Физиология растений, 2022, T. 69, № 2, стр. 171-178

ВВЕДЕНИЕ

Вторичные метаболиты растений являются биологически активными веществами, которые уже много веков использует человек в народной медицине. Они являются основой многих фармакологически важных препаратов и косметических средств. В природе растения производят эти вещества для защиты от неблагоприятных условий среды, что способствует их выживанию [1]. По своему строению “вещества вторичного метаболизма” представлены широким спектром соединений, среди которых многочисленная группа веществ с фенольной структурой [2].

Представители рода Dracocephalum (сем. Lamiaceae) содержат большое разнообразие биологически активных вторичных метаболитов (терпеноиды, флавоноиды, алкалоиды, лигнаны, фенолы, кумарины, глюкозиды) [3], многие из которых находят свое применение в медицине. Одним из таких соединений является розмариновая кислота. Она обладает противовирусным и противовоспалительным действием [4], кроме того, ее используют как противоопухолевое средство [5]. Имеются сообщения об активности розмариновой кислоты против вируса простого герпеса 1 (HSV-1), вируса иммунодефицита человека (HIV-1) и Helicobacter pylori [6]. Другое вещество – рабдозиин – обладает противоаллергической, антиоксидантной, нейропротекторной и анти-ВИЧ активностью [7]. Некоторые виды, например, D. kotsychyi Boiss., благодаря наличию в них розмариновой кислоты, используются как противоопухолевое средство [8].

Известно, что у растений в стрессовых условиях повышается синтез вторичных метаболитов [9]. Растения морских побережий находятся в стрессовых условиях из-за воздействия критических факторов окружающей среды (засоленность почвы, влияние ветра определенной направленности, импульверизация соленой водой, специфический температурный режим) [10]. Следовательно, виды, обитающие в таких экологических условиях, обладают повышенной устойчивостью к воздействию среды, и, вероятно, увеличивают биосинтетические процессы в сторону накопления защитных веществ (в том числе, вторичных метаболитов).

Одним из представителей рода Dracocephalum является змееголовник Харкевича (D. charkeviczii Prob.) − эндемичный (сихотэалинско-южнокурильский) вид [11]. D. charkeviczii встречается на склонах морских террас, на приморских песках и галечниках. Это циркум-япономорский прибрежноморской луговой и псаммо-петрофильный вид [12]. D. charkeviczii произрастает на островах залива Петра Великого, в окрестностях г. Владивостока, Уссурийском, Партизанском, Хасанском и Тернейском районах Приморского края, в Сихотэ-Алинском заповеднике и г. Южно-Курильске (о. Кунашир) Сахалинской области. За пределами России вид встречается в приморских районах Японии и Китая [12].

Информации о вторичных метаболитах, находящихся в растениях D. charkeviczii, и о лекарственном применении частей растения в известной нам литературе не приведено. Но принадлежность D. charkeviczii к семейству Lamiaceae, где у растений разных видов наблюдается накопление ценных для человека вторичных метаболитов, а также приуроченность к морским побережьям позволяют предположить их наличие.

Микроклональное размножение редких и малоизученных видов растений является одним из методов, способствующих увеличению доступности биологического материала для всестороннего изучения, а также сохранения и воспроизведения его ресурсов. Литературные данные по клональному микроразмножению D. charkeviczii отсутствуют. К тому же смена условий произрастания и культивирования часто приводит к изменениям в биосинтетических процессах [13] и, как следствие, в продукции вторичных метаболитов.

Цель работы состояла в изучении качественного и количественного состава полифенолов у растений малоизученного вида D. charkeviczii, взятых из природной популяции in situ и полученных в культуре in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования были проведены в Федеральном научном центре биоразнообразия наземной биоты Восточной Азии Дальневосточного отделения Российской академии наук (ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН) в секторе микроклонального размножения лесных, сельскохозяйственных и декоративных растений (г. Владивосток) в 2018 г.

Объект исследования – змееголовник Харкевича (Dracocephalum charkeviczii Prob., сем. Lamiaceae) – многолетний летнезеленый травянистый короткокорневищный симподиально нарастающий поликарпик с удлиненным приподнимающимся монокарпическим побегом [14]. Растения D. charkeviczii произрастали в природной популяции на пологих участках приморских щебнисто-каменистых обрывов, покрытых растительностью, характерной для приморских лугов, на полуострове Житкова (о. Русский). Для исследования полифенолов использовали растения из природной популяции и микрорастения, полученные в культуре in vitro.

