Физиология растений, 2022, T. 69, № 2, стр. 149-160

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время, несмотря на достижения в синтетической химии, по-прежнему для создания многих фармацевтических препаратов и биологически активных добавок используются растения. Как минимум 25% всех лекарств в промышленно развитых странах содержат растительные химические соединения, тогда как в развивающихся странах около 75% населения полагается исключительно на средства растительного происхождения [1]. В связи с тем, что популяции лекарственных дикорастущих растений крайне часто сокращаются из-за нерегулируемых заготовок сырья и многие виды относятся к редким и исчезающим, идет поиск альтернативных источников растительных биологически активных соединений. Перспективным способом получения растительного сырья с целевыми веществами можно считать культуры клеток, органов и тканей высших растений [2].

Digitalis lanata Ehrh., широко известная как наперстянка шерстистая, принадлежит к семейству Plantaginaceae и встречается в диком виде в Италии, Венгрии и на Балканах. Род Digitalis хорошо известен в медицине, начиная с XVIII века, благодаря наличию в этих растениях сердечных гликозидов (карденолидов), которые применяли для лечения сердечно-сосудистых заболеваний [1, 3]. Дигоксин (наиболее используемый в медицине сердечный гликозид) получают из высушеных листьев D. lanata, поскольку его химический синтез экономически невыгоден. На данный момент карденолиды наперстянки не играют большой роли в терапии сердечно-сосудистых патологий, но их активно рассматривают как перспективные агенты при лечении ряда онкологических заболеваний и вирусных инфекций [1, 4].

Изучение культуры клеток Digitalis spp. как источника сердечных гликозидов началось более 50 лет назад. Во множестве экспериментальных работ было отмечено, что даже если на начальных этапах культивирования карденолиды присутствуют в небольших концентрациях в каллусных и суспензионных культурах, то в процессе длительного выращивания их синтез полностью исчезает [3, 5, 6]. В свою очередь для культур листьев и корней in vitro D. lanata отмечена продукция сердечных гликозидов, что указывает на связь биосинтеза этих соединений с процессами морфологической дифференцировки [5, 7, 8]. Кроме того, имеются сведения о том, что эмбриогенные культуры также могут накапливать значительное количество этих соединений [9]. Из анализа доступных источников следует, что дедифференцированные клетки in vitro наперстянки не способны к синтезу карденолидов, несмотря на то, что необходимые ферментативные системы в них функционируют, что подтверждается их способностью к биотрансформации целевых соединений при внесении в среды различных субстратов [5, 10].

Практически во всех работах по изучению вторичного метаболизма в культурах клеток D. lanata основное внимание уделено присутствию в них только сердечных гликозидов [3, 5]. В то же время известно, что интактные растения этого вида содержат широкий набор вторичных метаболитов разных групп – стероидные гликозиды, дигитанолы, фенилэтаноиды, антрахиноны, флавоноиды, многие из которых обладают биологической активностью [4].

Целью настоящей работы стало получение культур in vitro Digitalis lanata с разной степенью дифференцирования (ризогенной, каллусной и суспензионной) и исследование особенностей их роста и синтеза вторичных метаболитов различных структурных групп.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для получения культур in vitro D. lanata использовали асептические проростки, выращенные из семян D. lanata, взятых от растений из Ботанического сада биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Семена стерилизовали смесью детергента Tween-20 (Sigma, Германия) и 50% раствора гипохлорита натрия (“Белизна”, Россия), промывали стерильной дистиллированной водой и высевали на чашки Петри с агаризованной средой Мурасиге и Скуга (MS) [11] без добавления регуляторов роста. Чашки Петри помещали на стеллажи под люминесцентные лампы дневного света и проращивали при 25 ± 1°С и 16-часовом световом дне.

Ризогенез индуцировали на агаризованной среде MS с регуляторами роста – α-нафтилуксусная кислота (α-НУК) и кинетин (Merck, Германия) (диапазон концентраций от 1.0 до 2.0 мг/л), используя в качестве эксплантов семядольные листья или гипокотили асептических проростков.

