Физиология растений, 2022, T. 69, № 4, стр. 373-385

ВВЕДЕНИЕ

Изучение влияния экстремальных температур на дыхание и другие ключевые физиологические процессы, протекающие в растениях, представляет интерес не только для фундаментальной науки, но и имеет очевидную практическую значимость. Известно, что именно эти стрессовые факторы, наряду с засухой и засолением, оказывают наиболее сильное негативное действие на величину урожая важнейших сельскохозяйственных культур. Изучение влияния температуры на дыхание растений имеет более чем столетнюю историю, начиная с опытов Ф. Фукомпре и И. П. Бородина [1, стр. 172], проведенных во второй половине XIX в. Следует также отметить, что в выяснение этого вопроса большой вклад внесли работы других отечественных ученых: А. Н. Волкова, В. Н. Палладина, О.А. Семихатовой, В.Н. Жолкевича, В.К. Войникова и др. Благодаря постоянному интересу исследователей к этой проблеме было установлено, что действие экстремальных температур на растения сопровождалось глубокими изменениями дыхательного метаболизма, центральным звеном которого является функционирование митохондрий. Показано, что экстремальные температуры в той или иной мере ингибируют дыхательный метаболизм митохондрий и/или понижают его энергетическую эффективность за счет разобщения процесса окислительного фосфорилирования, что немедленно отрицательно сказывается на скорости роста проростков [2, 3]. Для успешного выживания в этих условиях растения используют разнообразные защитные механизмы, модифицируя реакции метаболизма, в том числе дыхательного, что позволяет им приспособиться к неблагоприятным условиям среды обитания.

Известно, что действие различных абиотических стресс-факторов, включая экстремальные температуры, из которых лучше изучено действие гипотермии, вызывает достаточно однотипную ответную реакцию митохондрий растений, направленную на преодоление возникающего окислительного стресса: активацию АФК-гасящих ферментов, индукцию процессов свободного окисления (альтернативной CN-резистентной оксидазы (АО) и ротенон-нечувствительных НАД(Ф)·Н-дегидрогеназ) и разобщения в ЭТЦ (разобщающих белков) [4, 5]. Показано, что основная функция АО и других несопряженных альтернативных путей электронного транспорта заключается в предотвращении избыточной генерации АФК митохондриями и поддержании окислительной активности органелл в стрессовых условиях [6–8]. В последнее время накапливается все больше доказательств того, что подобная структурно-функциональная изменчивость митохондрий играет важную роль в приспособлении растений к неблагоприятным факторам окружающей среды [5–8].

В отличие от гипотермии, влияние на функционирование митохондрий растений повышенных температур остается малоизученным, а имеющиеся литературные данные достаточно противоречивы, возможно, вследствие того, что в ранних исследованиях использовались органеллы недостаточно высокого качества [3]. Однако и в современных работах можно найти данные, свидетельствующие о том, что условия гипертермии (35°С и выше) активируют, ингибируют или не оказывают влияния на окисление сукцината, малата, α-кетоглутарата и других дыхательных субстратов интактными митохондриями растений [9–11]. Крайне противоречивая информация имеется относительно активности в условиях гипертермии АО митохондрий, которая, как уже отмечалось, играет важную роль в устойчивости растений к действию стресс-факторов различной природы, включая гипотермию [4, 8]. Например, при окислении сукцината митохондриями проростков фасоли, при повышении температуры среды инкубации с 25 до 42°С вклад АО в дыхание снижался с 38 до 0% при почти двукратном увеличении скорости поглощения кислорода органеллами [11]. С другой стороны, при окислении сукцината митохондриями семядолей сои не было обнаружено существенных различий в чувствительности к температуре цитохромного и альтернативного пути окисления [10]. Очевидно, многие аспекты ответной реакции дыхания растений и метаболической активности изолированных митохондрий на действие как гипо-, так и гипертермии могут быть ткане- и видоспецифичными, а также зависеть от уровня базовой или приобретенной термотолерантности у растений, относящихся даже к одному виду [12]. Кроме того, эта реакция, очевидно, будет зависеть от схемы проведения опытов с растениями и методов изучения дыхания митохондрий при действии высокой температуры.

Показано, что функционирование комплекса I в митохондриях растений наименее устойчиво к условиям гипертермии по сравнению с другими комплексами ЭТЦ. Например, инкубация митохондрий побегов кукурузы при 27°С в течение 30 мин приводила к практически полной инактивации окисления малата в состоянии 3. При этом окисление НАД-зависимых субстратов было возможным с участием “матриксных” ротенон-нечувствительных НАД(Ф)·Н дегидрогеназ ЭТЦ в присутствии экзогенного НАД⁺ [13]. Причины низкой температурной устойчивости комплекса I в митохондриях растений остаются малоизученными, однако известно, что гипертермия действительно стимулировала выход кофермента НАД⁺ из матрикса митохондрий листьев ячменя с участием специального переносчика, ингибируя НАД-зависимое окисление глицина [14]. Кроме того, по аналогии с митохондриями животных можно предположить, что в условиях гипертермии происходит обратимый переход (или трансформация работы) комплекса I из активного состояния (А – active) в неактивное (D – de-active) [15]. Характеристики такой А/D трансформации работы комплекса I в стрессовых условиях достаточно хорошо изучены и, помимо животных, она была обнаружена в митохондриях грибов и бактерий [16]. Возможность аналогичной трансформации работы комплекса I у высших растений при действии высокой температуры или других стрессовых факторов внешней среды ранее не исследовалась, хотя она признается весьма вероятной, учитывая сходную структуру этого комплекса в митохондриях животных и растений [17].