Введение в культуру in vitro. Для введения в культуру in vitro в апреле 2018 г. были взяты экспланты с растений D. charkeviczii. В качестве эксплантов использовали листовой узел с пазушной почкой. Для стерилизации эксплантов использовали методику Р.Г. Бутенко [c. 27, 13], основанную на применении 0.1% раствора диацида (время обработки 4 мин). Для получения стерильных побегов из пазушных почек применяли агаризованную (0.4%) питательную среду с минеральной основой по Мурасиге и Скугу (MС-среда) [15], взятую в половинной концентрации, с добавлением витаминов по Р.Г. Бутенко [с. 203, 13] и 2% сахарозы. Питательную среду автоклавировали при 0.8 атм в течение 20 мин. Пробирки с эксплантами содержали в культуральной комнате при температуре 24 ± 1°С, 16-часовом фотопериоде, освещении люминесцентными лампами с интенсивностью 4000 лк и 70% относительной влажности воздуха.

Микроклональное размножение. Для дальнейшего клонального размножения микропобегов D. charkeviczii использовали вышеприведенную питательную среду с добавлением 1.0 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК), pH 4.6. Культивирование микропобегов проводили в условиях культуральной комнаты.

Исследование состава полифенолов. Для исследования профиля полифенолов использовали корни и листья микрорастений и растений D. charkeviczii из природной популяции. Сухой измельченный материал массой 100 мг (точная навеска) экстрагировали в 2 мл 80% метилового спирта в течение 30 мин на ультразвуковой бане и выдерживали при комнатной температуре в темноте 20 ч. Затем экстракты центрифугировали (15 000 g, 10 мин) и полученный супернатант фильтровали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм (Millipore, Bedford, MA, США). Аликвоту (1.0 мкл) полученного раствора использовали для аналитической хроматографии.

Экстракты анализировали с помощью оборудования Центра коллективного пользования “Биотехнология и генетическая инженерия” ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН: хроматографа 1260 Infinity (Agilent, США) и тандемного масс-спектрометра Bruker HCT ultra PTM Discovery System (Bruker Daltonik, GmbH, Германия), оснащенного ионной ловушкой. Разделение компонентов экстрактов проводили на аналитической колонке Zorbax C18 (150 × 2.1 мм, 3.5 мкм, Agilent, США) при 40^оС. УФ-спектры записывали в диапазоне длин волн от 200 до 400 нм с использованием детектора на диодной матрице G1315D (Agilent, США). Подвижная фаза состояла из раствора муравьиной кислоты (0.1%) в деионизированной воде и ацетонитрила. Градиентное элюирование проводили со скоростью потока растворителей 0.2 мл/мин. УФ-сигнал для количественного определения записывали при λ = 265 и 330 нм. Масс-спектрометрический (МС) сигнал записывали в режиме ионизации электрораспылением и регистрации отрицательных и положительных ионов в диапазоне значений m/z (отношение массы к заряду) 100–1000. Тандемную масс-спектрометрию проводили в автоматическом режиме при напряжении фрагментации 1.0 В.

Аналитическую ВЭЖХ с масс-спектрометрией высокого разрешения (ВЭЖХ-МСВР) для подтверждения идентификации биологически активных веществ проводили в лаборатории сравнительной биохимии “Национального научного центра морской биологии им. А.В. Жирмунского” ДВО РАН с использованием хроматомасс-спектрометра Shimadzu LCMS-IT-TOF (Kyoto, Япония), оснащенным жидкостным хроматографом высокого давления LC-20A Prominence и времяпролетным масс-спектрометром с ионной ловушкой. Условия хроматографического разделения оставили без изменений. МС данные получали в режиме ионизации электрораспылением и регистрации отрицательных ионов с разрешением 12000.

Идентификацию компонентов проводили путем сравнения времени удерживания, УФ и МС данных, а также имеющихся в наличии стандартных образцов и/или литературных данных [7, 16–21].

Количественное определение идентифицированных компонентов экстрактов D. charkeviczii проводили методом абсолютной градуировки с использованием коммерчески доступных стандартных образцов кемпферола (Sigma, Германия) и кофейной кислоты (Sigma, США). Для идентификации использовали хлорогеновую кислоту (Sigma, США) и выделенные и описанные ранее розмариновую кислоту и рабдозиин [22].

Калибровочные кривые построены с использованием кофейной кислоты (для определения содержания кофейной кислоты и ее производных) и кемпферола (для определения содержания производных акацетина) в диапазоне концентраций 0.007–5.5 мкмоль/мл, с коэффициентом корреляции R² не менее 0.999. Содержание каждого индивидуального компонента представляет собой среднее значение из трех параллельно проведенных анализов и выражено в мкмоль/г сухого веса, а также пересчитано с поправкой на молярную массу искомого компонента и выражено в %/г сухого веса.

Полученные данные обрабатывали с использованием пакета “Statistica” версии 10.0. Для выявления отличий между группами микрорастений, выращенных на разных вариантах сред, использовали сравнение с контрольными растениями с учетом t-критерия Стьюдента для 95% уровня значимости. В эксперименте при проверке статистических гипотез критический уровень значимости принимали равным 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Методом ВЭЖХ-УФ-МС/МС исследованы метанольные экстракты D. charkeviczii и определены 15 биологически активных компонентов полифенольной природы (рис. 1). Использование МСВР позволило установить точные массы исследуемых компонентов и определить их элементный состав. В табл. 1 суммированы данные УФ и хроматомасс-спектрометрического обнаружения основных полифенолов D. charkeviczii, среди которых 12 компонентов – это кофейная кислота и ее производные, а также 3 гликозилированных флавона – производные акацетина (дигидрокси-метокси-флавон). Компоненты, соответствующие пикам 2, 4, 9 и 11 (рис. 1), были определены как хлорогеновая (2), кофейная (4), розмариновая (11) кислоты и тетрамер кофейной кислоты рабдозиин (9), благодаря их абсолютному сходству (времени удерживания, УФ и масс-спектры, профиль MС/МС фрагментации) с имеющимися в наличии стандартными образцами (рис. 1). Необходимо отметить, что кофейная и розмариновая кислоты были ранее обнаружены у представителей рода Dracocephalum [3, 6, 8, 16, 17, 21]. Исходя из сходного спектрального поведения компоненты 1 и 3 определены как изомеры хлорогеновой кислоты. Сравнение с литературными данными [18] профилей фрагментации их депротонированных ионов и порядка элюирования на обращенной фазе позволило идентифицировать компоненты 1 и 3 как 3-кофеоилхинная и 4-кофеоилхинная кислоты, соответственно. Вещества, соответствующие пикам 5, 6 и 8, продемонстрировали УФ профили, сходные со спектром рабдозиина. Рассчитанные при помощи МСВР брутто-формулы соединений 6 и 8 (C₄₂H₄₀O₂₁) отличались от формулы рабдозиина (C₃₆H₃₀O₁₆) на один фрагмент гексозы (С₆H₁₀O₅), а формула компонента 5 (C₄₈H₅₀O₂₆) – на два таких фрагмента. Согласно характеру MС/МС фрагментации [M–H]^– ионов и порядку элюирования компоненты 6 и 8 были определены как два изомера гексозида рабдозиина, а компонент 5 как дигексозид рабдозиина. Компонент 7 в МСВР-спектре продемонстрировал интенсивный сигнал с m/z 521.1290, что соответствует молекулярной формуле C₂₄H₂₆O₁₃ и отличается от розмариновой кислоты ([M–H]^– с m/z 359.0779, C₁₈H₁₆O₈) на один фрагмент гексозы. Фрагментация ионов с m/z 521 показала наличие дочерних ионов с m/z 359, что соответствует потере остатка гексозы (–162), а также наличие нескольких дочерних ионов меньшей интенсивности (с m/z 223, 197, 179, 161), что соответствует профилю фрагментации розмариновой кислоты. Так компонент 7 был идентифицирован как гексозид розмариновой кислоты, что подтверждается ранее опубликованными литературными данными [7, 20]. МСВР-спектр соединения 14 показал наличие сигнала с m/z 717.1452 (C₃₆H₃₀O₁₆), что позволило определить его как изомер рабдозиина, идентифицированный ранее как сальвианоловая кислота В [16, 17]. Для компонента 15 ([M–H]^– с m/z 715.1296, C₃₆H₂₈O₁₆), рассчитанная при помощи МСВР формальная непредельность оказалась на единицу больше, чем у рабдозиина ([M–H]^– с m/z 717.1453, C₃₆H₃₀O₁₆), что позволило предположить наличие в его структуре еще одной двойной связи. Соединение 15 было предположительно идентифицировано как дегидрорабдозиин (или изомер), описанный ранее в литературе [7].