Каллусную культуру получали на ризогенной культуре с применением регуляторов роста – α-НУК, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), кинетин, 6-бензиламинопурин (БАП) (Merck, Германия) (диапазон концентраций от 0.1 до 2.5 мг/л).

Выращивание каллусной и ризогенной культур осуществляли на чашках Петри с диаметром – 60 или 90 мм, в темноте при 25 ± 1°С.

Для получения суспензионной культуры клеток в качестве эксплантов использовали каллусную культуру. Каллусы помещали в 250 мл колбы с 33–40 мл жидкой среды, которые размещали на ротационном шейкере (100 об./мин) и культивировали в темноте при 25 ± 1°С.

Для выращивания полученных культур in vitro использовали среду MS с добавлением гидролизата казеина (0.5 г/л), инозитола (0.1 г/л), 3% сахарозы и регуляторов роста (α-НУК, 2,4-Д, кинетин, БАП). При выращивании каллусной и суспензионной культур клеток гидролизат казеина не применяли.

Микрофотографии суспензионной культуры клеток сделаны с помощью цифровой камеры ToupCam SCMOS 0.3 Мпикс (Китай).

Для характеристики роста и физиологического состояния культур D. lanata использовали уровень накопления сырой и сухой биомассы, концентрацию (количество клеток в 1 мл суспензии) и жизнеспособность клеток.

Жизнеспособность суспензионной культуры определяли, используя прижизненный краситель феносафранин (0.1% раствор) (Merck, Германия), путем подсчета живых (неокрашенных) и мертвых (окрашенных) культивируемых единиц под микроскопом [12].

Для определения концентрации клеток (числа клеток в 1 мл суспензии) в суспензионной культуре использовали подсчет клеток в гемоцитометре Фукса-Розенталя после мацерации суспензии в 20% растворе хромовой кислоты при 60°C в течение 20–30 мин [12].

Для определения сырой и сухой биомассы каллусной и ризогенной культур использовали каллус или корни, отделенные от питательной среды. Для построения кривой роста использовали вес одного каллуса или участка корневой культуры при массе транспланта 150 мг ± 30% сырой биомассы. Для каждой точки использовали минимум три каллуса или участка корневой культуры.

Для суспензионной культуры клеток фиксированный объем суспензии (не менее 10 мл в двух биологических повторностях) фильтровали под вакуумом через бумажный фильтр с помощью воронки Бюхнера [12].

Биомассу всех полученных культур in vitro высушивали в сушильном шкафу при 50°C в течение 24 часов.

На основании полученных результатов вычисляли параметры роста суспензионной культуры, такие как индекс роста (I), удельная скорость роста (μ), время удвоения биомассы (τ), экономический коэффициент (Y), продуктивность по биомассе (P). Для расчетов использовали следующие формулы [12]:

I = X_max/X₀, где X_max и X₀ – максимальное и начальное значения критерия роста соответственно (сухая масса клеток, сырая масса клеток, концентрация клеток).

µ = (lnХ₂ – lnХ₁)/(t₂ – t₁), где Х₂ и Х₁ – значения критерия роста (сухая масса клеток, сырая масса клеток, концентрация клеток) в момент времени t₂ и t₁ соответственно (рассчитывали для экспоненциальной фазы роста).

τ = ln 2/µ

Y = (Х_max – Х_o)/S_o, где Х_max и Х_o – максимальная и начальная концентрации сухой биомассы (г/л), соответственно; S_o – начальная концентрация субстрата (сахарозы) в среде (г/л среды).

P = (Х_i – Х_o)/(t_i – t_o), где Х_o и Х_i – количество сухой биомассы в начале культивирования и в момент времени t_i соответственно.

Для качественного и количественного анализа состава вторичных метаболитов в исследуемых культурах использовали ультраэффективную жидкостную хроматографию с масс-спектрометрическим детектированием при ионизации электрораспылением (UPLC-ESI-MS) и высокоэффективную жидкостную хроматографию с масс-спектрометрией при ионизации электрораспылением (HPLC-ESI-MS) соответственно.

Для приготовления проб 100–300 мг высушенного растительного материала (биомасса клеток или корней) экстрагировали 3 раза 70% (по объему) этиловым спиртом в течение 30 минут под действием ультразвука (УЗ-ванна “Сапфир”, Россия) при комнатной температуре, после чего центрифугировали (центрифуга “MiniSpin plus”, Eppendorf, Германия) при 9660 g в течение 5 минут и отбирали супернатант в грушевидную колбу. Объединенные спиртовые экстракты упаривали под вакуумом при 40°С, суспендировали в 3 мл 5% (по объему) раствора уксусной кислоты и наносили на патрон для твердофазной экстракции Supelclean ENVI-18 (“Supelco”, США). Патрон промывали 3 мл 5% раствора уксусной кислоты, аналиты смывали в грушевидную колбу 3 мл 70% этанола. Полученный экстракт упаривали досуха под вакуумом при 40°С и использовали для химического анализа.

Для проведения UPLC-ESI-MS пробы растворяли в смеси ацетонитрил : вода (1 : 1, по объему) и фильтровали с помощью нейлонового фильтра с порами 0.2 мкм (Acrodisc, PallCorporation, США). UPLC-ESI-MS-анализ выполняли на хроматографе Waters Acquity UPLC (Waters, США), оснащенном гибридным квадрупольным времяпролетным масс-спектрометром XEVOQTOF (Waters, США). Пробу в объеме 1 мкл наносили на колонку ACQUITY UPLC BEH Phenyl (50 × 2.1 мм, 1.7 мкм; Waters, США). Температура колонки составляла 40°С, объемная скорость потока подвижной фазы – 0.4 мл/мин. В качестве подвижной фазы использовали 0.1% (по объему) раствор муравьиной кислоты в воде (растворитель А) и 0.1% (по объему) раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле (растворитель Б). Хроматографическое разделение проводили в режиме градиентного элюирования. В процессе анализа состав подвижной фазы менялся следующим образом (Б, % по объему): 0–1 мин – 15%, 1–5 мин – 15 → 30%, 5–15 мин – 30 → 38%, 15–15.5 мин – 38 → 45%, 15.5–23 мин – 45%, 23–23.5 мин – 45 → 95%. Анализ осуществляли в режиме детектирования положительных и отрицательных ионов (диапазон m/z 100–1200). Параметры источника ионизации: температура источника ионизации – 120°С, температура десольвации – 250°С, напряжение на капилляре – 3.0 кВ, напряжение на конусе ввода пробы – 30 В, скорость подачи азота (десольвационный газ) – 600 л/час. Обработку полученных результатов производили с помощью программы MassLynx (Waters, США). Идентификацию соединений осуществляли на основании расшифровки масс-спектров и сопоставления хроматографического и масс-спектрометрического поведения обнаруженных соединений с данными литературы [1, 13–18].

Перед HPLC-ESI-MS анализом все пробы растворяли в смеси ацетонитрил : вода (1 : 1, по объему) и фильтровали в стеклянные виалы с помощью тефлоновых фильтров с порами 0.45 мкм CAMEO 17F (GVSS.p.A., Италия). Анализ осуществляли на приборе Agilent 1260 Infinity (“Agilent Technologies”, США), оснащенном масс-селективным детектором (6100, “Agilent Technologies”, США). Колонка: Poroshell 120 EC-C18 (100 мм × 3 мм, 2.7 мкм, “Agilent”, США). Температура колонки – 43°C, скорость потока подвижной фазы – 0.4 мл/мин. Объем инжекции – 0.5 мкл. В качестве подвижной фазы использовали 0.05% (по объему) раствор муравьиной кислоты (Fluka, США) в воде (растворитель А) и ацетонитрил (растворитель Б). В процессе анализа состав подвижной фазы менялся следующим образом (Б, % по объему): 0–7.5 мин – 5 → 13%, 7.5–9 мин – 13 → 21%, 9–19 мин – 21 → 31%, 19–19.5 мин – 31 → 95%, 19.5–21.5 мин – 95%. Анализ осуществляли при детектировании отрицательных ионов (диапазон m/z 100–1300, фрагментор – 90) в режиме записи сигналов для определенных ионов (режим SIM – “selected-ion monitoring”). Параметры источника ионизации: температура квадруполя – 100°С, температура газа-носителя (азот) – 150°С, скорость подачи азота (распыляющий газ) – 12.5 л/мин, давление азота – 2484 торр, напряжение на капилляре – 4 кВ.

Количественное определение содержания индивидуальных гликозидов фенилэтаноидов проводили на основе HPLC-ESI-MS анализа методом внешней калибровки против стандартного образца эхинакозида (Sigma, США).

Для определения чувствительности метода HPLC-ESI-MS при скрининге сердечных гликозидов в пробах использовали стандартные образцы ланатозида C (Sigma, США), конваллятоксина, дигитоксина и дигоксина (ChromaDex, США). Минимальная определяемая концентрация для растворов стандартных образцов сердечных гликозидов находилась в пределах 0.4–0.8 мкг/мл.

Определение сырой и сухой биомассы и жизнеспособности клеток проводили в 2–3 биологических повторностях. Подсчет числа клеток производили в 2–3 биологических и 2 аналитических повторностях. Качественное и количественное определение вторичных метаболитов осуществляли в индивидуальном экстракте без учета биологических и аналитических повторностей. При количественном определении содержания индивидуальных гликозидов фенилэтаноидов методом HPLC-ESI-MS относительное стандартное отклонение для времен удерживания соединений не превышало 5%, для площадей пика эхинакозида – 10%. Анализ данных проводили с помощью программы Excel, входящей в состав офисного пакета приложений Microsoft Office 2010. На графиках представлены средние значения и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Первым этапом работ явилось получение ризогенной культуры D. lanata. В качестве эксплантов использовали семядольные листья и гипокотили асептических проростков, полученных из стерильных семян. От проростков отделяли семядольные листья или гипокотили и помещали их на чашки Петри с агаризованной средой MS, дополненной 2 мг/л α-НУК и 2 мг/л кинетина. Формирование ризогенной культуры обычно наблюдали через 10–14 дней. У D. lanata в присутствии 2 мг/л α-НУК и 2 мг/л кинетина формировалась устойчивая и хорошо растущая ризогенная ткань (рис. 1). Стоит отметить, что интенсивный ризогенез был характерен преимущественно для листовых эксплантов, тогда как для гипокотильных наблюдался некроз образующейся культуры.

Рис. 1.

Ризогенная (а), каллусная (б) и суспензионная (в) культуры D. lanata.

Каллусные культуры клеток инициировали из полученной ризогенной культуры D. lanata. Для индукции каллусогенеза использовали среды MS с различными комбинациями регуляторов роста: 1 мг/л α-НУК – 2.5 мг/л БАП, 1 мг/л 2,4-Д – 0.1 мг/л кинетина, 2 мг/л 2,4-Д – 1 мг/л кинетина, 1 мг/л 2,4-Д – 0.5 мг/л БАП. Оптимальной для формирования каллусной культуры клеток оказалась среда MS c 1 мг/л 2,4-Д и 0.5 мг/л БАП. Полученная каллусная культура имела коричневый цвет и рыхлую структуру (рис. 1). На других комбинациях регуляторов роста индуцировать каллусогенез не удалось, в большинстве случаев наблюдали некроз культуры корней.

Суспензионная культура клеток D. lanata была получена из каллусной культуры, возраст которой был более 1 года (11 циклов культивирования). Каллусные клетки (2–4 г сырой биомассы) помещали в колбы с жидкой питательной средой MS, дополненной 1 мг/л 2,4-Д и 0.5 мг/л БАП. Колбы помещали на ротационный шейкер и через 18–22 суток выращивания была получена первичная суспензионная культура клеток. В результате работ по оптимизации режима выращивания полученной суспензии было установлено, что оптимальным является цикл культивирования – 21 сутки и соотношение инокулюм:свежая среда при пересадке – 1 : 8. Полученная суспензия имела желто-коричневый цвет, и содержала крупные агрегаты из меристемоподобных и паренхимоподобных клеток, а также множество одиночных меристемоподобных, паренхимоподобных и удлиненных аномальных клеток. Большинство одиночных клеток в суспензии были нежизнеспособными (рис. 1).

После 1.5–2.5 лет культивирования (15–25 циклов выращивания) полученных каллусной и ризогенной культур было проведено исследование их ростовых характеристик. Установлено, что к 42–43 суткам культивирования кривые роста каллусной и ризогенной культур D. lanata еще не достигали стационарной фазы. При этом для культуры корней была характерна лаг-фаза в течение 7 суток, для каллусной культуры клеток отмечено замедление роста после 29 суток выращивания. В случае с ризогенной культурой D. lanata на 42 сутки культивирования отмечен прирост в 9 раз по сырой биомассе и в 8 раз – по сухой биомассе. Для каллусной культуры клеток на 43 сутки выращивания наблюдали прирост в 5 раз как для сухой, так и сырой биомассы (рис. 2).

Рис. 2.

Кривые роста в стандартной и полулогарифмической системе координат ризогенной (а, б) и каллусной (в, г) культур D. lanata: 1 – сырая биомасса; 2 – сухая биомасса. Числовые данные указаны в расчете на один каллус или участок ризогенной ткани.

Ростовые характеристики суспензионной культуры D. lanata были определены после 7 циклов выращивания (5 месяцев культивирования после получения) (рис. 3). При анализе ростовых кривых было отмечено отсутствие лаг-фазы для показателя концентрации клеток и ее наличие в течение 6–8 суток для накопления сырой и сухой биомассы. Стоит также отметить, что в цикле культивирования наблюдали период задержки роста в течение экспоненциальной фазы длительностью 4 суток, что разбивает цикл выращивания на 2 фазы. После 21 суток культивирования наступает замедление роста и переход культуры в стационарную фазу роста, которая длится около 4 суток. Кроме того, для суспензии D. lanata был зафиксирован относительно невысокий показатель жизнеспособности клеток – в течение всего цикла выращивания он находился на уровне 60–70% и приближался к 50% на 28 сутки. Подобная динамика может быть связана с большим количеством одиночных мертвых клеток и нахождением основной массы живых клеток преимущественно в составе крупных агрегатов.

Рис. 3.

Кривые роста в стандартной (а) и полулогарифмической (б) системе координат и жизнеспособность клеток суспензионной культуры D. lanata: 1 – концентрация клеток; 2 – сырая биомасса; 3 – сухая биомасса; 4 – жизнеспособность клеток.

В таблице 1 представлены производные параметры роста суспензионной культуры – индекс роста (I), удельная скорость роста (μ), время удвоения биомассы (τ), максимальное накопление сухой биомассы (M_max), экономический коэффициент (Y) и максимальная продуктивность (P).

Из представленных ростовых параметров следует (табл. 1), что суспензионная культура D. lanata при сравнительно невысокой жизнеспособности клеток являлась хорошо растущей культурой. Индексы роста по концентрации клеток, сырой и сухой биомассе составляли 12–13, удельная скорость роста была в пределах 0.2–0.3 сут^–1, максимальное накопление сухой биомассы – 9.4 г/л. Кроме того, отмечен достаточно хороший экономический коэффициент при выращивании культуры, который равен 0.29, из чего следует, что почти 30% сахарозы питательной среды расходуется на построение биомассы клеток.

Для исследования качественного состава вторичных метаболитов в ризогенной культуре D. lanata использовали метод UPLC-ESI-MS. Хроматограмма спиртового экстракта из биомассы культуры корней, записанная в режиме полного ионного тока (при регистрации положительно заряженных ионов), и масс-спектры (положительные ионы) некоторых пиков идентифицированных соединений представлены на рис. 4.

Рис. 4.

UPLC-ESI-MS-хроматограмма (а, записана в режиме полного ионного тока при регистрации положительных ионов) спиртового экстракта из биомассы ризогенной культуры D. lanata и масс-спектры (положительные ионы) пиков со временем удерживания 2.03 (б, предположительная идентификация – фенилэтаноид деметил-пурпуреазид E), 3.12 (в, предположительная идентификация – фуростаноловый гликозид с агликоном гитогенин), 4.01 (г, предположительная идентификация – фуростаноловый гликозид с агликоном тигогенин): 1–10 – пики идентифицированных соединений (табл. 2).

В ризогенной культуре было обнаружено как минимум 10 пиков соединений со временем удерживания на колонке в пределах 1–5 мин. Фитохимический анализ показал отсутствие в экстракте из биомассы ризогенной ткани сердечных гликозидов – основных вторичных метаболитов наперстянок, но там были найдены фенилэтаноиды и стероидные гликозиды фуростанолового ряда, структуры которых представлены на рис. 5 и в таблице 2.

Рис. 5.

Химические структуры фенилэтаноидных (а) и фуростаноловых (б) гликозидов [4, 19]: R¹, R^1', R², R³, R⁴, R⁵ – расшифровка радикалов, представлена в табл. 2.

Результаты масс-спектрометрии свидетельствуют о том, что обнаруженные гликозиды фенилэтаноидов соответствуют дигицилизиду А, максозиду и деметил-пурпуреазиду E, фуростаноловые гликозиды являются производными двух агликонов – гитогенина и тигогенина. В ризогенной культуре присутствует не менее 7 фуростаноловых гликозидов и 3 фенилэтаноида.

Полученные методом UPLC-ESI-MS данные были использованы для таргетированного (выполнен с помощью HPLC-ESI-MS) качественного и количественного анализа фенилэтаноидов, а также качественного анализа стероидных гликозидов в биомассе каллусной и суспензионной культур D. lanata. Для увеличения чувствительности HPLC-ESI-MS анализ проводили при детектировании отрицательно заряженных ионов [20] и регистрации определенных выбранных ионов (режим SIM – “selected-ion monitoring”) [21]. Обзорные HPLC-ESI-MS (режим SIM) хроматограммы спиртовых экстрактов из биомассы культур клеток представлены на рис. 6. Список ионов фенилэтаноидов (в предложенных условиях HPLC-ESI-MS детектировались как депротонированные ионы [M-H]^–) и стероидных гликозидов (декорировались как ионы-аддукты с компонентом подвижной фазы – муравьиной кислотой, [M–H + HCOOH]^–) представлен в таблице 3.

Рис. 6.

HPLC-ESI-MS-хроматограммы (записаны при детектировании отрицательных ионов в режиме SIM; список ионов, для которых проводился анализ, и их идентификация представлен в табл. 3) спиртовых экстрактов из биомассы культур клеток D. lanata: (а) – каллусная культура клеток; (б) – суспензионная культура клеток; 1–14 – пики идентифицированных соединений (табл. 3).

В суспензионной культуре клеток D. lanata было обнаружено как минимум 10 фенилэтаноидов и 4 фуростаноловых гликозида, в каллусной культуре – 9 фенилэтаноидных и 4 фуростаноловых гликозида. HPLC-ESI-MS анализ показал увеличение спектра гликозидов фенилэтаноидов и уменьшение разнообразия стероидных гликозидов в дедифференцированных культурах клеток D. lanata. Стоит отметить, что в ризогенной культуре присутствовали фуростаноловые гликозиды, имеющие в качестве агликонов тигогенин и гитогенин, а в каллусной и суспензионной культурах обнаружены только производные тигогенина.

Количественный анализ методом HPLC-ESI-MS (режим SIM) гликозидов фенилэтаноидов в каллусной и суспензионной культурах клеток D. lanata показал, что в представленных образцах содержание этих соединений достигало 0.5% к сухой массе клеток (табл. 4).

Отмечено, что в культурах D. lanata, состоящих преимущественно из дедифференцированных клеток (каллусных и суспензионных) основными соединениями являются максозид и деметил-пурпуреазид E (в культуре корней эти соединения также обнаружены, но в незначительных количествах). В то же время пурпуреазид E, дигицилизид A, изомер дигицилизида A и диметил-дигицилизид B в каллусных и суспензионных культурах клеток присутствуют преимущественно в следовых количествах, тогда как в ризогенной культуре интенсивность хроматографического пика дигицилизида A (судя по UPLC-ESI-MS-анализу) была довольно высокая.

ОБСУЖДЕНИЕ

Digitalis lanata считается одним из наиболее изученных видов наперстянки в плане вторичного метаболизма, как в интактном растении, так и в культуре клеток, органов и тканей in vitro [5]. Большинство данных указывают на то, что в каллусных и суспензионных культурах клеток наперстянок сердечные гликозиды обычно либо отсутствуют, либо присутствуют в крайне низких концентрациях на начальных этапах получения и выращивания, но при длительном культивировании, как правило, исчезают полностью. Связь биосинтеза карденолидов Digitalis spp. с морфологической дифференцировкой подчеркнута результатами целого ряда исследований с различными видами культур in vitro [3, 5]. Известно, что культуры органов (листья и корни), а также каллусная ткань с эмбриогенными структурами D. lanata сохраняли способность образовывать сердечные гликозиды [5, 7–9, 22].

Результаты данной работы подтверждают отсутствие синтеза карденолидов в дедифференцированных культурах клеток D. lanata. Несмотря на имеющиеся данные о том, что в культурах побегов и корней in vitro наперстянок эти соединения встречаются [5, 7, 8], в пределах представленного исследования в ризогенной культуре D. lanata их обнаружить не удалось. Стоит сказать, что, судя по доступным литературным источникам, ризогенные культуры наперстянки не во всех случаях способны продуцировать сердечные гликозиды [5]. Известно, что в интактных растениях Digitalis spp. карденолиды образуются и накапливаются преимущественно в листьях, основная их масса сосредоточена в мезофилле, поэтому вероятно морфогенетические процессы, связанные с формированием побеговых и листовых культур являются наиболее предпочтительными для их синтеза [23].

Формирование фенилэтаноидов и стероидных гликозидов фуростанолового ряда в культурах in vitro D. lanata указывает на специфичность их вторичного метаболизма и изменение групп и спектра соединений в зависимости от степени дифференцирования клеток в культурах in vitro. В ризогенной культуре, состоящей преимущественно из дифференцированных клеток, преобладают фуростаноловые гликозиды, тогда как в каллусной и суспензионной культурах клеток, состоящих из дедифференцированых клеток, существенно расширяется разнообразие фенилэтаноидов. Стоит отметить, что в литературе имеются сведения о формировании в дедиференцированных растительных клетках D. lanata антрахинонов [24, 25], в свою очередь наличие фенилэтаноидов и стероидных гликозидов в клетках in vitro наперстянки было ранее отмечено для каллусных культур D. purpurea [5, 26].

Результаты исследования подтверждают выдвинутую в наших предыдущих работах гипотезу о специфичности вторичного метаболизма и его высокой интенсивности в культурах клеток высших растений. Однако, механизмы, которые лежат в основе закономерностей синтеза конкретных групп вторичных метаболитов в культурах клеток, органов и тканей in vitro растений рода Digitalis требуют дальнейшего изучения.

Работа выполнена на базе “Научно-производственного биотехнологического комплекса для проведения работ по изучению, сохранению и практическому применению культивируемых клеток и органов высших растений и микроводорослей” при финансовой поддержке Мегагранта Правительства Российской Федерации (Соглашение № 075-15-2019-1882).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.