Физиология растений, 2023, T. 70, № 5, стр. 461-471

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что повышению защитных свойств растений по отношению к неблагоприятным факторам внешней среды способствует умеренное увеличение концентрации эндогенных АФК в растительной ткани, которые являются сигнальными молекулами для запуска ряда защитных механизмов. В нестрессовых условиях АФК образуются в клетке на низких уровнях в результате утечки электронов во время фотосинтеза, дыхания и фотодыхания [1]. В ответ на эндогенные сигналы (гормоны и сигнальные молекулы), а также стимулы окружающей среды (биотические или абиотические стрессы) индуцируется несколько ферментов, продуцирующих АФК, таких как: NAD(P)H-оксидазы, аминоксидазы, полиаминоксидазы, оксалатоксидазы и большое семейство пероксидаз класса III [2, 3]. Считается, что в клетках растений среди ферментов, продуцирующих АФК, основное участие принимают NAD(P)H-оксидазы [4, 5]. В растительных клетках большая часть вырабатываемых АФК происходит из хлоропластов или пероксисом, но в незеленых тканях или в темноте продукция АФК в митохондриях становится преобладающей [6, 7]. Митохондрии являются одной из главных мишеней окислительного повреждения при стрессе [8], с другой стороны, они остаются одним из наиболее важных источников АФК [9, 10]. В изолированных митохондриях клеток растений и животных основными сайтами генерации АФК являются комплексы I и III дыхательной цепи [11].

При энергозапасающем окислении NADH митохондриями функционирует комплекс I дыхательной цепи, который является одной из точек генерации мембранного потенциала. У большинства организмов его работа ингибируется ротеноном. Часть организмов, в том числе растения, грибы и некоторые микроорганизмы, имеют дыхание, не чувствительное к ротенону. NADH или NADPH при этом окисляется несколькими ферментами, локализованными на наружной или на внутренней стороне внутренней митохондриальной мембраны. У Arabidopsis thaliana найдены три группы генов, кодирующих такие NAD(P)H-дегидрогеназы второго типа (NDII): NDA (два гена), NDB (четыре гена), и NDC (один ген) [12]. Установлена локализация данных ферментов: NDB1–NDB4 являются внешними (расположены на наружной стороне внутренней мембраны митохондрий), а NDA1–NDA2 и NDC1 – внутренними (обращены к митохондриальному матриксу) [13]. Точные физиологические функции конкретных белков семейства NDII не определены. Наиболее распространенной точкой зрения является их вовлеченность (вместе с альтернативной оксидазой – AOX) в формирование нефосфорилирующей дыхательной цепи (или нефосфорилирующего пути, НФП) при окислительном стрессе и метаболическом дисбалансе [14]. С этими представлениями согласуются и наши данные о том, что в прорастающих семенах сохраняется способность митохондрий к окислению экзогенного NADH при действии отрицательной температуры, и именно окисление внешнего NADH, главным образом, обеспечивает энергетический метаболизм при низких температурах у растений [15]. Однако в вопросе о связи активности NDII и уровня генерации АФК много неясного. Поскольку альтернативные NAD(P)H дегидрогеназы растений содержат в качестве кофактора ФАД, исследователи не исключают, что они могут быть потенциальными сайтами генерации АФК у растений [9].

Перекликающиеся с этим данные были получены нами: митохондриальный мембранный потенциал и уровень генерации АФК существенно подавлялись добавлением к клеткам Saccharomyces cerevisiae DPI (дифенилениодониум, ингибитор внешних и внутренних NADH-дегидрогеназ), а также у дрожжей с делецией гена NDE1, кодирующего наружную NAD(P)H-дегидрогеназу. Следовательно, NAD(P)H-дегидрогеназы – это важный источник АФК [16]. С помощью изолированных митохондрий S. cerevisiae показано, что внешние NADH-дегидрогеназы являются основными источниками генерации АФК при использовании NADH в качестве субстрата [17]. Аналогичная ситуация наблюдалась в клетках гриба Neurospora crassa. Делеция генов NDE1 и NDE2, кодирующих внешние альтернативные NADH-дегидрогеназы, снижала продукцию АФК при обработке прооксидантом паракватом [18]. Таким образом, несмотря на то, что существует много аргументов за то, что ферменты NDII участвуют в снижении генерации АФК, активность этих дегидрогеназ служит в ряде случаев источником АФК.

У растений полностью блокировать синтез всех NDII не удается, поскольку при этом невозможно получить жизнеспособные семена [19], однако опубликовано несколько работ по растениям A. thaliana со сниженной экспрессией отдельных генов NDII. Исследователи [20, 21] изучали, как подавление экспрессии генов NDA1, NDA2, а также NDB1, кодирующих альтернативные внутренние и внешние NAD(P)H дегидрогеназы A. thaliana, влияет на рост и метаболизм растений, а также на изменение экспрессии других генов. Показано, что снижение количества белков NDA1 и NDA2 приводит к замедлению роста и повышению уровня лактата. Увеличение интенсивности света активировало экспрессию гена альтернативной оксидазы (AOX1a), повышало активность AOХ и цитохром с оксидазы, а также уровень метаболитов цикла Кребса. Однако существенных фенотипических различий между мутантами и родительским типом не было выявлено [20]. Снижение количества белка NDB1 нарушало рост растений, но не влияло на дыхательную активность. В то же время, недостаток NDB1 значительно влиял на экспрессию генов, участвующих в белковом синтезе, а также в функционировании сигнальных систем растений [21]. К сожалению, уровень генерации АФК в этих экспериментах не определяли.

Существуют результаты, показывающие, что частичное подавление экспрессии гена NDB4, кодирующего внешнюю NADH-дегидрогеназу A. thaliana, приводило к снижению уровня генерации АФК. Авторы полагают, что данный эффект обуславливается повышением активности антиоксидантных ферментов и альтернативной оксидазы [19]. Долгое время неисследованным с использованием нокаут мутантов оставался белок NDB2. Между тем этот белок, возможно, имеет наибольшее отношение к устойчивости растений к стрессам. На такую возможность кроме физиологических исследований, о которых было написано выше, указывают эксперименты с растениями A. thaliana, у которых с помощью RNAi был уменьшен синтез NDB4. Такие растения, вероятно, вследствие компенсаторного эффекта, значительно увеличили синтез NDB2 и AOX, что привело к уменьшению образования АФК клетками, увеличению солеустойчивости, а также некоторым изменениям в скорости роста и фенотипе растений [19]. С использованием озимой пшеницы также было показано, что повышение способности AOX к транспорту электронов после действия на проростки закаливающей отрицательной температуры связано с сохранением высокой активности NDB2, которая, вероятно, играет важную роль в поддержании функционального состояния митохондрий в гетеротрофных тканях растений при действии отрицательных температур [22]. Наконец, в 2019 г. появилась работа Sweetman с соавт. [14], в которой был показан рост устойчивости A. thaliana к засухе при одновременной гиперэкспрессии AtAOX1а и AtNDB2, в то же время гиперэкспрессор одного гена NDB2 не демонстрировал фенотипических отличий от дикого типа и повышенной устойчивости к засухе.

Субоптимальные температуры для теплолюбивых растений являются более физиологичными, поскольку их воздействию растения в естественных условиях подвержены значительно более длительное время вегетации, чем действию более низких температур [23]. Субоптимальные температуры, в отличие от холодового стресса, замедляют, но не останавливают рост и метаболизм растений [23, 24]. При этом защитные механизмы, подготавливающие растения к воздействию более низких температур, активируются при субоптимальном температурном воздействии, в том числе у табака [25]. По нашим представлениям, повышенная активность NDB2 должна изменять в растениях потенциал на внутренней митохондральной мембране и уровень генерации АФК как при стрессе, так и в нормальных условиях. Изменение уровня АФК, в свою очередь может влиять на реакцию растений на температуру внешней среды. Таким образом, целью нашей работы было определение роли альтернативных путей транспорта электронов в дыхательной цепи митохондрий растений при неблагоприятных условиях. Задачей исследования являлась характеристика растений табака с гиперэкспрессией гетерологичного гена NDB2 A. thaliana в нормальных условиях выращивания и в условиях воздействия субоптимальной температуры.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве источника для клонирования нативного гена AtNDB2 использованы растения Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (экотип Columbia). В экспериментах по трансформации использована линия табака Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1. Выделение РНК и синтез кДНК выполняли с помощью наборов GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit и RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Литва). Для последующего клонирования амплифицировали с помощью ПЦР с использованием Pfu-полимеразы и синтетических олигонуклеотидов NDB2-F и NDB2-R (табл. 1 Дополнительные материалы) последовательность кДНК гена NDB2 A. thaliana, соответствующую транслируемой области мРНК.

При создании векторных конструкций использовали методики ПЦР, рестрикции и лигирования фрагментов ДНК, основанные на стандартных протоколах [26]. Векторная конструкция для трансформации растений получена на основе бинарного вектора pBI121 [27]. Предварительно в данный вектор были введены дополнительные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции BamHI и KpnI, что позволяло клонировать целевой ген между конститутивным промотором 35S РНК CaMV и терминатором нопалин-синтазы (NOS). Корректность сборки векторных конструкций подтверждали методом NGS-секвенирования на приборе Illumina MiSeq (Illumina, США), используя набор Nextera XT DNA (Illumina, США). Анализ данных NGS выполняли с помощью программ FastQC, Trimmomatic, SPAdes, UGENE, Vector NTI. Для введения гетерологичного гена AtNDB2 применяли Agrobacterium-опосредованную трансформацию листовых дисков 3–4-недельных растений табака, выращенных при температуре 24°С, освещенности 140 мкмоль/(м² с), 16/8 ч (свет/темнота) фотопериоде.

Для инициации процессов морфогенеза и отбора первичных трансформантов использовали питательные среды CIM, SIM и RIM [28] с селективным агентом канамицином в концентрации 50 мг/л. Выделение растительной ДНК выполняли с помощью набора Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Литва). Тотальную РНК выделяли с помощью набора реагентов GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Fisher Scientific, Литва) по методике изготовителя. Синтез кДНК на матрице РНК осуществляли с помощью набора реагентов First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Литва) по методике изготовителя. Анализ регенерантов производили методами ПЦР и ПЦР-РВ, используя синтетические олигонуклеотиды, представленные в таблице 1 Дополнительных материалов. ПЦР-РВ проводили на приборе CFX96™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США), используя набор реактивов qPCR mix-HS SYBR (Евроген, Россия), согласно инструкции производителя. Анализ данных ПЦР-РВ проводили с помощью программного обеспечения SFX Manager (Bio-Rad, Германия). В качестве референсных генов в количественной ПЦР использовали гены EF-1α и NTUBc2 [29]. В результате размножения и отбора на селективной среде получено продуктивное поколение регенерантов табака T4, не проявляющее расщепления в следующем поколении, выживающее на селективной среде с канамицином и демонстрирующее стабильную экспрессию гена NDB2 A. thaliana. Поколение Т5 выращивали в ростовых климатических камерах (Binder, Германия) при освещении 140 мкмоль/(м² с), фотопериоде 16/8 (день/ночь) и температуре 25/20°С, соответственно, с ежемесячным внесением комплексного минерального удобрения “Акварин для цветов” (ОАО “Буйский химический завод”) в концентрации 1 г/л до момента сбора семян. Типичная по своим свойствам линия 13s, несущая ген NDB2 A. thaliana, была выбрана в качестве экспериментальной для дальнейшего исследования. В качестве контроля использовали нетрансформированные растения табака.

Семена табака, полученные от растений дикого типа и растений линии 13s, стерилизовали в ламинарном боксе в 0.05% растворе Tween 20 (2 мин), 0.04% растворе гипохлорита натрия (4 мин) и 96% этаноле (5 с), периодически встряхивая и промывая после каждого стерилизующего раствора 5-6 раз в дистиллированной воде. После стерилизации семена раскладывали в чашки Петри на агаризованную питательную среду, содержавшую ½ солей по Murashige и Skoog [30] с добавлением 360 мг/л сахарозы, 0.6 мг/л тиамина, 0.3 мг/л пиридоксина, 0.3 мг/л никотиновой кислоты, 0.6 мг/л инозита. После этого чашки Петри помещали в ростовые камеры МКТ-240 (Binder, Германия) при освещении 140 мкмоль/(м² с), фотопериоде 16/8 (день/ночь) и температуре 20^оС или 25^оС. Начиная с 8 сут растения фотографировали и производили подсчет суммарной площади листовых пластинок в программе ImageJ, для этого использовали фотографии растений на 8, 10, 14, 18 и 20 сут.

Оценку накопления белкового продукта гена-гиперэкспрессора NDB2 проводили с помощью электрофореза и Western blot в системе Bio-Rad. Для выделения общего белка использовали 0.5 г листьев 2-месячных растений. Листья замораживали в жидком азоте и растирали с кварцевым песком в 2.5 мл буфера, содержащего 100 мМ Трис‑HCl (pH 7.4), 0.1% ДДС, 12 мМ β‑меркаптоэтанол, 0.5 мМ фенилметилсульфонилфлюорид и 50 мг нерастворимого поливинилпирролидона. После центрифугирования (18 000 g, 10 мин) белок из супернатанта осаждали пятикратным объемом охлажденного до –20°C ацетона (8500 g, 10 мин). Полученный осадок растворяли в буфере для образца и определяли содержание белка в получившихся пробах с реактивом Брэдфорд (Bio-Rad, США). По 30 мкг белка из каждой пробы разделяли электрофоретически в 12% ПААГ в присутствии ДДС и переносили на нитроцеллюлозную мембрану в системе miniProtean III (Bio-Rad, США) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Для идентификации белка NDB2 использовали первичные антитела против NDB2 (PHY1403A, PhytoAB, США) и вторичные антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой (Sigma, США). Визуализацию антител проводили с использованием хромогенов BCIP (5-bromo-6-chloro-3-indolylphosphate-p-toluidine salt, Gerbu, Германия) и NBT (nitrotetrazolium blue chloride, AppliChem, Германия).

Оценку дыхательной активности и показателей окислительного стресса проводили на 21-дневных растениях, выращенных при 25°С, и 28-дневных растениях, выращенных при 20°С (рис. 1). Растения разного возраста использовали, чтобы уменьшить у опытных образцов разницу в размере суммарной площади листовых пластинок. Чтобы охарактеризовать дыхание, проводили измерение скорости поглощения кислорода измельченными листьями при 20°С или 25°С, соответственно температуре выращивания растений. Скорость поглощения кислорода определяли полярографически с использованием электрода Кларка и системы Oxytherm (Hansatech Instruments, Англия). Для измерения общей скорости поглощения кислорода клетками 50 мг листьев инфильтровали буфером Tris-HCl (100 мM, рН 7.5), далее листья измельчали лезвием на отрезки не более 1 мм шириной и помещали в ячейку объемом 1.4 мл, содержащую насыщенный кислородом буфер Tris-HCl (100 мM, рН 7.5). Сначала измеряли скорость поглощения кислорода без ингибиторов. Для оценки скорости цианид-устойчивого дыхания, связанного с активностью альтернативной оксидазы, в ячейку последовательно добавляли KCN (ингибитор цитохром с-оксидазы митохондрий) до конечной концентрации 1.2 мМ и бензгидроксамовую кислоту (БГК, ингибитор альтернативной оксидазы митохондрий) до конечной концентрации 6 мМ. Оптимальную концентрацию ингибиторов подбирали титрованием с возрастающей концентрацией до такой, после которой дальнейшее увеличение концентрации уже не влияет на скорость поглощения О₂. Дыхание после добавления этих ингибиторов считали остаточным (немитохондриальным). Концентрацию ингибиторов и длительность инкубации подбирали в предварительном эксперименте. Скорость дыхания рассчитывали относительно сырого веса листьев и выражали в нмоль поглощенного О₂/(мин г сырой массы).

Рис. 1.

Трансформированные растения табака и растения дикого типа через 21 сутки после начала роста на агаризованной питательной среде. 13s – трансформант с повышенной экспрессией гена NDB2 A. thaliana; К – дикий тип; 20 – выращивание при 20°С; 25 – выращивание при 25°С. Диаметр чашки Петри равен 10 см.

Скорость поглощения кислорода растительным материалом в буферном растворе, не содержащем ингибиторов, была принята за общее дыхание (V_общ); в буферном растворе, содержащем KCN – за цианид-резистентное или альтернативное дыхание (V_альт); в буферном растворе, содержащем KCN и БГК – за остаточное дыхание (V_ост). Кроме того, вычисляли скорость поглощения кислорода в процентах от общего дыхания.

Процент цитохромного пути дыхания (%ЦП) рассчитывали по формуле:

Процент альтернативного пути дыхания (%АП) рассчитывали по формуле:

Процент остаточного дыхания (%ОД) рассчитывали по формуле:

Для выявления развития окислительного стресса в листьях растений оценивали уровень генерации супероксидного аниона. Для этого использовали метод окрашивания с помощью NBT (AppliChem, Германия), основанный на образовании в присутствии супероксидного аниона формазана с последующей экстракцией и определением его содержания колориметрически на приборе SmartSpec Plus (BioRad, США) [31]. Итоговое значение содержания формазана было получено с поправкой на сырую массу образца.

Каждое измерение проводили не менее чем в трех биологических повторностях. Для статистической обработки данных использовали программы Statistica и SigmaРlot. Вычисляли среднее значение и доверительный интервал (Р = 0.05). Статистическую значимость различий оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни при Р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для получения трансгенных растений табака транслируемую последовательность кДНК гена NDB2 (AT4G05020) A. thaliana размером 1749 п.н. клонировали по сайтам рестрикции BamHI и KpnI в составе бинарной плазмиды pBI121, в которую предварительно был введен сайт узнавания KpnI. Для повышения эффективности экспрессии целевого гена важно наличие нуклеотида A в положении –3 и нуклеотида G в положении +4 [32]. Для соответствия этим критериям проведена модификация 5′-концевого участка последовательности нативного гена AtNDB2 – добавлена последовательность Козак AACA перед стартовым кодоном. Также после стартового кодона был добавлен кодон GGT, кодирующий стабилизирующую аминокислоту валин. Стоп-кодон TGA был заменен на более предпочтительный для растений TAA. Созданный вектор получил название pBI121_NDB2 (рис. 2). С помощью секвенирования было показано полное соответствие целевой нуклеотидной последовательности векторной конструкции и референсной последовательности гена A. thaliana и отсутствие замен нуклеотидов в ней.

Рис. 2.

Схема векторной конструкции pBI121_NDB2: R-border, L-border – правый и левый концевые повторы области Т-ДНК; NOS-pro – промотор нопалин-синтазы; nptII – селективный ген неомицинфосфотрансферазы II типа, определяющей устойчивость к канамицину; NOS-ter – терминатор нопалин-синтазы; 35S CaMV – промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; NDB2 – ген “внешней” нефосфорилирующей НАД-Н дегидрогеназы; BamH-I, KpnI – сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции.

В результате эксперимента по агробактериальной трансформации растений табака вектором pBI121_NDB2 из каллусной культуры было получено 57 регенерантов. При достижении размера 2-3 см регенеранты срезали с каллуса и переносили на среды с селектирующим агентом для укоренения. В процессе культивирования 28 регенерантов (49.1% от общего количества полученных регенерантов) образовывали корни и развивались на средах с селективным агентом канамицином.

Для подтверждения интеграции в геном трансформированных растений табака последовательности целевого гена под контролем промотора 35S РНК CaMV провели ПЦР-анализ с олигонуклеотидами 35SEF и Ndb2gR (Дополнительные материалы, табл. 1 ). Амплификация фрагмента размером около 1300 п.н. подтвердила наличие анализируемой вставки ДНК в геном трансгенных растений табака (рис. 3).

Рис. 3.

Электрофореграмма ПЦР-продукта, выявленного при амплификации ДНК регенерантов табака со вставкой гена NDB2 A. thaliana. М – маркер молекулярного веса GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific); К– – нетрансформированные растения табака; 1 – плазмида pBI121_NDB2; 2 – 8 – анализируемые трансгенные линии.

Экспрессию целевого гена в трансформированных растениях исследовали как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Анализ с помощью ПЦР-РВ экспрессии гетерологичного гена NDB2 A. thaliana в трансформированных T4-растениях табака типичной линии 13s показал высокий уровень экспрессии трансгена – примерно в 34 раза (log₂ = 5.1) выше экспрессии собственного гена NDB2 табака (рис. 4а).

Рис. 4.

Содержание мРНК гена NDB2 A. thaliana и белка NDB2 в листьях табака. (а) – сравнительный анализ количества мРНК гена NDB2 арабидопсиса в трансгенных растениях табака линии 13s. 1 – контрольные растения, 2 – трансгенные растения. Приведены средние значения и стандартные отклонения (n = 14); (б) – содержание NDB2 в листьях табака по результатам Western blot. 13s – трансформант с повышенной экспрессией гена NDB2 A. thaliana; Дт – дикий тип. Справа приведены значения молекулярных масс маркерных белков.

Согласно данным Western blot, в общих белковых экстрактах из листьев табака собственный белок NDB2 в контрольных и трансгенных растениях не детектировался, выявлялся только продукт введенного гена арабидопсиса в трансформированных растениях (рис. 4б). Эти данные подтверждают, что в полученных трансгенных растениях экспрессия гетерологичного гена существенно выше экспрессии собственного гена NDB2 табака.

Сравнительная оценка скорости роста показала, что, судя по изменению площади листовой пластинки, трансформированные растения уступают в темпах роста растениям дикого типа при выращивании при 20°С на 14, 18 и 21 сут и при выращивании при 25°С на 21 сут (рис. 5). На скорость роста также влияла температура выращивания: начиная с 14 сут у выращенных при 20°С растений площадь листовой пластинки была меньше, чем у растений, выращенных при 25°С. Такой эффект наблюдался как у растений дикого типа, так и у линии 13s.

Рис. 5.

Изменение площади листовой пластинки у растений табака дикого типа и трансформантов на разные сутки от начала выращивания. 1, 3 – дикий тип; 2, 4 – трансформант с повышенной экспрессией гена NDB2 A. thaliana; 1, 2 – выращивание при 25°С; 3, 4 – выращивание при 20°С. Площадь листьев (мм²) измеряли с помощью программы ImageJ. Приведены средние значения и доверительные интервалы (P < < 0.05, n = 3). * – различия статистически значимы при P < 0.05. Статистическую значимость различий оценивали с помощью U-критерия Манна–Уитни в программе Statistica.

Оценка скорости поглощения кислорода показала некоторые различия в скорости дыхания между опытными растениями (рис. 6). Значимые различия были выявлены в скорости альтернативного дыхания (V_альт) между растениями дикого типа и трансформантами, выращенными при 20°С (рис. 6а), при этом V_альт оказалась выше у растений линии 13s. Скорость общего дыхания у 13s растений была достоверно выше при выращивании при 20°С (рис. 6а). Значимых различий не обнаружено в скорости дыхания в отсутствие ингибиторов и в скорости цитохромного и остаточного дыхания и вкладов цитохромного и альтернативного дыхания (рис. 6б).

Рис. 6.

Влияние температуры выращивания на дыхательную активность листьев табака. (а) – скорость дыхания, выраженная в нмоль поглощения кислорода. Показана величина поглощения О₂ в ходе общего (1), альтернативного (2) или остаточного дыхания (3). *, ** – различия статистически значимы при P < 0.05 (р = 0.004 и р = 0.024 соответственно; использован U-критерий Манна–Уитни); (б) – скорость дыхания, выраженная в процентах от общего поглощения кислорода в ходе активности цитохромного (1), альтернативного пути дыхания (2) или остаточного дыхания (3). 13s – трансформант с повышенной экспрессией гена NDB2 A. thaliana; Дт – дикий тип; 20 – выращивание при 20°С в течение 28 сут; 25 – выращивание при 25°С в течение 21 сут. Измерение скорости поглощения кислорода проводили в полярографической ячейке при температуре 20^оС или 25^оС, соответственно. Приведены средние значения, ошибки представлены доверительным интервалом, n = 18–25.

Между растениями дикого типа и трансформантами не обнаружено различий в уровне генерации супероксидного аниона в листьях (рис. 7). Также оно было одинаковым у трансформированных растений, выращенных при разной температуре. Однако, по сравнению с растениями, выращенными при 25°С, у растений дикого типа, выращенных при 20°С, уровень генерации супероксидного аниона оказался выше, что свидетельствует о развитии окислительного стресса.

Рис. 7.

Влияние температуры выращивания на уровень генерации супероксидного аниона в листьях табака. 1 – дикий тип; 2 – трансформант с повышенной экспрессией гена NDB2 A. thaliana; 20 – выращивание при 20°С в течение 28 сут; 25 – выращивание при 25°С в течение 21 сут. Приведены средние значения, ошибки представлены доверительным интервалом, n = 3–5. * – различия статистически значимы при Р < 0.05 (использован U-критерий Манна–Уитни).

ОБСУЖДЕНИЕ

В результате агробактериальной трансформации были получены трансгенные растения табака с повышенной экспрессией гетерологичного гена NDB2 A. thaliana, характеризующиеся как высоким содержанием транскрипта, так и белкового продукта целевого гена, чего, согласно литературным данным, не всегда удается добиться [33]. Базовый уровень экспрессии собственного гена NDB2 табака был низкий, вследствие чего белковый продукт этого гена в экстрактах листьев не детектировался, в отличие от продукта трансгена (рис. 4).

Наблюдались фенотипические различия между трансформированными и контрольными растениями, выражающиеся в различной скорости роста (рис. 5): у растений табака с гиперэкспрессией NDB2 A. thaliana скорость роста была ниже, чем у нетрансформированных растений. Особенно ярко такие различия проявились при выращивании растений в условиях субоптимальной температуры 20°С. Трансформанты отставали в скорости роста в нормальных условиях на 21 сут, а при 20°С – начиная с 14 сут (рис. 5). Наблюдаемое торможение ростовых процессов в растениях табака при действии субоптимальной температуры − один из характерных признаков стрессовой реакции и, скорее всего, относится к адаптивной реакции в ответ на снижение температуры. В пользу такого предположения свидетельствуют данные Yang с соавт. [25] показавших, что у растений табака в результате длительного воздействия субоптимальной температуры повышается содержание растворимых клеточных белков и снижается степень повреждения клеточных мембран, возможно, вследствие снижения уровня АФК. Все эти эффекты наблюдались на поздних этапах вегетации (стадия развития 12 листа) и приводили к замедлению увядания растений и продлению вегетативной фазы развития.

В наших экспериментах, проводившихся на ранних этапах развития растений, наоборот, активные ростовые процессы сопровождались повышенным уровнем генерации супероксидного аниона в нетрансформированных растениях при действии субоптимальной температуры 20°С (рис. 7), что свидетельствует о развитии внутриклеточного окислительного стресса. В случае трансгенных растений табака достоверных различий в содержании формазана не обнаружено (рис. 7).

Такие различия в реакции на стрессовое воздействие пониженной температурой могут определяться повышенной экспрессией трансгена. Считается, что экспрессия генов NDB и AOX (альтернативной оксидазы) растений взаимосвязаны. Уровень экспрессии AOX1a у A. thaliana определяет уровень экспрессии гена AtNDB2 в контроле и в условиях повышенного УФ облучения [34]. Экспрессия этих генов происходит синхронно в ответ на различные абиотические стрессы, что предполагает совместную регуляцию общими промоторными элементами [19, 35, 36]. В связи с этим не удивительно, что в трансгенных растениях табака N. sylvestris с гиперэкспрессией гена StNDB1 картофеля (Solanum tuberosum L.) наблюдалось повышение активности собственной AOX [37]. Схожий эффект наблюдался ранее в ряде аналогичных трансгенных линий в работе Sweetman с соавт. [14].

Координированная экспрессия генов NDB2 и AOX и совместная работа кодируемых ими белков обеспечивает формирование полноценного функционального нефосфорилирующего пути транспорта электронов [14]. Вероятно, в полученных нами трансгенных растениях табака также вследствие повышенной экспрессии NDB2 A. thaliana наблюдается активация дыхания через НФП (NDB2 – Q/QH2 – AOX), поскольку скорость альтернативного дыхания у трансформантов, выращенных при 20^оС, оказалась достоверно выше, чем у растений дикого типа, выращенных при такой же температуре (рис. 6а). Вероятно это повышение скорости альтернативного дыхания и определяет сниженный уровень АФК в трансгенных растениях.

В наших экспериментах даже воздействие субоптимальной температурой на растения приводит к выраженному росту скорости общего дыхания у трансгенных растений (рис. 6а), что лишний раз подтверждает защитную функцию НФП при охлаждении − предотвращение перевосстановления пула убихинола и образования избытка АФК в митохондриальной ЭТЦ и рассеяние энергии дыхания в виде тепла [38].

Как следствие, фенотипические различия скорости роста трансгенных и нетрансформированных растений могут быть также следствием разобщения дыхания и активизации НФП в результате снижения энергетической эффективности дыхания, которое в некоторых условиях приводит к снижению скорости роста и продуктивности [14, 39]. Другим возможным объяснением низкой скорости роста в сочетании с повышенной скоростью дыхания у трансгенных растений может быть перенаправление энергетического вклада дыхания на другие нужды, помимо роста. Например, показано, что благодаря активности AOX рост суспензионной культуры клеток табака может настраиваться на снижение доступности азота и фосфора в среде культивирования, при этом сокращается вклад потребляемого сахара в прирост культуры [40]. В таком случае зависимость скорости роста трансгенных растений от повышения активности AtNDB2 (и, возможно, от активности AOX) представляется специфической настройкой, призванной оптимизировать соотношение дыхания, ростовых и адаптационных затрат.

Таким образом, нами получены трансгенные растения табака с измененной экспрессией гена, кодирующего один из ключевых компонентов альтернативного пути переноса электронов в митохондриях – AtNDB2, характеризующиеся более низкой по сравнению с растениями дикого типа скоростью роста, снижающейся еще больше при действии субоптимальной температуры. Замедление роста, а также наблюдаемое у трансгенных растений в отличие от контрольных снижение уровня генерации супероксидного аниона сопровождаются усилением общего и альтернативного дыхания. Разобщение дыхания и активизация НФП, вероятно, снижают энергетическую эффективность дыхания и, как следствие определяют наблюдаемые фенотипические различия в скорости роста трансгенных и нетрансформированных растений. Полученные растения с повышенной экспрессией гена AtNDB2, кодирующего внешнюю NADH дегидрогеназу A. thaliana, являются интересной моделью для изучения температурных настроек и стрессовых реакций растений.

Авторы выражают благодарность анонимным рецензентам. Авторы выражают благодарность О.И. Грабельных и Е.А. Поляковой за помощь и ценные рекомендации при исследовании дыхательной активности. Для выполнения работы было использовано оборудование Центра коллективного пользования “Биоаналитика” СИФИБР СО РАН.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-24-00097, https:// rscf.ru/project/23-24-00097/.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая работа не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследования.