Физиология растений, 2022, T. 69, № 6, стр. 563-571

ВВЕДЕНИЕ

В эволюционном ряду развития жизни на Земле дыхание занимает особое место как процесс, обеспечивающий функционирование организмов энергией и метаболитами. О его масштабах свидетельствует тот факт, что за сутки в процессе дыхания растения окисляют до 70% продуктов фотосинтеза [1, 2], а растительность надземных экосистем возвращает в атмосферу по меньшей мере половину всего ассимилированного за год СО₂ [3].

Основу клеточного дыхания составляют гликолиз, цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) и митохондриальная электрон-транспортная цепь (мЭТЦ), основная функция которой состоит в генерации АТФ (рис. 1). Митохондрии взаимодействуют с ядром и хлоропластами, участвуют в клеточном сигналинге и поддержании редокс-баланса [4]. Митохондриальная ретроградная регуляция играет важную роль в реакции растений на стресс, активирует целевые гены, сообщает об изменении энергетической эффективности и в тесной коммуникации с другими сигнальными путями клетки направляет метаболизм с роста на адаптацию к неблагоприятным воздействиям [5]. Наличие множества альтернативных дыхательных путей и ферментов придает растениям поразительную пластичность, способность программировать метаболизм и энергетику клеток в соответствии с этапом онтогенетического развития и изменениями условий среды. По мнению О.А. Семихатовой [6] эффективность обмена энергии при дыхании (ЭЭД) в норме и при стрессе является одним из кардинальных вопросов биологии.

Рис. 1.

Схема ключевых этапов дыхания и использования дыхательной энергии в растении. Вовлечение альтернативного и других нефосфорилирующих путей в ЭТЦ митохондрий неизбежно приводит к диссипации энергии, но необходимо для поддержания гомеостаза растительной клетки. Обсуждение в тексте. Сокращения: ОА – оксалоацетат; 2‑ОГ – 2-оксоглутарат; Гл-6-Ф – глюкозо-6-фосфат; Рибулозо-5-Ф – рибулозо-5-фосфат; ОПФП – окислительный пентозофосфатный путь; ПВК – пировиноградная кислота (пируват); ФД –фотодыхание; ФЕП – фосфоенолпируват; ЭЭД – энергетическая эффективность дыхания.

Этапы дыхания подробно описаны О.А. Семихатовой и Т.В. Чирковой [7]. Отметим ключевые моменты и остановимся на некоторых новых сведениях о химизме и физиологии дыхательного процесса. Начальный этап дыхания – гликолиз – процесс анаэробного распада гексозы до пировиноградной кислоты (ПВК) с образованием АТФ, НАД·Н и различных предшественников для анаболизма, локализован в цитозоле и пластидах. Пластидный и цитозольный гликолитические пути взаимодействуют через высокоселективные транспортеры, локализованные во внутренней мембране пластид. В цитозоле растительных клеток гликолизу подвергаются сахароза и глюкоза, а в пластидах гетеротрофных тканей и хлоропластах – преимущественно крахмал. Дисахарид сахароза предварительно гидролизуется, образуя мономеры глюкозу и фруктозу. Чтобы стать субстратом, доступным для дыхательных превращений, крахмал деградирует под действием ферментов. Образовавшиеся глюкозные мономеры выделяются из пластид в цитозоль, где и подвергаются анаэробному распаду. В цепи реакций гликолиза выделяют несколько ключевых этапов: фосфорилирование молекулы глюкозы (Глю) и ее расщепление на две фосфотриозы, окисление фосфоглицеринового альдегида до фосфоенолпирувата (ФЕП) с восстановлением НАД⁺ и превращение ФЕП в пировиноградную кислоту (ПВК). Под влиянием внешних факторов метаболизм сахарозы и ФЕП может осуществляться по альтернативным путям. Например, участие пирофосфата в фосфорилировании фруктозо-6-фосфата (Фру-6-Ф) или в активном транспорте Н⁺ в вакуоль из цитозоля при стрессе способствует сохранению пула АТФ [8].

В отличие от животных клеток, где весь ФЕП превращается в ПВК, в растительных клетках часть ФЕП преобразуется в малат [9]. При взаимодействии ФЕП с ФЕП-карбоксилазой и ${\text{HCO}}_{3}^{ - }$ образуется оксалоацетат (ОА), который превращается в малат при участии НАД(Ф)·Н-зависимой малатдегидрогеназы. В цитоплазме возможно также прямое превращение ПВК в малат (восстановительное карбоксилирование), но вклад этого процесса малосущественен [7]. Ключевые ферменты гликолиза контролируются аденилатами, его скорость возрастает при повышении потребности в энергии (АТФ). Однако наличие обходных путей снижает зависимость дыхания от аденилатов.

Наряду с гликолизом в клетках функционирует пентозофосфатный путь (ПФП) распада глюкозы, который включает окислительную и восстановительную ветви [10]. Окислительная ветвь превращает Глю-6-Ф в СО₂ с образованием рибулозо-5-фосфата (Рибулозо-5-Ф) и НAД(Ф)·Н. Ток углеводов через окислительный ПФП усиливается при стрессе и нарушении митохондриальных функций, обеспечивая тем самым образование предшественников для синтеза нуклеотидов, сохранение метаболического и редокс-гомеостаза. При окислительном стрессе митохондрий окислительный ПФП и анаплеротические пути метаболизации Глю способствуют поддержанию пула НАД·Н [11]. Неокислительная ветвь ПФП метаболизирует гликолитические интермедиаты, снабжая метаболитами синтез нуклеиновых и аминокислот, что особенно важно для пролиферирующих клеток. Неокислительный ПФП может также поставлять в гликолиз промежуточные продукты метаболизации рибозо-5-фосфата.

Продукты гликолиза поступают из цитозоля в митохондрии с помощью специфических транслокаторов [8]. ПВК окисляется в ЦТК. Малат декарбоксилируется с участием НАД-зависимого малик-энзима до ПВК и/или окисляется малатдегидрогеназой с образованием ОА. Если бы ПВК была единственным субстратом, поставляемым в ЦТК, то экспорт метаболитов из цикла для различных биосинтезов (включая ассимиляцию азота) привел бы к его остановке. ЦТК обеспечивает клетки и ткани различными метаболитами, тесно связан с обменом углеводов, белков и липидов. Большинство ферментов ЦТК локализованы в матриксе митохондрий или образуют комплексы, ассоциированные с внутренней мембраной. Реакции дегидрирования приводят к образованию НАД·Н и ФАД·Н₂, которые окисляются в мЭТЦ. Регуляция цикла осуществляется соотношением концентраций НАД⁺/НАД·Н и АДФ/АТФ.

В условиях стресса, помимо ПВК и малата, окислению в митохондриях могут подвергаться продукты катаболизма белков и липидов. Например, при углеводном голодании в качестве дыхательного субстрата используются аминокислоты [12]. При осмотическом и солевом стрессах накапливается значительное количество пролина, который затем может быть окислен в процессе дыхания [13]. У С₃-растений в условиях, активирующих фотодыхание, в митохондриях окисляется НАД·Н, образованный при превращении двух молекул глицина в серин [14].

В глиоксисомах локализован глиоксилатный цикл, представляющий собой модификацию ЦТК [15]. Он участвует в утилизации запасных липидов, ß-окисление которых приводит к образованию ацетил-КоА. Сукцинат выходит из глиоксисом и может участвовать в ЦТК или глюконеогенезе. В реакции дегидрирования малата до ОА восстанавливается одна молекула НАД⁺. Таким способом из запасных веществ образуются необходимые для роста проростков метаболиты и НАД·Н.

Тонкий контроль метаболизма углеводов в дыхательных путях растительной клетки осуществляется, в первую очередь, ферментами, катализирующими реакции гликолитического превращения гексоз в ПВК или ОА, превращения ПВК в ацетил-КоА с последующей его метаболизацией в ЦТК [7]. Активность ферментов модулируется концентрацией субстрата, рН, аллостерическими эффекторами и обратимыми ковалентными модификациями в результате фосфорилирования/дефосфорилирования, взаимопревращения тиол-дисульфид, взаимодействия серосодержащих аминокислот белков-ферментов с NO [8].

Исследования дыхательного процесса выходят за рамки изучения только субстратов, катализирующих их ферментов, последовательности и направленности реакций. С помощью omics-технологий получены сведения о функционировании целых интерактомов, представляющих полный набор белок-белковых взаимодействий и “ченнелинга” метаболитов в отдельной клетке. Так, ферменты гликолиза фосфоглицератмутаза и енолаза образуют метаболон, связанный вне хлоропластов с триозофосфатным транслокатором, и вне митохондрий – с пируваткиназой и потенциалзависимым анионным каналом (VDAC) [16]. Образование такого интерактома не связано с проявлением специфической активности ферментов, а направлено на поддержание высокоэффективной координации хлоропластов и митохондрий и энергетического баланса клетки. В ЦТК выявлено 125 нековалентно связанных метаболонов, представляющих собой взаимодействия между ферментами цикла и 37 различными митохондриальными белками [17]. Эти исследования дают новые представления о пространственных аспектах функционирования ЦТК и его связи с метаболизмом аминокислот, синтезом АТФ, поддержанием редокс-статуса мЭТЦ, липидным обменом, сигналингом при стрессе.

Более 50% объема поверхности внутренней мембраны митохондрий занято белками, из них 35% – это белки-переносчики е^– и протонов от НАД(Ф)·Н на О₂ и АТФ-синтазы [18]. мЭТЦ включает четыре основных трансмембранных мультиферментных комплекса (I – IV) и два небольших по молекулярной массе компонента (убихинон и цитохром с), выполняющих функцию переноса е^– между мультиферментными комплексами. Комплекс I (НАД·Н-дегидрогеназный) осуществляет перенос е^- от НАД·Н к убихинону Q. Его мембранная часть содержит четыре Fe-S-центра. В состав периферической части входит ФМН-зависимая НАД·Н (убихинон-оксидоредуктаза), которая содержит три Fe-S-центра. Комплекс II (сукцинат-дегидрогеназный) катализирует окисление сукцината убихиноном с участием флавиновой (ФАД-зависимой) сукцинат : убихинон-оксидоредуктазы. В состав фермента входят три Fe-S-центра и цитохром b. Комплекс III (цитохром b/с₁ − комплекс) переносит е^– от восстановленного убихинона на цитохром с. Он содержит цитохромы b₅₅₆ и b₅₆₀, Fe-S белок Риске, цитохром с и центры связывания для убихинона. Комплекс IV (цитохром а/а₃ − комплекс) является терминальным, переносит е^– от цитохрома с к О₂, в его состав входят цитохромы а и а₃ (цитохромоксидаза или кислород-оксидоредуктаза) и два атома Cu. Комплексы I, III и IV образуют связанные с мембраной высокоупорядоченные суперкомплексы (респирасомы), что способствует ускорению тока е^– вдоль мЭТЦ [19, 20].

Ток е^- через комплексы I, III и IV обеспечивает энергией работу Н⁺-помп и образование протонного потенциала (ΔµН⁺), являющегося мерой свободной энергии, которая реализуется в синтезе АТФ с участием АТФ-синтазы (комплекс V).

Современные расчеты показывают, что при полном функционировании гликолиза, ЦТК и основного цитохромного пути в мЭТЦ количество образуемого АТФ на 1 моль окисленной глюкозы составляет 29 моль, а не 36, как считалось ранее, поскольку при сопряжении в комплексе IV прокачивается только два протона [21, 22]. В расчетах энергетической эффективности дыхания (ЭЭД) также учтены траты ΔµН⁺ для транспорта метаболитов через внутреннюю мембрану, утечка е^– и другие потери.

мЭТЦ включает пути, не связанные с генерацией ΔµН⁺. К ним относят конкурирующие с комплексом I ротенон-нечувствительные дегидрогеназы, способные окислять НАД(Ф)·Н и восстанавливать пул убихинона [23, 24]. Активность альтернативных дегидрогеназ влияет на редокс-баланс клетки (соотношение НАД(Ф)⁺/НАД(Ф)·Н) и регулируется Са²⁺. Митохондриальное окисление 1 моля цитозольного НАД(Ф)·Н позволяет получить до 1.5 молей АТФ [22]. К системам, рассеивающим протонный градиент, относятся разобщающие белки (UCP), аналогичные UCP-белкам животных [24–26]. Полагают, что UCP поддерживают редокс-баланс в мЭТЦ, способствуя снижению скорости генерации АФК в митохондриях, регулируют скорость ЦТК, участвуют в транспорте метаболитов из митохондрий и, в целом, модулируют энергетический обмен.

Наиболее важным ферментом, обеспечивающим перенос е^– по альтернативному нефосфорилирующему пути, является альтернативная цианидрезистентная оксидаза (АО). АО – терминальная убихинол:кислород-оксидоредуктаза, которая переносит е^– с убихинона непосредственно на О₂, минуя генерирующие электрохимический градиент протонов комплексы III и IV [27]. Вовлечение АО приводит к снижению ЭЭД. При транспорте е^– по альтернативному пути (АП) величина Y_{АТФ/глюкоза} равна 11 моль АТФ/моль глюкозы [22], что на 62% меньше, чем по цитохромному пути. АО представляет собой гомодимер с мол. м. 32–37 кДа [28, 29]. Домены N-терминала мономеров АО ковалентно связаны дисульфидным мостиком остатков цистеина и ответственны за формирование димерной структуры. Восстановление дисульфидной связи в сульфгидрильную приводит к активации АО. Активность АО зависит от редокс-состояния фермента, восстановленности пула убихинона, содержания ключевых метаболитов (α-кетокислот), количества белка фермента и его изоформы [30, 31].

Показано участие АО в термогенезе ароидных [32], поддержании баланса между углеводным метаболизмом и скоростью электронного транспорта [30], регуляции скорости генерации АФК [33, 34], окислении образующегося в хлоропластах восстановителя [35], ретроградной сигнализации [4, 24, 36]. Экспрессия генов АО отмечена у прорастающих семян, формирующихся цветков и созревающих плодов, что свидетельствует об участии АП в процессах роста и развития [24, 37].

Активацию энергетически малоэффективного АП наблюдали при действии стресс-факторов (дефицит влаги, минеральных элементов, засоление и др.), вызывающих подавление основного (цитохромоксидазного) пути транспорта е^– [38–41]. Вовлечение АП нередко сопровождалось активацией других энергодиссипирующих механизмов и антиоксидантной системы [42–46]. Это может указывать на участие АО в координации защитных механизмов клетки и регуляции генов стресс-ответа [34, 36, 47]. Современные данные подтверждают справедливость мнения О.А. Семихатовой [6] о том, что растения всегда имеют максимальную эффективность дыхания, а изменение показателей, характеризующих ЭЭД, лишь свидетельствует о перестройке их метаболического и энергетического баланса.

Особый интерес представляет вопрос о дыхании фотосинтезирующих клеток на свету. О.А. Семихатова неоднократно подчеркивала [6, 48], что для решения вопроса об ЭЭД растения необходимо учитывать снабжение энергетическими эквивалентами и метаболитами за счет фотосинтеза и наличие энергодиссипирующих дыхательных путей. Анализ накопленных к настоящему времени данных показывает, что дыхание на свету участвует в образовании и экспорте конечных продуктов фотосинтеза, контролирует уровень накопления восстановителей в клетке, защищает фотосинтетический аппарат от фотоингибирования, способствует сохранению гомеостаза клеток и нормальной жизнедеятельности растений [49–52]. Наблюдаемое снижение выделения СО₂ при дыхании на свету связано с реорганизацией метаболизма фотосинтезирующей клетки [51, 53]. На свету цитозольный гликолиз ограничен, а ЦТК модифицирован в результате использования части метаболитов в азотном обмене и повышения содержания малата и фумарата. мЭТЦ остается функциональной, и в зависимости от условий (например, на интенсивном свету) транспорт е^– может активироваться за счет вовлечения АО. Свет может влиять на экспрессию генов АО через фоторецепторную систему клетки [54]. Высокая освещенность и другие стрессы усиливают оксигеназную функцию РБФ-карбоксилазы и, следовательно, образование НАД·Н фотодыхательного происхождения, который окисляется в митохондриях с поглощением О₂ [14]. АО участвует в окислении экспортируемых из хлоропластов восстановителей, тем самым “разгружая” фотосинтетическую ЭТЦ [34, 52].

Тот факт, что в процессе дыхания окисляется значительная часть фотосинтетически ассимилированного углерода, и за период вегетации растения переводят в СО₂ количество дыхательного субстрата сопоставимое с накопленной биомассой, ставит вопрос о дыхательной цене процессов, обеспечивающих жизнедеятельность растений. Это важно в контексте разработки стратегий повышения урожайности основных продовольственных культур и сохранения природного биоразнообразия. Остановимся на основных компонентах и процессах формирования дыхательной цены.

У молодых интенсивно растущих растений (органов) подавляющая часть процесса дыхания (60–70%) связана с ростом. Согласно теоретическим расчетам [55] и имеющимся экспериментальным данным [2] из единицы дыхательного субстрата – глюкозы, которая используется в качестве источника С-скелетов и для генерации АТФ и НАД(Ф)·Н, синтезируется 0.75–0.85 единиц вегетативной биомассы. Трансформация субстрата в биомассу сопровождается выделением СО₂ (дыхание на рост). Дыхательная цена синтеза биомассы зависит от ее состава, так как затраты на синтез белков и липидов примерно вдвое выше, чем на синтез углеводов или органических кислот. Поэтому эффективность роста клубней картофеля на 30% выше, чем листьев, содержащих на порядок меньше углеводов, но в 4 раза больше белков. Скорость дыхания растений и их органов коррелирует с относительной скоростью роста и снижается по мере затухания ростовых процессов. В зрелых растениях превалирует дыхание, связанное с поддержанием структурной целостности и функциональной активности клеток и тканей. Дыхательная цена поддержания варьирует в пределах от 0.02 до 0.04 г глюкозы/г сухой биомассы в сутки. Примерно 60% обусловлено затратами на обновление деградирующих компонентов биомассы (белков-ферментов, липидов, нуклеиновых кислот и др.), остальная часть связана с поддержанием ионных градиентов на мембранах и транспортом через мембраны метаболитов и ионов. По данным [56], от 7 до 55% дыхания зрелых листьев приходится на поддержание их донорной функции. Апопластная загрузка 1 г углерода, входящего в состав сахарозы, требует окисления в процессе дыхания количества глюкозы, содержащей 0.06 г углерода [57]. В ночное время зрелые листья Phaseolus vulgaris потребляли на апопластную загрузку флоэмы в среднем 30%, а листья Alocasia odora с симпластным типом загрузки только 10% от общего количества производимого дыханием АТФ [58]. При этом скорость образования АТФ в листьях фасоли была в 2 раза выше, чем у теневыносливой алоказии, и составляла в среднем 0.48 мкмоль АТФ/(м² с).

Существенная часть поставляемой дыханием энергии связана с поглощением и ассимиляцией азота, так как потребность растений в азоте в 4–7 раз выше, чем в других элементах. Теоретически дыхательная цена поглощения 1 моля ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ составляет порядка 0.43 моля О₂, а ${\text{NH}}_{4}^{ + }$ вдвое меньше [57]. По разным оценкам, поглощение 1 г нитрата азота эквивалентно выделению 2–3 г СО₂ и составляет около 40% всех дыхательных затрат корней [59]. Цена нетто-поглощения 1 моля ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ у медленно растущих видов растений в 1.5–4 раза выше, чем у быстрорастущих [60]. По мнению авторов, это может быть обусловлено разницей в затратах на поддержание градиента ионов на мембранах и активацией нефосфорилирующих дыхательных путей.

Вовлечение АП и других митохондриальных энергодиссипирующих систем увеличивает затраты на рост и поддержание структурной целостности и функциональной активности уже существующей биомассы [22, 61]. Высказано мнение, что АП относится скорее к дыханию поддержания, нежели роста [62–64]. Вместе с тем, существуют данные об участии АП в поддержании активного роста, особенно при стрессе. Активация АП при засолении коррелировала с повышенным уровнем амино- и органических кислот у устойчивого к засолению генотипа Medicago truncatula TN6.18 [41] и в кластерных корнях Hakea prostrate при дефиците фосфора – с усилением синтеза и процессов экссудации карбоксилатов [65–67]. Активация АП в условиях гипоксии способствовала значительному усилению генерации АТФ в корнях Arabidopsis thaliana [62]. По мнению G.C. Vanlerberghe c соавт. [34], вовлечение АП в нестабильных и стрессовых условиях обеспечивает повышение устойчивости растений и более быстрое восстановление их роста после прекращения стресса. Однако и в оптимальных для роста условиях присутствие АП способствовало поддержанию редокс-баланса в мЭТЦ и сдерживанию образования АФК [62, 69].

Таким образом, основные дыхательные траты связаны с самим ростом и процессами, поддерживающими рост. Энергодиссипирующие системы, к которым относится АП, снижают эффективность преобразования углерода в биомассу, но являются неотъемлемой частью дыхательного процесса в норме и при стрессе [34, 69]. На современном этапе развития науки генно-инженерные стратегии повышения продуктивности направлены на сокращение потерь углерода в дыхании на поддержание, включающие “замедление ненужного оборота белка”, изменения направленности метаболических процессов, подавление активности нефосфорилирующих путей, увеличение эффективности ионного транспорта [70].

Итак, достижения последних десятилетий существенно расширили представления о вовлеченности процесса дыхания в метаболизм и биоэнергетику растительной клетки, роли дыхания в росте, продуктивности и устойчивости растений. Развитие молекулярно-генетических методов, omics-технологий и подходов системной биологии открывает новые возможности для более глубокого изучения организации и регуляции дыхания, нефосфорилирующих (энергетически малоэффективных) дыхательных путей, их значения для онтогенетического развития и формирования адаптивных реакций. Сбор и анализ информации о дыхании и эффективности дыхательных затрат дополнит характеристику свойств различных фенотипов, позволит раскрыть причины физиологической пластичности и проявления широкого спектра фенотипических модификаций у отдельных видов, генотипов и функциональных групп растений, оценить перспективы их использования в селекции и биотехнологии. Важное место должны занять исследования дыхания на экосистемном уровне в связи с биогенным круговоротом углерода и азота, возможным увеличением тепловой диссипации энергии в условиях повышения температуры среды и аридизации климата. Это будет способствовать пониманию глобального значения дыхания (от участия в сигналинге растительной клетки до функционирования экосистем), создаст базу для оптимизации дыхательных затрат, их соответствия потребностям растений в энергии и метаболитах, повышения продуктивности и устойчивости агро- и экосистем в условиях нестабильности климата.

Работа выполнена в рамках темы госбюджетных научных исследований “Фотосинтез, дыхание и биоэнергетика растений и фототрофных организмов (физиолого-биохимические, молекулярно-генетические и экологические аспекты)” (рег. № 122040600021-4).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.