Целью данной работы являлось изучение влияния высокой температуры на окисление НАД-зависимых субстратов с участием различных дыхательных путей и функциональное состояние комплекса I в митохондриях семядолей проростков люпина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. Объектом исследований служили митохондрии, выделенные из семядолей этиолированных проростков люпина узколистного (Lupinus angustifolius L., сорт Дикаф-14). Проростки люпина выращивали в течение 5 дней на воде в термостате при 24°С в темноте. В экспериментах по изучению влияния повышенной температуры на дыхание 5-суточные проростки люпина прогревали в термостате при температуре 37°С в течение 12 ч.

Выделение митохондрий из контрольных и подвергнутых действию гипертермии семядолей проростков люпина осуществляли, используя единую методику дифференциального центрифугирования, описанную ранее [18], в небольшой модификации. Семядоли люпина 12 г промывали дистиллированной водой, высушивали, охлаждали и измельчали в ступке со средой гомогенизации (в соотношении 1 : 4), содержащей 0.5 М сахарозу, 50 мМ MOPS-буфер (рН 8.0), 10 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотрейтол (ДТТ) и 0.1% БСА, свободный от ЖК. Гомогенат отфильтровывали через 4 слоя мираклоса и центрифугировали при 4000 g в течение 5 мин. Полученный супернатант центрифугировали при 15 000 g в течение 5 мин, осадок митохондрий ресуспендировали в среде отмывания, содержащей 0.4 М сахарозу, 20 мМ HEPES-буфер (рН 7.2), 5 мМ ЭДТА, 0.1% БСА, и центрифугировали при 4000 g в течение 5 мин. Для осаждения митохондрий супернатант центрифугировали при 13 000 g в течение 10 мин. Выделенные митохондрии ресуспендировали в малом объеме среды, содержащей 0.3 М сахарозу, 20 мМ HEPES-буфер (рН 7.2) и 0.1% БСА. Суспензию митохондрий (10–15 мг/мл) хранили на льду. Все операции проводили в холодной комнате при 2–4°С. Особое внимание уделяли длительности процедуры выделения митохондрий, которая не превышала 40 мин.

Митохондрии с инактивированным комплексом I получали прогреванием в термостате суспензии изолированных вышеописанным способом органелл (содержание белка 0.6–0.7 мг/мл) в течение 10 мин при 40°С в среде, состав которой указан в подписи к рисунку 6. После охлаждения среды до комнатной температуры вносили дыхательные субстраты, кофакторы, ингибиторы и регистрировали скорость поглощения кислорода.

Поглощение кислорода митохондриями при различных температурах среды инкубации измеряли полярографическим (или амперометрическим) методом с использованием кислородного электрода типа Кларка на приборе Oxytherm Electrode Control Unit (“Hansatech Instruments”, Англия). Инкубационная среда (1.2 мл) содержала 0.3 М сахарозу, 20 мМ HEPES-буфер (рН 7.4), 5 мМ MgCl₂, 5 мМ КН₂РО₄ (рН 7.4) и 0.1% БСА. Перед измерением скорости дыхания митохондрии (0.6–0.7 мг/мл белка) прединкубировались в среде при заданной температуре в течение различного интервала времени (от 1 до 3 мин), после чего в инкубационную среду вносился дыхательный субстрат. Если другое не указано в таблицах или на рисунках, в качестве субстрата окисления использовали 5 мМ малат в присутствии 5 мМ глутамата, необходимого для удаления оксалоацетата. Остальные добавки и условия экспериментов приведены в подписях к таблицам и рисункам. Содержание кислорода в насыщенной воздухом среде инкубации при различной температуре принималось эквивалентным концентрации О₂ в чистой воде при 760 мм рт. ст. и составляло 250 мкМ при 25°С, 233 мкМ (30°С), 219 мкМ (35°С) и 205 мкМ (40°С) [19]. Скорость поглощения кислорода при окислении дыхательного субстрата митохондриями в различных метаболических состояниях, величину коэффициента дыхательного контроля (ДК) и отношения АДФ/О рассчитывали по методу Chance и Williams [20]. Количество митохондриального белка определяли по методу Lowry с соавт. [21], используя БСА в качестве стандарта.

Ингибиторный анализ. Для ингибирования цитохромного пути (ЦП) дыхания использовали 1.0 мМ цианид калия (KCN), альтернативного (АП) – 3 мМ салицилгидроксамовую кислоту (СГК). Максимальную активность АП дыхания определяли по разнице поглощения кислорода митохондриями при окислении субстрата в состоянии 3 (после второй добавки АДФ) в отсутствие или в присутствии СГК на фоне добавленного KCN [22]. Ротенон-чувствительную составляющую дыхания митохондрий при окислении НАД-зависимых субстратов определяли по степени ингибирования поглощения кислорода в присутствии 20 мкМ ротенона. Оптимальные концентрации ингибиторов подбирались в предварительных опытах.

В работе использованы следующие реактивы: MgCl₂, КН₂РО₄ и другие соли отечественного производства марки о.с.ч. или х.ч. Дыхательные субстраты, нуклеотиды, БСА, MOPS, HEPES, ротенон, СГК и др. – фирмы “Sigma” (США).

Во всех экспериментах биологическая повторность была минимум 3-кратной, аналитическая – 3–4-кратной. Каждую серию опытов повторяли не менее трех раз. На рисунках представлены данные характерных опытов, в таблицах и графиках представлены средние значения и их стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В данной работе с целью изучения влияния повышенной температуры на окисление НАД-зависимых субстратов в митохондриях семядолей этиолированных проростков люпина было использовано несколько экспериментальных подходов. Во-первых, анализировали оперативную реакцию дыхания изолированных митохондрий на повышение температуры в ходе кратковременных (10–15 мин) опытов в условиях in vitro. Во-вторых, изучали изменения метаболической активности органелл, выделенных из семядолей, после достаточно длительного (12 ч) воздействия повышенной температуры на проростки в условиях in vivo. Наконец, было изучено последействие инкубации суспензии митохондрий люпина при повышенной температуре на окисление НАД-зависимых субстратов.

Влияние температуры на окисление митохондриями НАД-зависимых субстратов в условиях in vitro

На рисунке 1 приведены типичные полярографические кривые поглощения кислорода при окислении малата в присутствии глутамата митохондриями семядолей проростков люпина в контроле (25°С) и при высокой температуре (40°С). Показано, что окисление митохондриями этого НАД-зависимого субстрата при температуре 25°С существенно, и примерно в равной степени стимулировалось первой и последующими добавками АДФ (состояние 3), а затем тормозилось после его исчерпания в процессе синтеза АТФ (состояние 4). При этом величина дыхательного контроля (ДК) по Чансу (состояние 3/состояние 4) составляла около 3, что свидетельствовало о прочном сопряжении процесса окислительного фосфорилирования, а близкая к теоретической величина отношения АДФ/О (2.4–2.5) указывала на его высокую эффективность (рис. 1а).

Рис. 1.

Полярографические кривые поглощения кислорода при окислении малата митохондриями (МтХ) семядолей люпина при температуре 25°С (а) и 40°С (б). Состав среды инкубации: 0.3 М сахароза, 20 мМ HEPES-буфер (рН 7.4), 5 мМ MgCl₂, 5 мМ КН₂РО₄ (рН 7.4) и 0.1% БСА; дополнительно вносили 5 мМ малат, 5 мМ глутамат, 200 мкМ АДФ. Цифры около кривых – скорость поглощения кислорода митохондриями (нмоль О₂/(мин · мг белка)).

Повышение температуры среды инкубации до 40°С сопровождалось увеличением скорости окисления малата в состоянии 3. Однако обнаруживались ярко выраженные изменения в ответной реакции митохондрий на первую и последующие добавки АДФ. Вторая добавка АДФ заметно ускоряла окисление малата в состоянии 3 и снижала его в состоянии 4. В результате после второй добавки АДФ возрастала величина ДК (рис. 1б), которая сохранялась в ходе последующих циклов фосфорилирования (не показано). Подобный феномен “улучшения” состояния (conditioning) изолированных митохондрий растений и животных после нескольких последующих добавок АДФ хорошо известен [23]. Он может иметь разные причины, которые будут рассмотрены ниже.

На рисунке 2 и в таблице 1 также приведены данные, демонстрирующие влияние температуры среды инкубации в диапазоне 20–40°С на окисление малата митохондриями люпина в состоянии 3 и 4, а также на величину коэффициента ДК и отношения АДФ/О, рассчитанные на основании результатов опытов, аналогичных показанным на рисунке 1. Увеличение температуры между 20 и 30°С сопровождалось практически линейным увеличением скорости окисления субстрата в состоянии 3, чего не наблюдалось в состоянии 4, скорость которого с увеличением температуры возрастала неравномерно. При этом не обнаружено существенных различий в скорости окисления малата в ответ на первую и вторую добавку АДФ (рис. 2). Как уже отмечалось, окисление малата митохондриями при температуре 35–40°С сопровождалось значительными различиями в скорости состояния 3, состояния 4, а также в величине коэффициента ДК (увеличивалось) и отношения АДФ/О (снижалось) после двух добавок АДФ (рис. 2, табл. 1). Следует отметить, что величина первой добавки АДФ в определенных пределах (75, 100, 150 или 200 мкМ) не имела большого значения, поскольку повторное внесение АДФ в среду инкубации митохондрий всегда сопровождалось существенным увеличением скорости окисления субстрата в состоянии 3, а также величины ДК. Таким образом, при температуре 35–40°С начальная скорость окисления малата в состоянии 3 была существенно снижена, но возрастала после нескольких циклов фосфорилирования.

Рис. 2.

Влияние температуры на скорость окисления малата митохондриями семядолей люпина в состоянии 3 (кривые 1, 2) и состоянии 4 (кривые 4, 3) в ответ на первую и вторую добавки АДФ, соответственно. Состав среды инкубации: 0.3 М сахароза, 20 мМ HEPES-буфер (рН 7.4), 5 мМ MgCl₂, 5 мМ КН₂РО₄ (рН 7.4) и 0.1% БСА; дополнительно вносили 5 мМ малат, 5 мМ глутамат, 200 мкМ АДФ.

Таблица 1.

Влияние температуры на величину коэффициента дыхательного контроля (ДК) и отношения АДФ/О при окислении малата в митохондриях семядолей люпина, рассчитанных после первой (1) и второй (2) добавки АДФ

Температура, °С	ДК (1)	ДК (2)	АДФ/О (1)	АДФ/О (2)
20	4.4 ± 0.3	4.6 ± 0.4	2.2 ± 0.2	2.4 ± 0.1
25	3.3 ± 0.3	3.4 ± 0.4	2.4 ± 0.2	2.5 ± 0.2
30	3.6 ± 0.4	3.7 ± 0.5	2.3 ± 0.3	2.4 ± 0.2
35	3.9 ± 1.5	4.4 ± 1.3	2.2 ± 0.3	2.0 ± 0.2
40	2.2 ± 0.4	4.2 ± 0.9	2.4 ± 0.4	1.6 ± 0.3

Примечание. Инкубационная среда содержала: 0.3 М сахарозу, 20 мМ HEPES-буфер (рН 7.4), 5 мМ MgCl₂, 5 мМ КН₂РО₄ (рН 7.4) и 0.1% БСА; дополнительно вносили 5 мМ малат, 5 мМ глутамат, 200 мкМ АДФ.

Аналогичная активация дыхания митохондрий люпина в состоянии 3 после повторной добавки АДФ наблюдалась в условиях гипертермии при окислении других НАД-зависимых субстратов, в частности, цитрата (табл. 2) и пирувата (не показано). Важно, что подобный эффект не обнаруживался при окислении в митохондриях сукцината, которое катализируется ФАД-зависимой сукцинатдегидрогеназой (комплексом II) (табл. 2). Следует отметить, что при высокой температуре для достижения максимальной скорости окисления сукцината в состоянии 3 после первой добавки АДФ было необходимо присутствие в среде инкубации глутамата и/или АТФ для снятия ингибирования сукцинатдегидрогеназы оксалоацетатом.

Таблица 2.

Влияние повышенной температуры среды инкубации на скорости окисления цитрата и сукцината в митохондриях люпина в состоянии 3 (V₃) после первой (1) и второй (2) добавки АДФ

Температура, °С	Цитрат		Сукцинат + Глутамат
	V3 (1)	V3 (2)	V3 (1)	V3 (2)
25	60 ± 7	64 ± 8	146 ± 18	153 ± 16
40	28 ± 9	69 ± 17	197 ± 32	213 ± 25

Примечание. Инкубационная среда содержала 0.3 М сахарозу, 20 мМ HEPES-буфер (рН 7.4), 5 мМ MgCl₂, 5 мМ КН₂РО₄ (рН 7.4) и 0.1% БСА. Дополнительно вносили 10 мМ сукцинат, 10 мМ глутамат, 10 мМ цитрат и 100 мкМ АДФ. Скорости окисления субстратов выражены в нмолях О₂/ (мин мг белка).

С использованием ингибиторов дыхания была определена активность альтернативных путей митохондриального окисления. Показано, что окисление малата в митохондриях семядолей люпина при нормальной температуре в достаточно высокой степени (65–70%) тормозилось ротеноном (ингибитор комплекса I) и цианидом – 80–85% (ингибитор цитохромоксидазы) (рис. 3). В присутствии ротенона добавка в среду инкубации экзогенного НАД⁺, способного транспортироваться в интактные митохондрии растений, не стимулировала поглощение кислорода, следовательно, активность ротенон-нечувствительных НАД·Н-дегидрогеназ, субстрат-связывающие центры которых локализованы на внутренней (матриксной) стороне внутренней мембраны митохондрий, не лимитировалась уровнем этого кофермента (рис. 3а). Кроме того, нам не удавалось существенно повысить активность АО путем внесения в реакционную среду пирувата и ДТТ (рис. 3б), т.е. тех эффекторов, которые могут стимулировать работу данного фермента в митохондриях растений [4]. Таким образом, в митохондриях люпина активность альтернативных “матриксных,” ротенон-нечувствительных НАД·Н-дегидроназ составляла 35%, а максимальная активность CN-резистентной АО не превышала 20% от скорости дыхания в состоянии 3.

Рис. 3.

Влияние ингибиторов на окисление малата митохондриями (МтХ) семядолей люпина при 25°С. Состав среды инкубации: 0.3 М сахароза, 20 мМ HEPES-буфер (рН 7.4), 5 мМ MgCl₂, 5 мМ КН₂РО₄ (рН 7.4) и 0.1% БСА; дополнительно вносили 5 мМ малат, 5 мМ глутамат, 0.3 мМ пируват, 200 мкМ АДФ, 0.3 мМ НАД⁺, 1 мМ ДТТ, 1 мМ KCN, 3 мМ СГК, 20 мкМ ротенон. Цифры около кривых – скорость поглощения кислорода митохондриями (нмоль О₂/(мин·мг белка)).

Далее было показано, что активация окисления малата (в состоянии 3 после второй добавки АДФ) митохондриями люпина при повышении температуры происходила преимущественно, а в интервале температур 35–40°С – исключительно за счет увеличения активности ЦП окисления в ЭТЦ. Активность АО в условиях гипертермии, хотя существенно снижалась, но не инактивировалась полностью (рис. 4).

Рис. 4.

Влияние температуры на активность цитохромного (1) и альтернативного (2) дыхания митохондрий семядолей люпина при окислении малата.

Окисление малата митохондриями, выделенными из семядолей проростков люпина, подвергнутых действию повышенной температуры в условиях in vivo

На рисунке 5 показано, что выдерживание проростков люпина в условиях гипертермии (при 35°С в течение 12 ч) вызывало отчетливое ингибирование окисления малата митохондриями, которое сохранялось после выделения органелл. В ходе окисления малата митохондриями при 25°С наблюдалось торможение фосфорилирующего (в состоянии 3) окисления субстрата и снижение величины ДК после первой добавки АДФ. Повторная добавка АДФ существенно повышала или “улучшала” окислительную и фосфорилирующую активность митохондрий, в частности, увеличивала скорость состояния 3 и величину ДК (рис. 5а). В то же время, отношение АДФ/О, характеризующее эффективность окислительного фосфорилирования, оставалось существенно ниже теоретически возможного. Интересно, что наиболее отчетливо обратимое торможение окисления митохондриями малата проявлялось при температуре среды инкубации 35°С, при которой органеллы функционировали in vivo в клетках семядолей проростков. При этом также наблюдалось снижение скорости окисления субстрата в состоянии 3 и величины ДК после первой добавки АДФ, однако отношение АДФ/О оставалось достаточно высоким и резко снижалось после второй добавки АДФ на фоне увеличения скорости окисления малата в состояния 3 и величины ДК (рис. 5б). Таким образом, обнаруженная аналогичная ответная реакция на добавки АДФ в опытах in vitro и in vivo (рис. 1б, рис. 5) указывает, по-видимому, на одинаковый механизм, регулирующий окисление малата в митохондриях семядолей люпина при действии высокой температуры.

Рис. 5.

Окисление малата при температуре 25°С (а) и 35°С (б) митохондриями (МтХ), выделенными из семядолей люпина после прогревания проростков при 35°С. Состав среды инкубации: 0.3 М сахароза, 20 мМ HEPES-буфер (рН 7.4), 5 мМ MgCl₂, 5 мМ КН₂РО₄ (рН 7.4) и 0.1% БСА; дополнительно вносили 5 мМ малат, 5 мМ глутамат, 200 мкМ АДФ. Цифры около кривых – скорость поглощения кислорода митохондриями (нмоль О₂/(мин · мг белка)).

Влияние повышенной температуры и ионов Mg²⁺ на окисление НАД-зависимых субстратов митохондриями семядолей люпина

Известно, что комплекс I играет ключевую роль в работе ЭТЦ митохондрий животных, поэтому изучение его структуры и функциональной активности постоянно находится в центре внимания исследователей. Используя пермеабилизированные аламецитином митохондрии сердца крысы и субмитохондриальные частицы (СМЧ) сердца быка было показано, что комплекс I существует в них в виде смеси двух форм или состояний – активной (А) и деактивированной (D). Было обнаружено, что обратимая A/D трансформация комплекса I чувствительна к некоторым факторам среды, в частности, высокой температуре [24, 25]. Для СМЧ и митохондрий животных был предложен ряд диагностических тестов для обнаружения функционирования комплекса I в инактивированном состоянии. Среди таких тестов – использование двухвалентных катионов (Mg²⁺, Ca²⁺), в присутствии высокой концентрации которых происходит существенное замедление D/A трансформации комплекса I, и которое может дать простой способ определения уровня его инактивации в условиях гипертермии. Например, после прогревания при 38°С в течение 20 мин митохондрий сердца крысы в присутствии 10 мМ MgCl₂ каталитическая активность комплекса I ингибировалась на 40–80% в зависимости от рН среды инкубации [25].

Мы применили аналогичный тест для выявления температурной инактивации ротенон-чувствительного окисления НАД-зависимых субстратов в интактных митохондриях семядолей. В этих опытах мы изучали влияние предварительного прогревания суспензии митохондрий люпина при 40°С в течение 10 мин в реакционной среде, содержащей или не содержащей 10 мМ MgCl_2, на окисление малата или пирувата. На рисунке 6а показано, что после прогревания митохондрий в присутствии ионов Mg²⁺ окисление малата при 25°С было сильно заторможено (хотя и не полностью) и не реагировало на добавку АДФ. При этом в течение времени проведения полярографического опыта (7–10 мин) не наблюдалось спонтанной реактивации дыхания. Добавка экзогенного НАД⁺ частично стимулировала поглощение кислорода, которое было нечувствительно к ротенону (рис. 6а). В отличие от малата, окисление митохондриями сукцината, катализируемого комплексом II ЭТЦ, в указанных условиях происходило с высокой скоростью и сопровождалось фосфорилированием, о чем можно было судить по наличию ДК (рис. 6а). Аналогичное торможение ротенон-чувствительного поглощения кислорода после прогревания митохондрий в присутствии 10 мМ МgCl₂ наблюдалось при окислении митохондриями пирувата (рис. 6б). Если МgCl₂ был добавлен в среду инкубации предварительно прогретых митохондрий одновременно или после внесения дыхательного субстрата, скорость окисления малата в состоянии 3 достаточно быстро восстанавливалась (хотя и не полностью) в ходе нескольких циклов фосфорилирования. При этом окисление малата ингибировалось ротеноном (рис. 6в) и слабо стимулировалось экзогенным НАД⁺ (не показано). Таким образом, последействие прогревания митохондрий люпина в присутствии высокой концентрации ионов Mg²⁺ характеризовалось, во-первых, почти полным торможением чувствительного к ротенону окисления малата (т.е. активности комплекса I), которое не восстанавливалось в течение длительного лаг-периода после добавки субстрата. Кроме того, оно сопровождалось потерей митохондриями некоторой части пула матриксного НАД⁺, что ограничивало скорость окисления этого субстрата с участием альтернативных “матриксных” ротенон-нечувствительных НАД·Н-дегидрогеназ.

Рис. 6.

Влияние ионов Мg²⁺ и предварительного прогревания митохондрий (МтХ) на окисление НАД-зависимых субстратов. Митохондрии прогревали при 40°С в течение 10 мин в стандартной среде инкубации в присутствии (а), (б), или в отсутствие (в) 10 мМ MgCl₂. Состав среды инкубации: 0.3 М сахароза, 20 мМ HEPES-буфер (рН 7.4), 5 мМ КН₂РО₄ (рН 7.4) и 0.1% БСА; дополнительно вносили: 5 мМ малат, 5 мМ глутамат, 5 мМ пируват (в присутствии 0.6 мМ ТПФ), 5 мМ сукцинат, 1 мМ НАД·Н, 10 мМ MgCl₂, 100 мкМ АДФ, 0.35 мМ НАД⁺, 20 мкМ ротенон. Цифры около кривых – скорость поглощения кислорода митохондриями (нмоль О₂/(мин·мг белка)).

ОБСУЖДЕНИЕ

В литературе существует большой разброс данных относительно влияния повышенной температуры как на рост растений, так и на метаболическую активность митохондрий [11, 26, 27]. Возможно, что влияние гипертермии на дыхание митохондрий зависит от объекта исследования, продолжительности температурного воздействия, а также качества выделенных препаратов органелл [3].

В наших экспериментах in vitro повышение температуры среды инкубации в диапазоне 20–30°С активировало окисление малата митохондриями семядолей люпина в состоянии 3 и 4. При этом скорость окисления субстрата в активном состоянии (V₃) возрастала примерно в 1.7 раз на 10°С повышения температуры (коэффициент Q₁₀). Для достижения аналогичной величины коэффициента Q₁₀ при окислении малата в состоянии 3 в диапазоне температур 30–40°С требовалось внесение в среду инкубации нескольких добавок АДФ для снятия исходного ингибирования окисления НАД-зависимого субстрата в условиях гипертермии (35–40°С) (рис. 1). Эти результаты согласуются с данными о влиянии на окисление малата повышенной температуры в условиях in vivo. Прогревание проростков люпина при 35°С в течение 12 ч также сопровождалось обратимым ингибированием окисления НАД-зависимого субстрата в состоянии 3, которое наиболее сильно проявлялось при увеличении температуры среды инкубации органелл (рис. 5). Таким образом, митохондрии семядолей люпина, обладая достаточно высокой термоустойчивостью, способны выдерживать (переживать) воздействие гипертермии in vivo и in vitro и, главное, сохранять потенциальную способность восстанавливать свою окислительную и фосфорилирующую активность после окончания ее действия, что в целом согласуется с данными литературы [3, 13].

Следует также отметить, что окисление малата в условиях гипертермии происходило преимущественно с участием ЦП дыхания, при крайне низкой активности АО (рис. 4). Эти данные указывают, по-видимому, на более высокую чувствительность АП в митохондриях семядолей к гипертермии по сравнению с ЦП, что отмечали и другие авторы [11, 27]. Например, в митохондриях, выделенных из проростков кукурузы, температурный оптимум активности АО составлял 15–20°С, после которого при увеличении температуры активность АО постепенно снижалась и практически полностью ингибировалась при 41°С [27]. Природа теплового ингибирования активности АП в условиях in vitro остается неизвестной. Важно, что оно может быть обратимо. В частности, снижение температуры среды инкубации с 42 до 25°С восстанавливало максимальную активность АО в митохондриях гипокотилей бобов [11]. Противоречивость литературных данных по влиянию гипертермии на участие АП в дыхании может объясняться тем, что активность АО в митохондриях зависит не только от температуры, но и от восстановленности пула убихинона, жесткости контроля дыхания со стороны аденилатной системы и уровня активации АО под влиянием кетокислот и других эффекторов [10].

Более подробно хотелось бы остановиться на рассмотрении возможной причины обнаруженного в данной работе ингибирования в условиях гипертермии окисления НАД-зависимых субстратов, катализируемого чувствительным к ротенону комплексом I ЭТЦ. Несмотря на то, что торможение активности комплекса I при повышенной температуре в митохондриях растений было описано уже довольно давно [13, 14], вопросы относительно его механизма и функциональной роли продолжают оставаться актуальными и в настоящее время, поскольку ингибирование может быть весьма лабильным и, по-видимому, иметь различные причины. Например, в экспериментах in vitro было показано быстрое снижение скорости НАД-зависимого окисления глицина в митохондриях листьев гороха при 40°С, которое предотвращалось внесением кофермента НАД⁺ в среду инкубации. Это объяснялось практически полным истощением (потерей) пула НАД⁺ в матриксе уже после 5-минутной инкубации органелл в условиях гипертермии [14]. Авторы приходят к выводу, что высокая температура индуцирует быстрый и массированный выход кофермента НАД⁺ из матрикса митохондрий с участием специального переносчика [14]. Пока неизвестно, насколько широко распространен подобный феномен среди митохондрий, выделенных из других растительных объектов. В ходе наших экспериментов in vitro было показано, что воздействие высокой температуры, по-видимому, сопровождалось потерей органеллами части пула НАД⁺, поскольку экзогенный НАД⁺ оказывал некоторое стимулирующее действие на дыхание. Однако эта потеря незначительно сказывалась на скорости окисления малата с участием альтернативных ротенон-нечувствительных НАД·Н-дегидрогеназ, имеющих, как известно, более низкое по сравнению с комплексом I сродство к субстрату (рис. 6). Кроме того, выдерживание этиолированных проростков люпина в течение нескольких часов при температуре 35°С не сопровождалось потерей у выделенных из них митохондрий способности к окислению малата в состоянии 3 с высокой скоростью после нескольких добавок АДФ (рис. 5). Таким образом, помимо возможного изменения уровня кофермента НАД⁺ в матриксе, в митохондриях люпина, по-видимому, функционирует и другой механизм, регулирующий окисление НАД-зависимых субстратов не только в условиях гипертермии, но и после окончания ее действия.

Процесс постепенного восстановления функций изолированных митохондрий растений, связанных с выработкой энергии (скорости состояния 3 и величины ДК) после добавки дыхательных субстратов, в том числе НАД-зависимых, не является новым феноменом. Например, в ранних работах были описаны и проанализированы эффекты быстрого, в течение нескольких минут, полярографического опыта увеличения скорости окисления субстратов в состоянии 3 и величины ДК после нескольких добавок АДФ, наблюдаемых у митохондрий растений после “состаривания” (aging) суспензии при 0°С (называемого “кондиционированием”, или conditioning), или восстановления функциональной активности органелл после длительного, в течение нескольких часов, выдерживания митохондрий при 25°С в отсутствие субстрата дыхания (названного “самовосстановлением”, или self-restoration) [22, 28]. В работе Hung и Romani [28], проанализировав все возможные причины обратимого ингибирования скорости окисления α-кетоглутарата в митохондриях плодов авокадо после длительного выдерживания суспензии органелл в условиях деэнергизации, а именно, ингибирование проницаемости дыхательных субстратов, существенную потерю пула НАД⁺, снижение активности транслоказы адениновых нуклеотидов или АТФ-синтетазы, или торможение НАД·Н-дегидрогеназы, авторы посчитали наиболее вероятным последнее предположение.

В качестве такого механизма, обеспечивающего торможение окисления НАД-зависимых субстратов в различных стрессовых условиях, в том числе, в условиях гипертермии, может рассматриваться обнаруженная у животных, некоторых дрожжей и бактерий обратимая спонтанная трансформация комплекса I из активного (А) в неактивное (D) состояние [16]. Условием подобной деактивации комплекса I в митохондриях животных является невозможность протекания реакции, катализируемой ротенон-чувствительной НАД·Н-убихинон оксидоредуктазой при отсутствии субстрата или в присутствии НАД·Н, но при полной восстановленности пула убихинона. Кроме того, на СМЧ митохондрий, выделенных из различных объектов, было показано, что скорость А/D трансформации комплекса I увеличивалась с ростом температуры и в условиях гипертермии (37–38°С) происходила очень быстро (менее чем за минуту) [16]. Также быстро протекает и обратный переход комплекса I из неактивного в активное состояние (D/A) при нормальной температуре после добавки субстрата и восстановления транспорта электронов в дыхательной цепи. Однако скорость D/A трансформации комплекса I может быть существенно замедлена в присутствии двухвалентных катионов (Mg²⁺ или Са²⁺) [15, 16].

Анализ результатов, полученных в данной работе, позволяет говорить о существовании аналогичного механизма, регулирующего активность комплекса I, при действии повышенной температуры в митохондриях растений, в частности, в митохондриях семядолей люпина. Так в экспериментах in vitro было показано, что кратковременная (в течение нескольких минут) прединкубация при высокой температуре (40°С) митохондрий существенно снижала максимальную скорость окисления малата в состоянии 3, что проявлялось после первой добавки АДФ (рис. 1). При этом следует отметить, что торможение окисления НАД-зависимого субстрата не было полным, во-первых, благодаря присутствию в митохондриях растений “матриксных” ротенон-нечувствительных НАД·Н-дегидрогеназ, активность которых не ингибировалась в условиях гипертермии [13]. Кроме того, активация функционирования комплекса I после появления в матриксе НАД·Н в результате окисления малата, очевидно, должна была сопровождаться его быстрым переходом из неактивного в активное состояние (D/A трансформация) и увеличением скорости поглощения кислорода. Также можно предположить, что добавки АДФ дополнительно стимулировали такой переход комплекса I благодаря активации работы дыхательной цепи и снижению уровня восстановленности ее переносчиков электронов, включая пул убихинона.

Доказательства, свидетельствующие о переходе комплекса I в неактивное состояние в условиях гипертермии в митохондриях семядолей люпина, были получены нами при изучении влияния на этот процесс двухвалентных катионов. Было показано, что после кратковременного прогревания суспензии (в течение 10 мин при 40°С) в присутствии 10 мМ MgCl₂, не оказывающего негативного действия на дыхание нестрессированных митохондрий, наблюдалось практически полное ингибирование окисления малата, катализируемого комплексом I, которое в этих условиях осуществлялось только с участием ротенон-нечувствительных НАД·Н-дегидрогеназ (рис. 6а). При этом последействие повышенной температуры слабо сказывалось на окислении сукцината (в присутствии глутамата) и экзогенного НАД·Н (рис. 6а, б). Аналогичные результаты были получены при действии гипертермии на окисление митохондриями люпина других НАД-зависимых субстратов, в частности, пирувата (рис. 6б). Наиболее вероятной причиной инактивации комплекса I при прогревании митохондрий в присутствии высокой концентрации MgCl₂ является транспорт и накопление в матриксе ионов Mg²⁺ либо вследствие пассивной диффузии по градиенту концентрации, или в результате активного транспорта при наличии остаточного мембранного потенциала на внутренней мембране вследствие неполного отмывания дыхательных субстратов при выделении органелл. Следует подчеркнуть, что спонтанная реактивация окисления малата у предварительно прогретых в присутствии магния митохондрий не наблюдалась в течение полярографического опыта (рис. 6а, б). В то же время, процесс восстановления чувствительного к ротенону окисления малата предварительно прогретыми митохондриями был довольно быстрым, если НАД-зависимый субстрат добавляли одновременно или раньше магния (рис. 6в) и гораздо более длительным, либо вообще не наблюдался, если Mg²⁺ добавляли в среду инкубации за несколько минут до малата (данные не приведены). Такие существенные изменения в скорости восстановления активности комплекса I в зависимости от последовательности добавок в среду инкубации магния и НАД-зависимого субстрата, возможно, объяснялись разной скоростью транспорта и накопления в матриксе двух эффекторов, оказывающих на этот процесс противоположное действие.

Не исключено, что переход в неактивное состояние комплекса I в изолированных митохондриях растений возможен и при более низкой температуре (30–35°С), но при ее более длительном воздействии, как это было показано на митохондриях животных [16]. Нами были получены косвенные доказательства подобной трансформации комплекса I в условиях in vivo, причем при относительно низкой температуре (35°С). Это важно выяснить, поскольку большинство исследований по влиянию гипертермии на А/D переход комплекса I были выполнены в условиях in vitro – на изолированных митохондриях, СМЧ или выделенном ферменте. Несомненно, необходимы дополнительные исследования, чтобы внести большую ясность в обсуждаемые вопросы. Вместе с тем, в данной работе впервые получены результаты, свидетельствующие о возможности A/D трансформации комплекса I в интактных митохондриях растений под влиянием высокой температуры.

Что касается возможной физиологической роли обсуждаемых изменений активности комплекса I, то этот вопрос остается открытым даже для митохондрий животных, у которых они были обнаружены около 30 лет назад [15]. При этом объяснение функциональной роли торможения комплекса I в условиях гипертермии в митохондриях животных представляется достаточно сложным, поскольку нормальная температура многих животных организмов превышает 36°С. Вместе с тем, высказывается предположение, согласно которому временная инактивация комплекса I может способствовать предотвращению избыточной генерации супероксида и перекиси водорода митохондриями в стрессовых условиях [29]. Если подобное “антиоксидантное” свойство D формы комплекса I получит экспериментальное подтверждение, оно будет иметь важное значение для митохондрий растений, причем именно в условиях повышенной температуры. Поскольку, во-первых, в отличие от животных изменение температуры растительных организмов колеблется в широком диапазоне, а быстрое ее повышение (до 35°С и выше), сопровождаемое резкой активацией дыхания, очевидно, приводило бы к быстрому исчерпанию дыхательных субстратов и снижению содержания кислорода в тканях и клетках. Кроме того, в условиях гипертермии, на фоне активации окисления субстратов с участием основной цитохромной ЭТЦ и увеличения скорости образования АФК в митохондриях растений, в том числе, в митохондриях семядолей люпина, нередко обнаруживается ингибирование АО, которая играет ключевую роль в поддержании редокс-гомеостаза митохондрий и клетки, препятствуя возникновению окислительного стресса [8]. Поэтому временное торможение начальной НАД·Н-дегидрогеназы (комплекса I), являющейся основным поставщиком восстановительных эквивалентов в ЭТЦ и одним из главных источников АФК [17, 30], могло бы рассматриваться в качестве важного защитного механизма, предотвращающего избыточную генерацию супероксида и перекиси водорода в митохондриях растений в условиях гипертермии.

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства образования и науки Российской Федерации (номер темы 121040800153-1 “Механизмы адаптации растений к факторам аридизации глобального климата и антропогенному загрязнению окружающей среды”).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.