Рис. 1.

Хроматографические профили ВЭЖХ-УФ анализа метанольных экстрактов из корней (а, б) и листьев (в, г) растений D. charkeviczii из природной популяции и микрорастений, соответственно, зарегистрированные при λ = 330 нм. Нумерация пиков соответствует табл. 1. 1 – 3-кофеоилхинная кислота, 2 – хлорогеновая кислота, 3 – 4-кофеоилхинная кислота, 4 – кофейная кислота, 5 – дигексозид рабдозиина, 6 – моногексозид рабдозиина, 7 − гексозид розмариновой кислоты, 8 – моногексозид рабдозиина изомер, 9 – рабдозиин, 10 – акацетин рамнозил-тригексозид, 11 – розмариновая кислота, 12 и 13 – изомеры акацетина рамнозил-тригексозида ацетилированного, 14 – сальвианоловая кислота В, 15 – дегидрорабдозиин.

Соединения, соответствующие пикам 10, 12 и 13, были отнесены к флавоноидам, согласно типичному для них УФ профилю. МС данные для этих пиков, записанные в режиме регистрации отрицательных ионов, оказались недостаточными для проведения идентификации. Поэтому было решено провести тандемную масс-спектрометрию для положительных ионов. Исследуемые компоненты в МС/МС спектрах ионов-прекурсоров [M + H]⁺ обнаружили присутствие интенсивных сигналов фрагментов с m/z 285, что позволило допустить, что соединения 10, 12 и 13 являются производными акацетина, о наличии которых в различных видах Dracocephalum сообщалось ранее [19, 21]. Пик 10 ([M–H]^– с m/z 915.2774, C₁₈H₁₆O₈) продемонстрировал содержательную фрагментацию протонированных ионов ([M + H]⁺ с m/z 917) с образованием продуктов с m/z 771, 609, 447 и 285, что определяется последовательным элиминированием остатков дезоксигексозы (–146) и трех гексоз (–162), соответственно. Соединение 10 было идентифицировано как акацетин рамнозил-тригексозид, как было определено ранее [21]. Компоненты 12 и 13 показали сходные МС характеристики в положительном и отрицательном режимах и были определены как два изомера ацетилированного акацетин рамнозил-тригексозида, как было описано ранее [21].

Наши данные выявили неравномерный характер распределения биологически активных соединений в листьях и корнях растений D. сharkeviczii (рис. 2). В корнях природных растений в небольшом количестве содержалась кофейная кислота. Это соединение является предшественником большого количества полифенолов и встречается практически во всех видах растений. Розмариновая кислота, являющаяся эфиром кофейной кислоты и 3,4-дигидроксифенил-молочной кислоты, и ее производные – тетрамеры кофейной кислоты: сальвианоловая кислота В и рабдозиин, также присутствовали, но в большем количестве (рис. 1 и 2). При этом в корнях преобладали гликозилированные формы рабдозиина (суммарно для гликозидов 18.3 мкмоль/г сухого веса (1.7% сухого веса)), тогда как в листьях эфиры хинной и кофейной кислот – хлорогеновая кислота, 3-кофеилхинная и 4-кофеилхинная кислоты, которые, как известно, участвуют в процессах дыхания растений [с. 265, 23]. Кроме того, в больших количествах в листьях присутствовал акацетин в гликозилированной форме (для ацетилированного производного до 59 мкмоль/г сухого веса, 5.6%/г сухого веса, соответственно). Другое уникальное вещество – дегидрорабдозиин было идентифицировано только в листьях растений из природной популяции.

Рис. 2.

Диаграмма распределения полифенольных соединений в органах растений D. charkeviczii in vitro () и in situ ().

Анализ состава метаболических профилей экстрактов показал, что в целом в микрорастениях in vitro идентифицированы те же вещества, что и в растениях из природной популяции (рис. 1). Профиль распределения веществ в органах микрорастений значительно не менялся по сравнению с органами дикорастущих растений (рис. 2). Однако в микрорастениях преобладали вещества в виде свободных агликонов, тогда как в растениях из природной популяции эти вещества находились в гликозилированной форме (рис. 2). Например, в листьях микрорастений содержание розмариновой кислоты составляло 63 мкмоль/г сухого веса (2.3% сухого веса), что в 5 раз превышало ее содержание в листьях природных растений. Аналогичный эффект наблюдался и в корнях для рабдозиина (в микрорастениях 8 мкмоль/г сухого веса (0.6% сухого веса), в природных растениях около 1.5 мкмоль/г сухого веса (0.1% сухого веса)). Можно предположить, что микрорастения in vitro более свободно осуществляют водно-солевой обмен между корневой системой и МС-средой. Это способствовало выходу веществ в среду культивирования и, вероятно, снижению цитотоксичности внутри микрорастений. Следует отметить, что в листьях микрорастений содержание хлорогеновой кислоты и ее изомеров было ниже в сравнении с природными растениями (рис. 2).

Содержание розмариновой кислоты в листьях микрорастений D. charkeviczii было выше (63.3 мкмоль/г или 22.8 мг/г сухого веса) (рис. 2), чем в культуре корней (19.97 мг/г сухого веса) и корнях однолетних растений D. forrestii (4.7 мг/г сухого веса), выращиваемых в поле [16]. Однако ее содержание было ниже, чем у клеточных культур, выращиваемых на средах с гормонами и различными элиситорами [24]. Особый интерес представляет исследование, в котором показано, что волосатые корни D. moldavica продуцировали розмариновую кислоту в концентрации до 78 мг/г сухого веса после оптимизации состава культуральной среды [6]. В работе Фатахи с соавт. [8] приводятся сведения о том, что содержание розмариновой кислоты в культуре корней D. kotsychyi, полученных после заражения штаммом Agrobacterium rhizogenes LBA 9402, варьировало от 10 до 1500 мкг/г сухого веса, что в 15 раз выше, чем в интактных корнях. При исследовании листьев 96 видов сем. Lamiaceae было обнаружено, что концентрация розмариновой кислоты варьировала от 0.01 до 9.30 мг/г сухого веса, а содержание кофейной кислоты от 0 до 0.62 мг/г сухого веса [25].

Спектр вторичных метаболитов является отражением физиологического и биохимического состояния организма, и процессы синтеза веществ могут быть связаны с онтогенетическим развитием растения. Недавние исследования показали, что фенологические стадии являются одними из наиболее влиятельных факторов в вариациях вторичных метаболитов [26]. В нашем случае, исследуемые микрорастения находились в виргинильном онтогенетическом состоянии, тогда как растения из природной популяции – в среднем генеративном. Кроме того, для получения гликозилированных форм веществ необходима стадия биосинтеза, отвечающая за реакцию присоединения сахаров к агликонам и работа дополнительных ферментных систем, обеспечивающих переход веществ в активную или неактивную форму [27]. Возможно, микрорастения не успевали преобразовать вещества в гликозилированные формы из-за недостатка времени, необходимого для достижения генеративного состояния. Этим может объясняться и обнаружение в них достаточно большого количества кофейной кислоты, важной в дальнейших стадиях синтеза изомеров и эфиров.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Профили биологически активных веществ в микрорастениях D. charkeviczii сравнимы с таковыми в дикорастущих растениях, что открывает возможность их дальнейшего изучения с перспективой использования. Показано неравномерное распределение веществ в исследованных группах растений с преобладанием кофейной кислоты и рабдозиина в корнях, розмариновой кислоты и производных акацетина в листьях. В дикорастущих растениях преобладали гликозилированные формы веществ в отличие от микрорастений. Вероятно, это определено физиологическими процессами, связанными с фенологическими фазами развития микрорастений.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов.