия которых связана с процессами деления и роста клеток. Это дало основание полагать, что экспрессия AtAOX1c регулируется сигналами, связанными с ростом и развитием [25].

Проведенный нами анализ промоторов всех генов AtAOX выявил во всех генах общие CAREs, участвующие в обеспечении чувствительности к стрессам разной природы [35, 36]. G-box (CACGTG) присутствует в промоторе не только АОХ1а, но и АОХ2 [36]. Гены AOX1a, AOX1c и AOX1d обогащены в промоторах такими CAREs, как MYB4-BSM (Binding Site Motif), SORLEP3, SORLIP2 и CCA1-BSM, что указывает на зависимость их экспрессии от изменений функционирования хлЭТЦ (ЭТЦ хлоропластов) на свету. В A. thaliana CCA1-BSM может участвовать в регулируемой фитохромом экспрессии генов LHCB, кодирующих хлорофилл a/b-связывающие белки [37]. Полная последовательность UVBox^ANAC13 (CCAAGG), участвующего в обеспечении высокой чувствительности к УФ-В [38], обнаружена в генах AOX1a и AOX1c [35]. При этом промоторы всех генов АОХ1 содержали укороченную версию этого элемента (CCAAG), свойственную генам с более поздним (по сравнению с генами, имеющими полную последовательность UVBox^ANAC13) характером УФ-В-индуцируемой экспрессии [38]. Светочувствительные CAREs, так называемые MRE^CHS-like box и ACE^CHS-like box, найдены в промоторах всех генов AtАОХ, за исключением AOX1b [35], и в большом количестве содержатся в промоторах УФ-индуцируемых генов, таких как CHS (ген халкон-синтазы) [38]. Наличие общих CAREs указывает на комплементарный характер взаимодействия генов AtАОХ на транскрипционном уровне в определенном диапазоне ответа на стресс. Так, при действии повышенной физиологически допустимой дозы УФ-В и умеренного уровня освещенности (400 мкмоль/(м² с)) антисмысловые по AOX1a растения A. thaliana проявляли компенсаторную индукцию экспрессии других генов АО [35, 36]. Вместе с тем, активность генов AO, в частности, при действии повышенной освещенности, скорее всего, регулировалась по разным сигнальным путям. На это указывал кластерный анализ, который выделил гены АО в разные кластеры в зависимости от характера их экспрессии [36].

Механизмы посттранскрипционного контроля экспрессии генов АО, связанные с процессингом РНК, изучены слабо. Первые сведения о регуляции генов АО на посттранскрипционном уровне появились в работе по изучению экспрессии SgАОХ в початках Sauromatum guttatum [39]. Было обнаружено многократное усиление экспрессии гена при отсутствии изменения скорости транскрипции в изолированных ядрах. Полагают, что помимо альтернативного полиаденилирования, выявленного в нескольких генах АО [14], в процессинге РНК АОХ велика роль кэпирования, связанного с фосфорилированием 5'-конца транскрипта и присоединением через трифосфатный мостик 7-метилгуанозина (кэп-структуры) [40]. В животных клетках кэпирование частично регулируется мишенью рапамицина (TOR) – протеинкиназы серин-треониновой специфичности. TOR есть у всех эукариот. TOR в составе мультимолекулярных сигнальных комплексов (у животных и дрожжей их два, у растений только один) регулирует клеточный рост и выживание, активируя быстрый синтез белка, что особенно важно при стрессе. В растениях A. thaliana TOR может служить акцептором протеинкиназы KIN10, возможно, через посредника в ядре – циклинзависимой киназы Е1 (CDKE1), индуцирующей экспрессию AOX1a [40].

ПАТТЕРНЫ ЭКСПРЕССИИ И ТРИГГЕРЫ АКТИВАЦИИ АОХ

Экспрессия генов АО стала интенсивно изучаться после клонирования первой кДНК АОХ из Sauromatum guttatum [41]. К настоящему времени получено много информации о характере экспрессии АОХ у различных видов. Показано, что экспрессия АОХ может быть конститутивной в процессе роста и развития, а в условиях стресса – сильно меняться [5, 14, 42]. Ортологичные гены, как правило, проявляют одинаковый характер экспрессии, например, Aox2a и Aox2b сои и вигны китайской [43]. Однако есть и противоположные примеры. Ортологичные гены АОХ1а и АОХ1с пшеницы и риса проявляли разный характер экспрессии в процессе зеленения листа [44, 45].

Индукция экспрессии АОХ выявлена при воздействии абиотических и биотических факторов – температуры [46, 47], засоления [48], засухи [49], гипоксии [50], высокой освещенности [31, 36, 51, 52], УФ-В облучения [35], тяжелых металлов [52, 54], озона [55], дефицита азота [56], патогенов [57] и других видах стресса [52, 58]. Некоторые имеющиеся в литературе сведения об экспрессии АОХ высших растений обобщены в Дополнительных материалах (таблица 1), из которой видно, что гены АО проявляют дифференциальный характер экспрессии, паттерны экспрессии одного и того же гена АО могут зависеть от типа ткани, условий роста, продолжительности действия стресс-фактора.

Гены подсемейства АОХ1, как правило, стресс-индуцируемые. АОХ1а A. thaliana наиболее чувствителен к стрессу, но у других видов растений этот ген может и не проявлять подобную реакцию (Дополнительные материалы, таблица 1). Экспрессия АОХ2 чаще регулируется процессами роста и развития, что не исключает вовлечение AOX2 в ответы на действие стрессоров. В частности, экспрессия всех четырех генов обоих подсемейств AOX у Daucus carota имела дифференциальный орган- и рост-специфичный характер [18]. Ген DcAOX1a проявлял более выраженный конститутивный характер экспрессии в листе и в процессе образования de novo вторичной флоэмы корня эксплантов. Известными триггерами индукции генов АОХ являются дисфункции митохондрий, вызванные как действием ингибиторов ЭТЦ [28, 51], так и мутациями генов, кодирующих митохондриальные белки комплексов ЭТЦ [59, 60]. Полагают, что дефекты ЭТЦ вследствие мутаций генов и ингибиторы ЭТЦ и ЦТК формируют редокс-сигналы, которые передаются в ядро и индуцируют экспрессию АОХ и других, не только “дыхательных”, генов [26, 28, 60]. Экспрессия AOX (на примере AtAOX1a) – широко используемая модель в изучении митохондриального ретроградного сигналинга.

Таким образом, дифференциальный характер экспрессии генов АОХ связан с генотипическим и фенотипическим разнообразием клеток, регуляцией активности генов в зависимости от поступающих сигналов, контролем экспрессии АОХ на разных уровнях реализации наследственной информации. Это обеспечивает пластичность метаболизма растительной клетки, в которую вовлечена энергодиссипирующая функция митохондрий [5, 8, 14, 34].

СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ АОХ

Трансдукция сигнала, вызывающего экспрессию АОХ, может происходить по антероградному и ретроградному путям [11, 13, 30]. Антероградная регуляция экспрессии генов представляет собой нисходящий (top-down) путь от ядра к органелле. Ретроградная регуляция направлена по восходящему (bottom-up) пути от органелл к ядру [12, 61]. Принято считать, что антероградный сигналинг протекает на нескольких уровнях – от транскрипционных до посттрансляционных; сигналы, как правило, связаны с процессами роста и развития растений, и действием внешних факторов. Ретроградная регуляция экспрессии генов происходит в ответ на изменение условий внутренней среды и позволяет органеллам влиять на экспрессию ядерных генов [12, 30, 61].

Митохондриальная ретроградная регуляция экспрессии АОХ. Наиболее полно описана митохондриальная ретроградная регуляция (МРР-путь) экспрессии АОХ, подтверждением существования которого являются не только данные об индукции экспрессии АОХ ингибиторами ЭТЦ, ЦТК и вследствие дефектов комплексов ЭТЦ, но и наличие в промоторе АОХ (на примере AtAOX1a) МРР-участка, необходимого для индукции экспрессии гена [28, 34]. Ингибиторы – антимицин и монофторацетат – имитируют соответственно АФК-зависимый и АФК-независимый сигнальные пути индукции экспрессии генов АО [11, 13, 28].

Дисфункции в ЭТЦ, связанные с нарушением потока электронов, приводят к образованию избыточного количества АФК – супероксид-радикала (${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$) и перекиси водорода (Н₂О₂). Местом генерации ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ являются комплекс I, II и III, а донором электронов для кислорода – убисемихиноновый интермедиат [13]. Образуемый в ЭТЦ ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ нестабилен (время жизни – 10^–12 с) и быстро нейтрализуется в Н₂О₂ при участии Mn-зависимой супероксиддисмутазы (MnSOD), а также спонтанно. Показано, что сверхэкспрессия MnSOD снижала экспрессию АОХ1а и АОХ1b при воздействии холодового стресса в растениях риса [62], а нокаутная по MnSOD линия Arabidopsis thaliana проявляла усиление экспрессии AOX1а в ответ на обработку AlCl₃ по сравнению с линией дикого типа [63]. Эти данные свидетельствуют о том, что содержание АФК в митохондриях, тесно связанное с активностью MnSOD, может быть первичным сигналом, индуцирующим МРР-зависимую индукцию экспрессии АОХ. Н₂О₂ является вторичным мессенджером АФК-зависимой МРР-экспрессии АОХ [13].

Ранее считалось, что H₂O₂ индуцирует экспрессию AOX путем прямого окисления или модулирования процессов фосфорилирования ТФ, контролируя инициацию транскрипции [64]. Однако стало известно, что антимицин – ингибитор комплекса III – вызывал более быструю индукцию экспрессии АОХ1 в клетках табака, чем экзогенная перекись, накапливающаяся во внутриклеточном пространстве [65]. Это дало основание полагать, что АФК митохондриального происхождения более эффективны в индукции экспрессии АОХ1, чем АФК цитоплазмы или хлоропластов. В этой работе было также показано, что бонгкрековая кислота, ингибитор митохондриальной поры проницаемости (PTP), участвующей в запуске апоптоза у животных, блокировала антимицин-, H₂${\text{O}}_{2}^{ - }$ и СК-зависимую индукцию АОХ1. Поэтому возникла альтернативная гипотеза, объясняющая АФК-зависимую индукцию экспрессии АОХ, которая построена на аналогии запуска процесса программируемой гибели клетки (ПГК) у животных [65, 66]. АФК, в частности перекись, накапливающаяся при стрессе во внутриклеточном пространстве и способная легко проникать через клеточные мембраны, может вызывать дисфункции митохондрий и открытие митохондриальных пор (PTP), что сопровождается диссипацией мембранного потенциала и является решающим этапом сигналинга индукции АОХ [65, 66]. Полагают, что временное открытие PTP – важный механизм клеточного редокс-сигналинга и способ коммуникации митохондрий с ядром [65].

NAC-содержащие ТФ (ANAC017, ANAC013) являются прямыми активаторами транскрипции АОХ1а [29, 34] (рис. 1). ANAC017 – конститутивно экспрессируемый ТФ, связанный с эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) через С-концевой трансмембранный домен. В ответ на антимицин или при митохондриальных дисфункциях происходит протеолитическое отщепление C-концевого домена ромбовидной протеазой, а N-концевой домен высвобождается из ЭР и мигрирует в ядро, связываясь с промотором AOX1а. В ANAC017 обнаружен сайт расщепления ромбовидной протеазой между двумя доменами, а ингибиторы ромбовидной протеазы снижают индуцируемую антимицином экспрессию AOX1а [34]. Предполагается, что ромбовидная протеаза активируется H₂O₂ митохондриального происхождения, так как мутанты ANAC017, как правило, не проявляют экспрессию АОХ1а при обработке экзогенной H₂O₂. ANAC017 непосредственно связывается с сайтом (T/G)CGTGT промотора AtAOX1a и может активировать другие ТФ семейства NAC, например, ANAC013, являющимися положительными регуляторами экспрессии АОХ1а. Однако другие ТФ NAC не могут компенсировать отсутствие ANAC017 [29].

Рис. 1.

Схема сигнальных путей регуляции экспрессии генов AОХ. Внешние и внутренние (митохондриальные и пластидные) сигналы поступают в ядро для активации АОХ (на основе схем, представленных в работах [1, 5, 12]). Путь митохондриальной ретроградной регуляции экспрессии АОХ (МРР-путь) (на примере AOX1a Arabidopsis thaliana, AtAOX1a) включает поступление сигнала из митохондрий (АФК, цитрат, редокс-сигнал) с последующим высвобождением транскрипционного фактора (ТФ) семейства NAC (NAC17) из эндоплазматического ретикулума (ЭР), который (как и другие ТФ NAC) является положительным регулятором экспрессии AtAOX1a. ABI4 – репрессор AtAOX1a. ТФ WRKY могут быть как положительными (WRKY63), так и отрицательными (WRKY15/40) регуляторами экспрессии АОХ1а. Другой путь трансдукции сигнала включает активацию протеинкиназы (KIN10), которая взаимодействует с медиаторным в ядре комплексом CDKE1, индуцирующим АОХ1а. Ауксин и ТФ MYB29 – негативные регуляторы экспрессии АОХ1а.

Промотор AtАОХ1a находится под контролем разных ТФ, напрямую взаимодействующих с регуляторными элементами и влияющих на экспрессию AtAOX1a [5]. Выявлено, что WRKY связываются в трех сайтах W-box (–291, –373 и –412 п.н.) промотора AtAOX1a. WRKY15 и WRKY40 являются репрессорами ретроградной экспрессии АОХ1а и двух других ядерно-кодируемых генов митохондриальных белков A.thaliana – NDB2 (гена “внешней” НАДФ·Н-дегидрогеназы) и UPOX (UP-regulated by OXidative stress), чувствительных к окислительному стрессу [33]. Но если ABI4 – репрессор АОХ1а в нормальных условиях, то WRKY15 и WRKY40 ограничивают экспрессию АОХ1а в условиях дисфункции ЭТЦ, в частности, при обработке антимицином. Предположительно, WRKY63 функционирует как активатор экспрессии АОХ1а. Установлено, что WRKY63 участвует в реакции на высокую освещенность [33]. Авторы полагают, что WRKY40 и WRKY63 конкурируют за сайты связывания с промотором гена. Показано, что ауксин и ТФ MYB29 – это негативные регуляторы экспрессии AtАОХ1а, функционирующие через гормональные сигнальные пути и взаимодействующие с ТФ ERFs (Ethylene Response Factors) и WRKY [30, 67].

Трансдукция сигнала из митохондрий также может идти по пути активации протеинкиназы KIN10, которая взаимодействует с CDKЕ1, являющейся в ядре частью медиаторного комплекса, индуцирующего АОХ1а [40]. В исследованиях на rao1 мутантах выявлено, что CDKE1 участвует в восприятии любых клеточных сигналов, в том числе, антероградного происхождения (например, вызываемых накоплением H₂O₂, холодовым воздействием) с последующей индукцией АОХ1а.

Разделение АФК-зависимого и АФК-независимого путей МРР-сигналинга АОХ условно, поскольку АФК является потенциальной молекулой в трансдукции сигнала, получаемого из митохондрий вследствие ингибирования как антимицином, так и МФА [28]. Генерация АФК обнаружена в клетках суспензии табака при воздействии на них 5 мМ МФА [68]. Однако это не исключает возможность передачи сигнала к промоторной области [13, 28]. На это указывает тот факт, что разные концентрации МФА, регулирующие экспрессию АОХ, могут по-разному влиять на образование АФК, вплоть до отсутствия эффекта [28]. Показано также, что ТФ WRKY участвует как в антимицин-, так и в МФА-зависимой индукции AtAOX1a по МРР-пути, однако мутанты в области W-бокса сильнее реагировали экспрессией АОХ1а на антимицин, чем на МФА.

Помимо Н₂О₂, другими сигнальными молекулами, участвующими в регуляции экспрессии АОХ, являются NO, салициловая кислота (СК), жасмоновая кислота, этилен, ионы Ca²⁺ [12, 13]. Хорошо известен эффект накопления Н₂О₂, NO и СК, а также увеличение экспрессии АОХ1а и содержания белка АО в процессе развития реакции сверхчувствительности (СВЧ) растений в ответ на атаку патогена [57]. Развитие СВЧ – хорошая модель изучения сигнальных путей, однако до сих пор все этапы этих путей не расшифрованы. Показано, что генерация супероксидного взрыва (“${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ burst”) в ответ на инокуляцию Nicotiana tabacum бактериями-патогенами зависела от наличия АОХ1а в геноме растения [57]. Именно генерация ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ в митохондриях инициировала реакцию СВЧ, хотя другие АФК также участвовали в ее развитии. Отсутствие АОХ1а приводило к задержке ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ взрыва, колоколизации NO, ONOO^– (пероксинитрита – продукта взаимодействия ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ и NO) и развития реакции СВЧ в ответ на внедрение патогена так же, как и влияние антимицина, ингибирующего комплекс III. Однако позже (по сравнению с диким типом) происходил резкий супероксидный взрыв. ONOO^– участвует в нитровании тирозиновых остатков белков, что влияет на их модификацию, чувствительность к протеазам и развитие ПГК. Сверхэкспрессия АОХ1а, напротив, предотвращала развитие супероксидного взрыва, вызываемого действием антимицина. Сделано предположение, что электронный транспорт, очевидно на уровне комплекса III, является мишенью реакции, вызывающей сигнал для развития СВЧ, а АОХ – ключевая детерминанта митохондриальной динамики АФК в ответ на атаку патогена [57, 66]. Причиной супероксидного взрыва на ранних этапах развития СВЧ является скоординированное совместное подавление экспрессии генов и активности АО и MnSOD.

Усиление экспрессии АОХ1а как защитная ответная реакция на биотический стресс, скорее всего, связано с влиянием СК. В низких концентрациях (менее 1 мМ) СК как аналог хинона взаимодействует с комплексом I и II, нарушая транспорт электронов в ЭТЦ, что инициирует сигнальные пути, приводящие к экспрессии генов АО [66]. Вместе с тем, СК индуцирует экспрессию АОХ не напрямую через ТФ, связывающиеся с промотором гена (СК-чувствительный элемент as1 отсутствует в промоторе AtАОХ1а), а скорее всего посттранскрипционно [26]. Полагают, что EDS1 (Enhanced Desease Susceptibility 1) и PAD4 (PhytoAlexin Defficiency 4) – липазоподобные белки, контролирующие СВЧ-ответ, накопление СК и СК-зависимый сигналинг, но функционирующие в upstream-части СК-сигналинга, регулируют экспрессию АОХ1а (показано на примере AtAOX1a). Возможно, что EDS1/PAD4-сигнальный путь является уникальным в индукции экспрессии АОХ1а; это объясняет, в частности, причину отсутствия в некоторых случаях коэкспрессии АОХ1а с NDB2 при действии Н₂О₂ или ротенона – триггеров запуска МРР-пути [26].

Белки EDS1 и PAD4 как посредники участвуют в трансдукции сигнала ПГК, обусловленного активацией Тоll-подобных рецепторов иммунного ответа [69]. Известно, что АО участвует в процессе ПГК. В митохондриальном пути передачи сигнала, по которому реализуется большинство форм апоптоза, формированию PTP и выходу цитохрома с и эндонуклеаз в межмембранное пространство митохондрий, а затем в цитоплазму, предшествует резкое увеличение АФК. У животных выход цитихрома с – ключевое событие, индуцирующее запуск каскада реакций активации каспаз и реализацию ПГК. Регуляция митохондриального пути ПГК включает механизмы, контролирующие уровень АФК. Показано, что перенос электронов по АП препятствует накоплению АФК и поддерживает митохондриальное дыхание, когда ЦП ограничен ингибиторами или индуцирующими ПГК соединениями [69]. Таким образом, АО регулирует клеточный уровень АФК, который, в свою очередь, определяет восприимчивость к развитию апоптоза, поэтому AO назван “белком выживания” [69].

Роль ионов Ca²⁺ в МРР-зависимой индукции АОХ1а менее ясна. Накопление Ca²⁺ в клетке является признаком развивающегося стресса. В животной клетке митохондрии являются “хранилищем” ионов Ca²⁺ и обмениваются ими с ЭР, создавая кальциевые микродомены. В растительной клетке обмен кальция между компартментами осуществляется, скорее всего, консервативными белками-транспортерами, в частности, Ca²⁺/H⁺-антипортерами семейства LETM (Leucine zipper, EF hand-containing Transmembrane Protein), имеющими митохондриальную локализацию [11]. Показано, что при солевом стрессе обмен Ca²⁺ между митохондриями и ЭР в растениях A. thaliana был связан с индукцией АОХ1а. При этом Н₂О₂-стимулируемый синтез ТФ WRKY15 указывал на участие МРР в реакции на этот стресс, и важную роль в этом играет индукция АОХ1а [70]. Известно, что ЭР посылает сигналы в ядро в процессе индукции реакции на мисфолдинг белков (UPR, Unfolded Protein Response), представляющего эволюционно консервативный транскрипционный ответ для сохранения гомеостаза ЭР при накоплении неправильно сложенных белков. UPR может участвовать в Са²⁺-опосредованной индукции AOX1a, регулируя активность кальциевой помпы ЭР, что свидетельствует о тесной связи между ЭР, ядром и МРР [70].

Антероградная регуляция экспрессии генов АОХ. Трансдукцию сигнала, вызывающего экспрессию АОХ, по антероградному пути могут запускать АФК или другие сигнальные молекулы внутриклеточного происхождения, а также внешние сигналы разной природы [11–13]. Считается, что экспрессия ядерно-кодируемых генов митохондриальных белков в значительной степени представляет собой антероградный контроль функции митохондрий [12]. Усиление экспрессии генов митохондриальных белков обнаружено при прорастании семян и при прохождении других важных фаз развития растения. Это указывает на скоординированный характер экспрессии генов с процессами роста и развития, а также на их вовлеченность в гормональный сигналинг целостного растения [12].

Экспрессия генов АО A. thaliana обнаружена, главным образом, в органах с потенциально высокой скоростью метаболизма [42]. Усиленная экспрессия AtAОХ2 выявлена в семенах, AtAОХ1b – в молодых соцветиях; экспрессия AtAOX1d функционально приурочена к процессу старения. Экспрессия всех генов AtАОХ зависела также от фазы роста и развития [42]. Промотор гена AtАОХ1с содержит близко к ССТ элементы сайта II [25], взаимодействующие с ТФ семейства TCP (Teosinte branched 1 Cycloidea Proliferating cell factor) класса II – негативных факторов клеточного деления [67]. TCP класса I считаются позитивными регуляторами роста и пролиферации клеток. Однако специфичность последовательности сайта связывания TCP обоих классов не является абсолютно консервативной, что оставляет возможность конкуренции за сайты связывания между TCP класса I и II. TCP участвуют в трансдукции сигналов гормонального происхождения и являются редокс-чувствительными регуляторами ядерно-кодируемых митохондриальных белков компонентов ЭТЦ, играя важную роль в митохондриальном биогенезе [67].

Экспрессия АОХ не только находится под гормональным контролем регуляции, но и сигнальные пути активации АОХ вовлечены и пересекаются с сигналингом гормонов. Мутанты A. thaliana с нарушением полярного транспорта ауксина (rao3/big, rao4/pin-formed1, rao5/multidrug-resistance1/abcb19) проявляли усиление экспрессии АОХ1а [67]. Индукция экспрессии репортерного гена люциферазы светлячка, контролируемого промотором AOX1a, подавлялась аналогами ауксина и усиливалась блокированием транспорта гормона. Кроме того, антимицин ингибировал передачу сигналов ауксина и индуцировал экспрессию АОХ1а, а обработка ауксином частично снимала этот эффект. Это свидетельствует об антагонистической взаимосвязи между МРР-сигналингом и кинетикой клеточного ответа на ауксин. Показано, что ответ клетки на ауксин может положительно регулироваться митохондриальной функцией через TCP. Сделано предположение, что передача сигнала митохондриального стресса и трансдукция сигналов ауксина регулируются реципрокно, уравновешивая ростовую и стрессовую реакцию организма [67].

Свет является источником энергии для всех растений. Восприятие светового сигнала клеткой осуществляется через фоторецепторы (фитохромы, фототропины, криптохромы и др.) [71]. Сигнальные антероградные каскады, приводящие к изменениям экспрессии регулируемых светом генов, начинаются с активирования фоторецептора и его миграции в ядро (у фитохромов). В ядре активированный фоторецептор взаимодействует с Е3-убиквитин-лигазным комплексом СОР1/SPA1, высвобождающим ТФ HY5, который инициирует транскрипцию целевых генов. Фитохромы непосредственно могут взаимодействовать с фитохром-инактивирующими факторами, например, PIF3, содержащими домен связывания ДНК, свойственный факторам транскрипции. В трансдукции воспринимаемого фоторецепторами светового сигнала могут участвовать вторичные мессенджеры – Ca²⁺, cAMP, cGMP, G-белки и другие компоненты. Считается, что фитохром А играет ключевую роль в процессе деэтиоляции и фотоморфогенеза, особенно в условиях слабой освещенности, а фитохром B – в реакции растений на повышенную освещенность, хотя оба фитохрома важны в процессе фотоморфогенеза [71].

Проблема световой регуляции экспрессии АОХ в настоящее время интенсивно исследуется, в том числе и в наших работах [7, 32, 36, 44, 72]. Считается, что АО участвует в окислении избытка НАДФ·Н хлоропластного происхождения, способствуя тем самым “разгрузке” хлЭТЦ [73, 74]. Показано, что в световой регуляции экспрессии АОХ1а A. thaliana могут участвовать фитохромы А, B, криптохромы 1, 2 и фототропины 1, 2 [31, 75]. Полагают, что сигнал от фоторецепторов до этапа транскрипции АОХ передается по известным механизмам фототрансдукции фоторегулируемых, в первую очередь, фотосинтетических генов [76]. Светозависимый характер индукции АОХ1а выявлен в листьях A. thaliana [36, 51, 75], Triticum aestivum [32], AOX2a – семядолях Glycine max [77], АОХ1с – листьях Oryza sativa [44].

Анализ промотора AtAOX1a длиной 1000 п.н. выше ССТ выявил 27 светозависимых CARE, из них 9 были строго индуцируемыми светом [31]. В промоторе гена АОХ1а A. thaliana также найден часто встречающийся мотив G-box (CACGTG) [78] и CARE I1 (ACGTG, –93 п.н. от ССТ), перекрывающийся с G-box [26]. Известно, что G-box – это палиндромный консервативный CARE промоторов большинства фоторегулируемых генов, является сайтом связывания транскрипционных факторов GBFs (G-box-Binding Factors) семейства bZIP [79]. Фотоиндуцируемый транспорт GBFs (в частности, GBF-1) из цитоплазмы в ядро является важным этапом трансдукции сигнала между фоторецепцией и светозависимой экспрессией генов. G-box также найден в промоторе АОХ1а Triticum urartu (GenBank: KD149474.1, –221 и –340 п.н. от ССТ), диплоидного прародителя гексоаллоплоида Triticum aestivum [32]. Анализ имеющихся данных дает основание предполагать наличие механизма, посредством которого АОХ1а (по крайней мере, в A. thaliana и Triticum aestivum) связан с фотосинтетической функцией. Таким образом, изучение промотора AtAOX1a позволило выявить светоиндуцируемые CARE, управляемые пока неизвестными ТФ, а также элемент I1, возможно отвечающий за связь АОХ с фотосинтезом. Роль разных CAREs в промоторе АОХ1а и распознающих их ТФ в фотозависимой регуляции экспрессии AOX1a остается предметом исследований.

На основе усредненных величин экспрессии генов в процессе зеленения относительно величин экспрессии генов в этиолированном листе пшеницы, нами предложена схема индукции АОХ и генов других дыхательных компонентов энергодиссипирующих систем ЭТЦ в процессе зеленения листа пшеницы [7]. “Внешние” и “внутренние” альтернативные (НАД(Ф)·Н-дегидрогеназы участвуют в транспорте электронов к убихинону в обход комплекса I. К системам, рассеивающим протонный градиент, образуемый в ходе реакций в ЭТЦ, относятся разобщающие белки (UCP), подобные UCP животных. Свет по фитохром-опосредованному пути индуцирует экспрессию АОХ1а, затем вовлечение АО в дыхание. В период быстрого развития тилакоидной системы это способствовало синтезам de novo и предотвращению окислительного стресса [32]. После 6 ч зеленения снижение АП изменяло редокс-состояние ЭТЦ и формировало редокс-сигнал, передающийся от митохондрий к ядру по ретроградному пути, что инициировало экспрессию генов других дыхательных нефосфорилирующих путей и антиоксидантных ферментов, участвующих в поддержании редокс-баланса клетки. После 24 ч сигналы из зрелых хлоропластов [80] поступали в ядро, регулируя экспрессию соответствующих генов [32]. Возможно, это были биогенные сигналы, главным участником которых является GUN1 (Genome UNcopled1) – локализованный в хлоропластах белок, участвующий в гомеостазе пластидных белков. Предполагается, что GUN1 генерирует и передает неизвестный сигнал, активирующий ТФ ABI4, который далее блокирует экспрессию ядерных фотосинтетических генов [81, 82]. Считается, что GUN1 интегрирует многочисленные пластидные сигналы, связанные с состоянием тетрапирролов, хлЭТЦ и, в целом, редокс-состоянием пластид. Участие GUN1/ABI4-сигнального пути в регуляции экспрессии АОХ1а и других “дыхательных” генов в процессе становления фотосинтетического аппарата – абсолютно не изученный вопрос.

При этом не исключена и роль МРР-зависимого пути индукции AOX1a в процессе зеленения, в частности, через изменение содержания органических кислот ЦТК [7]. Нами обнаружено усиление дыхания митохондрий и потенциальной активности АП в присутствии малата в первые 6 ч деэтиоляции, что могло свидетельствовать не только об интенсификации функционирования комплекса I ЭТЦ в этот период, но и увеличении активности малатдегидрогеназы ЦТК [7]. Известно, что ЦТК на свету продолжает функционировать с некоторыми модификациями [83]. Показано, что изменения в содержании органических кислот ЦТК (цитрата, малата, 2-оксоглуатарата) влияют на экспрессию генов АО [68]. В частности, в сигналинге AtAOX1a при ингибировании ЦТК может быть (как и в АФК-зависимом пути) задействован МРР-участок промотора гена. Сообщалось о роли WRKY в ответе AtAOXla на МФА, который ингибирует аконитазу ЦТК и приводит к накоплению цитрата [28]. Отметим также, что участие АФК-зависимого МРР-пути сигналинга АОХ1а при зеленении листа пшеницы менее очевидно. Известно, что этиолированные клетки защищены от чрезмерного образования АФК функционированием светозависимой НАДФ·Н-протохлорофиллидоксидоредуктазы (LPOR); образуемые тройные комплексы хлорофиллид-LPOR-НАДФ·Н являются мощными гасителями энергии [84]. В нашем исследовании образование АФК в листьях пшеницы даже снижалось на ранних стадиях биогенеза хлоропластов [32].

Полученные нами данные позволили заключить, что альтернативный путь дыхания через АО действует как модулятор митохондриальной функции во время деэтиоляции и предположить роль АО в координации вовлечения других дыхательных нефосфорилирующих путей (НФП) для усиления стресс-ответа и стресс-сигнала. Идея о роли АО в координации вовлечения других дыхательных путей и клеточных защитных систем высказана и другими авторами [1, 60]. Исследования с АОХ1а-мутантами A. thaliana показывают, что дефицит (экспрессии гена или количества белка) АО, в отличие от компонентов других НФП, вызывал модификацию профилей экспрессии многих генов и целого транскриптома [1, 11, 36, 85]. Существуют также данные, которые подтверждают АОХ1а-зависимую экспрессию генов других НФП [51, 56], но показывают отсутствие зависимости АОХ1а от этих генов [86]. Растения A. thaliana с одновременной сверхэкспрессией АОХ1а и NDB2 легко переносили воздействие засухи и высокой освещенности, как и растения со сверхэкспрессией только одного гена – АОХ1а, в отличие от растений со сверхэкспрессией NDB2 [87]. Промоторы большинства генов НФП A. thaliana имеют общие с АОХ1а стресс-чувствительные CAREs [26, 35, 36]. Однако наличие и количество общих мотивов в промоторах не всегда коррелировало с экспрессией генов, что указывает лишь на потенциальную способность генов взаимодействовать на транскрипционном уровне [35, 36, 51].

Хлоропласт-зависимые сигнальные пути экспрессии АОХ. Хлоропласты и митохондрии тесно связаны не только метаболическими реакциями, но и взаимодействиями на уровне ретроградных и антероградных сигналов [1, 13, 30]. Эта взаимосвязь позволяет избежать окислительного стресса в хлоропластах и, в целом, в фотосинтезирующей клетке. Считается, что АО совместно с другими компонентами ЭТЦ участвует в окислении избытка восстановителей, транспортируемых посредством разных челночных механизмов из хлоропластов в митохондрии [73, 74]. АФК, редокс-статус компонентов ЭТЦ (главным образом, пластохинонов (PQ)), редокс-активные молекулы стромы пластид (тиоредоксин, глутатион), а также интермедиаты биосинтеза тетрапирролов выполняют роль сигнальных молекул пластидных ретроградных путей, контролирующих экспрессию целевых ядерных генов, в том числе компонентов митохондриального дыхания [81, 82, 88].

Экспрессия АОХ тесно связана со статусом хлоропластов. В зеленеющих при повышенном освещении (500 мкмоль/(м ² с)) листьях A. thaliana с нокаутом AOX1a (aox1a) и растений дикого экотипа, обработанных салицилгидроксамовой кислотой, ингибитором АОХ, уменьшение соотношения НАДФ⁺/НАДФ·Н сопровождалось снижением эффективности импорта пластидного белка [89]. Сверхэкспрессия AOX1a, напротив, индуцировала накопление хлорофилла и усиливала импорт пластидного белка. Пул убихинона (UQ) и PQ в aox1a мутантах уже при умеренном освещении (350 мкмоль/(м² с)) имел более восстановленный статус [90], а величина максимального квантового выхода фотосистемы II (F_v/F_m) – более низкие значения, чем у растений дикого типа [91]. На мутантах Nicotiana tabacum L. с разным уровнем экспрессии АОХ1а показано, что акклиматизация растений в условиях повышенного освещения и засухи была направлена на избежание перевосстановления пула PQ путем снижения количества белка светособирающего комплекса II LHCB2 и увеличения количества АО [92]. Авторы предположили, что исходящий из хлЭТЦ сигнал регулировал количество обоих белков, способствуя поддержанию энергетического баланса хлоропластов при стрессе. Полученные данные подтверждают, что редокс-сигнал, ведущий к быстрой индукции экспрессии АОХ, направлен непосредственно из хлоропластов, а редокс-сенсором является уровень восстановленности пула PQ [1, 88].

Современные данные позволяют полагать, что митохондриальные ретроградные сигнальные пути связаны с сетью трансдукции клеточных сигналов и способны интегрировать информацию из нескольких источников, включая хлоропласт, а АО является активным участником в поддержании клеточного сигналинга и взаимосвязи хлоропластов и митохондрий. Ключевые ТФ регуляции экспрессии AtАОХ1а (ABI4, ANAC013, ANAC017, WRKY40, WRKY63) являются компонентами пластидного ретроградного сигналинга [12, 34, 82]. Сверхэкспрессия ANAC017 увеличивала экспрессию АОХ, но снижала экспрессию генов, кодирующих белки хлоропластов, включая LHCB [34]. В темноте митохондриальные дисфункции в листьях Nicotiana tabacum L., вызванные действием разных ингибиторов, усиливали экспрессию MDS-генов, включая гены АОХ1 [93]. Однако на свету экспрессия генов АОХ1 при действии антимицина снижалась, в отличие от миксотиазола, в присутствии которого экспрессия генов оставалась повышенной. Антимицин, как и миксотиазол, является ингибитором комплекса III ЭТЦ, но одновременно и ингибитором ферредоксин-хинон-редуктазы, участвующей в переносе электронов от акцепторного участка ФС I к PQ при циклическом транспорте электронов (ЦТЭ) в ФС I хлЭТЦ. Полагают, что ограничение с акцепторной стороны ЦТЭ в ФС I является источником ретроградных сигналов из хлоропластов. При этом миксотиазол увеличивал NPQ, а антимицин – снижал величину этого коэффициента [93]. Таким образом, снижение экспрессии АОХ1 при действии антимицина на свету было результатом взаимодействия сигналов, исходящих из обеих органелл. При этом в растениях со сверхэкспрессией АОХ1а ингибирование ЦТЭ при действии антимицина не влияло на экспрессию других MDS-генов на свету. Другими словами, редокс-состояние хлоропласта действительно влияет на экспрессию АОХ и других MDS-генов, но митохондриальная дисфункция, сопровождающаяся нарушением потока электронов к кислороду, является первичным условием индукции экспрессии генов. В целом, интеграция сигналов является одним из средств координации метаболических взаимодействий между органеллами, определяющими энергетический статус клетки. Ключевым сигналом этой интеграции, скорее всего, являются АФК, генерируемые обеими органеллами [1, 13].

Предполагается, что в фотосинтезирующей клетке, особенно в условиях высокой освещенности, перевосстановление пула UQ может быть также результатом увеличения фотодыхательного НАД·Н, и может привести к усилению образования АФК и, соответственно, открытия PTP с последующей индукцией АОХ [66, 88]. Фотосинтетическая активность вызывает изменение содержания основных углеродных метаболитов (сахаров, аминокислот, интермедиатов ЦТК), восстановительного потенциала пиридиннуклеотидов и тиоловых групп белков. Все это, предположительно, может влиять на экспрессию генов и активность митохондриальных белков, в том числе на АО [88]. Показано, что суточные изменения уровня сахаров (снижение – к концу ночи, увеличение – к середине дня), сопровождающиеся изменениями уровня различных гормонов (ауксина и цитокинина – к концу ночи, АБК – к середине дня), контролируют экспрессию многих генов, включая переносчиков ЭТЦ [76]. Это предполагает гормон-зависимую природу трансдукции сигналов, регулирующих экспрессию генов в течение суток. Возможно, этот механизм функционирует и в световой регуляции экспрессии АОХ, учитывая, что промотор гена AtAOX1a содержит мотивы ABRE [26]. Выявлено, что активность цитохромного и альтернативного пути in vivo в двойных cytc (cytc 1b2a и cyt c1b2b) мутантах A. thaliana зависела от условий фотопериода, определяющего функционирование и состав интермедиатов ЦТК, аминокислот и других метаболитов [94]. Изменения в метаболоме “сигнализировали” о стрессе, участвуя в запуске реакций по пути изменения первичного метаболизма для адаптации к разному фотопериоду. В частности, в условиях длинного дня cytc имели повышенную концентрацию гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) и активность АО. ГАМК может действовать в качестве внутреннего стресс-сигнала в растениях, изменяя активность ионных транспортеров. Помимо медиаторного эффекта, ГАМК непосредственно участвует в метаболизме, превращаясь в янтарную кислоту (сукцинат) с последующим включением в ЦТК. Так называемый ГАМК-шунт обеспечивает альтернативную поставку углерода в ЦТК в виде сукцината в обход сукцинил-КоА-синтетазы и снижает возможность циклической работы ЦТК, а вовлечение АО позволяет поддерживать редокс-статус ЭТЦ при дисфункции основного цитохромного пути. Полагают, что цитохром с как ключевой компонент ЦП играет важную роль в процессах роста и развития растений. Мутанты cytc имели низкий уровень гиббереллинов и характеризовались повышенным содержанием белков DELLA – репрессоров гибберелинового сигналинга. Поэтому метаболическая связь ГАМК-шунта и активации АО, скорее всего, также интегрирована в сеть гормонального сигналинга [94].

БЕЛОК АО И ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЕГО АКТИВНОСТИ

Проявлением экспрессии гена является транскрипция информации с ДНК на мРНК с последующей трансляцией в последовательность белковой молекулы. Альтернативная оксидаза (EC. 1.10.3.11) – убихинол: кислород-оксидоредуктаза – белок-гомодимер (масса одного полипептида около 32 кДа). Белок закреплен в одном слое внутренней митохондриальной мембраны с матриксной стороны большой гидрофобной частью, образованной спиралями [95]. АО содержит связанный гидроксо-мостиками двухъядерный центр из двух атомов железа смешанной валентности (Fe(II)/Fe(III)). Каждый из железных центров находится в пределах четырех-спиральной связки мономера, консервативен для всех изоформ АО и является активным сайтом восстановления кислорода до воды. Домены N-концов мономеров АО взаимодействуют ковалентной дисульфидной связью путем образования мостика между остатками цистеина, что и является основным в формировании структуры димера [95].

АО синтезируется на циторибосомах в виде белка-предшественника с соответствующей на N-конце сигнальной последовательностью (пресиквенсом) [96]. Импорт белка-предшественника АО в митохондрии происходит через специфические белковые поры-транслокаторы при участии шаперонов. После вхождения белка-предшественника в митохондрию пресиквенс удаляется ассоциированной с комплексом III митохондриальной пептидазой процессинга [96].

Восстановление дисульфидной связи в сульфгидрильную приводит к активации АО. Активность АО in vitro (в изолированных митохондриях) зависит от редокс состояния фермента, наличия субстрата (уровня восстановленности UQ), ключевых метаболитов (α-кетокислот), а также определяется количеством синтезированного белка. Механизмы активации АО in vitro изучены достаточно полно [3–5]. Система тиоредоксина (Trx) ответственна за восстановление белка АО, в свою очередь, она зависит от окислительно-восстановительного состояния пула НАД(Ф)·Н. Белок Trx, имеющий дисульфидную связь, использует для своего восстановления электроны и протоны от НАД(Ф)·Н, восстанавливая АО. При этом редокс-состояние пула НАД(Ф)·Н зависит от функционирования НАДФ⁺-зависимой изоцитратдегидрогеназы [5].

Активность восстановленной формы АО остается низкой и повышается в условиях высокой восстановленности UQ и/или в присутствии органических кислот. Основными метаболитами, активирующими восстановленный димер АО, являются α-кетокислоты – пируват и глиоксилат. Полагают, что взаимодействие остатков цистеина с α-кетокислотой приводит к образованию тиополуацеталя – полностью активированной формы АО [5].

В зависимости от кодирующих АО генов, существуют и разные изоформы АО. Большинство изоформ имеют два остатка цистеина, но есть исключения. Изоформы АОХ1А и АОХ1В A. thaliana и изоформы АО некоторых видов, например, томата и лотоса, имеют третий остаток цистеина около каталитического центра, содержащего атом железа [5]. Анализ посттрансляционной активации АО выявил специфичность изоформ белка по отношению к метаболитам-активаторам АО. АОХ1А более чувствительна к α-кетокислотам, чем АОХ1С и АОХ1D [97]. Кислоты ЦТК также активируют АО в изоформ-специфической манере. АОХ1А стимулируется ОА или 2-оксоглутаратом (2-OГ), АОХ1D – только 2-ОГ, а АОХ1С нечувствительна к интермедиатам ЦТК. При этом не все изоформы АО в позиции первого остатка цистеина содержат эту аминокислоту. Изоформы АОХ1В томата, лотоса, риса и АОХ3 NCS-мутантов кукурузы в этой позиции содержат серин и нечувствительны к α-кетокислотам, но активируются сукцинатом через образование эфирной связи [59, 97]. Изоформы АОХ2 менее изучены в отношении их активации метаболитами, однако имеющиеся в литературе данные показывают, что основным активатором АОХ2 является пируват [5].

Уровень экспрессии генов АО не всегда соответствует количеству белка АО, а последнее – способности или активности фермента in vivo (Дополнительные материалы, таблица 1, [6]). Более того, активность АО in vivo часто ниже, чем его способность (или максимальная активность), что связано с ограничением доступности субстрата, аллостерических активаторов (α-кетокислот), другими механизмами посттрансляционной активации фермента [6]. Активность АП in vivo (v_alt) может быть исследована методом изотопной (¹⁸О/¹⁶О) дискриминации [6]. Способность или максимальная активность АО (V_alt) определяется методом специфических ингибиторов, который широко используется в настоящее время [3, 6]. Ингибиторами АО являются гидроксамовые кислоты и n‑пропилгаллат. Величину V_alt получают по степени чувствительности дыхания к ингибитору АО и ингибитору цитохромоксидазы – цианида (CN^–) за вычетом остаточного дыхания (в присутствии обоих ингибиторов). Оптимальные концентрации ингибиторов получают путем титрования образца возрастающими концентрациями ингибиторов до насыщения скорости поглощения О₂ [3]. Иногда для обозначения дыхания по АП используют величину цианид-резистентного дыхания (ЦРД) – дыхания в присутствии только ингибитора ЦП. ЦРД не отражает корректно величину V_alt.

В исследованиях часто наблюдают более высокую способность АО по сравнению с активностью АО in vivo, а также отсутствие изменения уровня белка АО при действии стресс-факторов, что, по-видимому, связано с поддержанием способности быстрой активации фермента в обход высоко энергозатратных процессов синтеза белка de novo [6, 76]. Это придает дыхательному метаболизму пластичность и адаптивность, позволяет клетке быстро реагировать на изменения внутренней и внешней среды.

Вместе с тем, пока мало сведений, подтверждающих существование механизмов посттрансляционной регуляции AO in vivo. С использованием генетически модифицированных по АОХ растений показано, что уровень белка АО не является главным фактором регуляции активности фермента in vivo, но может влиять на активность АО in vivo при стрессе. В частности, в нормальных контролируемых условиях роста листья растений табака с повышенным содержанием белка АО (линия S24) имели более высокую величину ЦРД в отличие от антисенсовой линии AS8 со сниженным содержанием белка АО [98]. При этом все линии, включая дикий тип, не отличались по активности АП in vivo. Однако при действии разных видов стресса (засуха, фотоингибирование) листья линии S24, в отличие от дикого типа, проявляли повышенную активность АП in vivo. В другой работе, при кратковременном действии высокого уровня освещенности (800 мкмоль/(м² с)) активность АО in vivo усиливалась в листьях линии ХХ-2 с повышенным содержанием белка АО и не изменялась в антисенсовых по АОХ1а растениях A. thaliana (линия AS-12) [99]. Отметим, что неспособность к увеличению дыхания по АП в листьях AS-12 компенсировалась в данных условиях активацией дыхания по ЦП. Это дает основание полагать, что изменение метаболических процессов и/или биохимических механизмов регуляции активности белка АО являются решающими при распределении электронов по АП.

Роль АО в стабилизации пула убихинона обсуждается давно, но явных экспериментальных доказательств тому, что пул убихинона, а именно соотношение восстановленного убихинона к общему пулу убихинона (Q_r/Q_t), является фактором, регулирующим активность АО in vivo, пока нет [4]. Существуют лишь сведения, косвенно подтверждающие эту идею. В частности, при кратковременном фотоингибировании листья антисенсовой по АОХ1а линии A. thaliana показывали повышенный уровень Q_r/Q_t при отсутствии вовлечения АО in vivo и насыщения ЦП одновременно [99]. Известно также, что уровень восстановленности пула убихинона частично регулируется НАД(Ф)·Н-дегидрогеназой, при этом некоторые гены, кодирующие НАД(Ф)·Н-дегидрогеназы, коэкспрессируются с генами АО [35, 36, 51, 76, 78]. Все эти пока немногочисленные данные позволяют полагать, что уровень восстановленности пула убихинона, зависящий от концентрации НАД·Н в цитозоле и митохондриях, влияет на активность АО in vivo [6]. Высказано мнение, что для активации АО in vivo достаточны очень малые изменения величины Q_r/Q_t [4]. Существование механизмов посттрансляционной регуляции АО in vivo α-кетокислотами и системой Trx, регулирующей редокс-состояние фермента, пока еще не нашло экспериментальных подтверждений и требует дальнейших исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Альтернативная оксидаза митохондрий является ключевым ферментом, напрямую участвующим в регуляции энергетического и окислительно-восстановительного баланса митохондрий и целостной клетки. Анализ имеющихся в литературе данных свидетельствует о существовании разных механизмов и сложных комбинаций сигнальных путей, регулирующих экспрессию генов АО. AO может напрямую влиять на сигнализацию стресса, снижая генерацию АФК, и косвенно – через изменение энергетического статуса клетки, инициируя определенные сигнальные каскады. Обращает на себя внимание функционирование в клетке множества механизмов транскрипционного и посттранскрипционного контроля как подавления экспрессии генов АО в нормальных условиях, так и быстрой индукции их экспрессии при стрессе (на примере AtAOX1a). АО кодируется несколькими генами, что позволяет синтезировать разные формы белка, имеющие различные механизмы посттрансляционной активации. Это повышает защиту выполняемой белком функции в растительной клетке. В настоящее время у растений наиболее хорошо изучена митохондриальная ретроградная регуляция экспрессии АОХ. Нечеткие различия между митохондриальными и пластидными ретроградными сигнальными путями подчеркивают тесную взаимосвязь между органеллами, но усложняют исследования роли сигналинга АО в управлении энергетическим метаболизмом фотосинтезирующей клетки. Стало ясно, что сигнальные пути регуляции экспрессии АОХ пересекаются с гормональной системой сигналинга. Появились пока немногочисленные сведения о том, что АО является не только мишенью, но и регулятором стресс-сигнала, координируя экспрессию других генов ЭТЦ, формируя и/или усиливая стресс-сигнал. Все эти вопросы нуждаются в дальнейших исследованиях. Углубление знаний о сигналинге АО предопределяет их практическое использование в экологических, медицинских и сельскохозяйственных целях уже в неотдаленной перспективе.

Автор благодарна проф., д.б.н. Т.К. Головко, к.б.н. И.О. Велегжанинову и анонимным рецензентам за ценные замечания и советы при подготовке статьи к публикации.

Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 20-14-50366 Экспансия).

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов. Настоящий обзор не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследования.