Физиология растений, 2023, T. 70, № 6, стр. 601-611

ВВЕДЕНИЕ

Каротиноиды (пигменты различных оттенков желтого, оранжевого и красного) образуются de novo у фото- и хемосинтезирующих организмов: у некоторых видов бактерий, архей и грибов, а также у водорослей и растений; остальные организмы (включая животных и человека) каротиноиды не синтезируют, но потребляют с пищей и метаболизируют [1]. Для фотосинтезирующих организмов данные пигменты крайне важны как незаменимые участники фотосинтеза и фотозащиты. Каротиноиды собирают энергию света и осуществляют синглет-синглетную передачу энергии электронного возбуждения хлорофиллам. Одновременно они поглощают избыточную энергию хлорофиллов, защищая организм от неблагоприятного воздействия света высокой интенсивности. Нефотохимическое тушение происходит при ферментативном преобразовании производных α- и β-каротинов, ксантофиллов (виолаксантин, антераксантин и эпоксид лютеина), в деэпоксидные ксантофиллы (зеаксантин и лютеин). Кроме того, образующиеся в процессе фотосинтеза активные формы кислорода нейтрализуются каротиноидами как антиоксидантами за счет физических и/или химических реакций [1, 2].

У растений блокировка синтеза каротиноидов приводит к нарушениям в работе фотосинтетического аппарата и защите от фотоингибирующего и оксидативного стрессов [3]. Более того, это отменяет образование α- и β-каротинов – основных источников фитогормонов стриголактонов и абсцизовой кислоты (АБК), необходимых для регуляции различных аспектов роста, развития и стрессовой реакции организма [4, 5], равно как и витамина А в рационе человека и животных [6].

С учетом вышесказанного, нарушение синтеза каротиноидов может иметь критические последствия вплоть до гибели растения. К примеру, на этом основано действие хлорсодержащих отбеливающих гербицидов (таких как норфлуразон), которые приводят растение к гибели, ингибируя биосинтез каротиноидов [2, 7]. Гербицид действует на стадии первой десатурации, когда начинается преобразование предшественника каротиноидов (15-цис-фитоин) в окрашенный хромофор 9,15,9'-три-цис-ζ-каротина под действием фитоиндесатуразы (PDS; EC 1.3.5.5). Фермент катализирует симметричное введение первых двух из четырех двойных связей, необходимых для образования полностью транс-ликопина [2, 7]. Молекулы PDS собираются в каталитически активные гомотетрамеры, образующие гидрофобный туннель, который связывает 15-цис-фитоин (высоко гидрофобный субстрат) и пластохинон (косубстрат). Механизм действия гербицида связан с эффективностью его конкуренции с пластохиноном за сайт связывания в туннеле PDS-тетрамера [2]. Исследование PDS выявило несколько сайтов, мутации в которых препятствуют взаимодействию с карбонилом норфлуразона; введение таких мутаций обеспечивает устойчивость растения к хлорсодержащим гербицидам с сохранением биосинтеза каротиноидов [2].

Критичность корректной работы PDS продемонстрирована и для запасающих органов растения. Так, снижение уровня транскриптов PDS в плодах томата не только сокращает количество каротиноидов, но также приводит к падению экспрессии ключевого для созревания MADS-box гена RIPENING INHIBITOR (RIN) и генов, являющихся мишенями фактора транскрипции (ТФ) RIN [8]. Это может быть следствием прямого взаимодействия белков PDS и RIN, либо, под влиянием дефицита каротиноидов, роста синтеза других метаболитов (например, АБК) и белков, которые подавляют транскрипцию RIN [8]. В свою очередь, сверхэкспрессия RIN в растениях томата с мутацией rin приводит к повышению экспрессии PDS и накоплению каротиноидов [9]. Отметим, что среди подтвержденных мишеней ТФ RIN находятся многие гены каротиногенеза (Phytoene synthase PSY1, 15-cis-zeta-carotene-isomerase Z-ISO, Lycopene beta-cyclase LCY-b, Zeta-carotene desaturase ZDS, Carotenoid isomerase CrtISO) [10, 11].

То, что ингибирование активности PDS приводит к “отбеливанию” в норме зеленой фотосинтезирующей ткани, позволило исследователям использовать PDS как репортерный ген для оценки эффективности CRISPR-Cas9-редактирования генома растений [12, 13], а также для тестирования системы вирус-индуцированного подавления генов (VIGS) [14]. Транзиентное VIGS-замалчивание гена PDS с целью обесцвечивания хлорофилл-содержащих тканей существенно облегчает визуализацию флуоресценции слитых с GFP белков в листьях растений и представляет собой альтернативу конфокальной лазерной сканирующей микроскопии [15]. PDS-эффект используется не только для отработки различных методов, но и в целях исследования различных аспектов развития и адаптации растения. Так, показано, что нарушение функции хлоропластов за счет подавления фитоиндесатуразы усиливает системное накопление переносимого тлей вируса в листьях Nicotiana benthamiana Domin [16].

В данном исследовании мы использовали систему CRISPR-Cas9 для выключения гена PDS в геноме Nicotiana tabacum L. с целью изучения защитного/адаптационного ответа растения путем изменения активности других генов пути каротиногенеза, а также MADS-box генов, кодирующих гомологи ТФ RIN. Нами были получены независимые трансгенные линии, химерные по нокауту PDS за счет однобуквенных вставок/делеций (со сбивкой рамки считывания) в экзоне II гена. Выключение гена приводило к нарушениям фенофаз и других морфологических характеристик растения, а также вызывало альбиносность листовой ткани, снижение содержания каротиноидов и хлорофиллов. У редактированных линий наблюдалось падение уровня экспрессии гена PDS и рост экспрессии других генов каротиногенеза (PSY2, ZISO, CRTISO, CrtB1, LCYE, NSY и VDE). Значительные изменения наблюдались в уровне экспрессии стресс-чувствительных генов, кодирующих MADS-доменные факторы транскрипции (N. tabacum AGL8, MADS23, SEP1, SEP2 и SEP3). Полученные результаты подчеркивают важную роль фермента PDS в метаболизме каротиноидов, фотосинтезе и фотозащите у табака, а также предполагают возможное опосредованное участие PDS в регуляции стресс-чувствительных MADS-box генов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. Объектом исследования стал табак N. tabacum L. сорт Samsun. Для получения стерильной культуры in vitro семена тепличных растений стерилизовали в парах хлора. Открытые микропробирки с семенами (~10–20 мг) помещали в стеклянный эксикатор над емкостью с 50–100 мл хлорсодержащего моющего средства (типа “Доместос”) с добавлением 2–3 мл концентрированной HCl. Эксикатор плотно закрывали крышкой и оставляли на 2 ч, после чего семена помещали на чашки Петри с агаризованной (0.7%) средой MS (Murashige and Skoog basal nutrient medium including vitamins; M5519, Sigma-Aldrich, США) с добавлением 10 г/л сахарозы (S9378; Sigma-Aldrich). Проростки переносили в 0.5 л пластиковые контейнеры с той же средой и выращивали in vitro в климатической камере в условиях длинного фотопериода (16 ч день/8 ч ночь, 21°C) в течение 3–4 недель до фазы 5–7 листа.

Конструкция для CRISPR-Cas9 редактирования. С целью выявления наиболее консервативных участков гена PDS (N. tabacum NCBI Gene ID LOC107816873) кДНК гена сравнивали с гомологичными последовательностями видов табака (N. attenuata LOC109223965; N. tomentosiformis LOC104107035; N. sylvestris LOC104248773; N. benthamiana LC543533.1) и Cyanobacteria bacterium J055 (RFHR01000124.1). Область 5'-конца гена, включавшую два первых экзона NtPDS (360 нуклеотидов от ATG-кодона), использовали для подбора направляющей (guid; g) РНК с помощью web-программ CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) и CRISPR MultiTargeter (http://www.multicrispr.net/basic_input.html).

Конструкцию (для CRISPR/Cas9-введения случайных мутаций в кодирующую последовательность NtPDS, соответствующую выбранной gРНК) собирали на основе бинарного вектора p201N_Cas9 (AddGene, Watertown, MA, США; кат. № 59175; https://www.addgene.org/) в соответствии с протоколом (https://media.addgene.org/data/plasmids/47/ 47024/47024-attachment_rNUYUYROwjgZ.pdf) [17]. Т-область вектора включала ген Cas9 (под двойным промотором CaMV35S), ген NPTII (устойчивость к канамицину; для селекции трансгенных растений) и сайт I-PpoI для клонирования кассеты экспрессии gРНК (управляемой промотором U6.6 Medicago truncatula), предварительно собранной в челночном векторе pUC_gРНК (AddGene Кат. № 47024) [17]. Корректность сборки плазмиды p201N-NtPDS-gRNA проверяли методами ПЦР и рестрикции согласно [17] и использовали для трансформации штамма Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Агробактерию, содержащую пустой вектор p201N, применяли для трансформации растений в качестве контроля.

Трансформация растений табака. Для трансформации использовали экспланты культуры in vitro табака (нарезанные секторами (~0.5 × 0.5 см) пластины верхних листьев с предварительно удаленными жилками).

Суспензию агробактерии для инфицирования эксплантов получали из свежей культуры агробактерии, выращенной в течение ночи (+28°С, 150 rpm) в 5 мл жидкой среды LB, содержащей рифампицин (Rif, 12.5–25.0 мг/л) и канамицин (Km, 100 мг/л). Культуру центрифугировали (1500 g, 10 мин), осадок суспендировали в 20 мл жидкой среды А2 (MS, 3% сахароза; pH 5.5) в стерильной чашке Петри, где замачивали экспланты (40 мин в темноте; верхней поверхностью листа вверх) в суспензии агробактерии (p201N – контроль; содержащие плазмиду p201N-NtPDS-gRNA – опыт). Инфицированные экспланты просушивали с помощью фильтровальной бумаги, выкладывали верхней стороной листа вниз на чашки Петри с агаризованной (0.7%) средой А2 и выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 2 сут. Далее экспланты отмывали от агробактерии (15 мин в жидкой А2 среде, содержащей карбенициллин (Cb) 500 мг/л), просушивали на фильтровальной бумаге и помещали на чашки с агаризованной (0.7%) средой А3 (MS, 2% глюкоза, 0.1 мг/л NAA (1-Naphthaleneacetic acid), 1 мг/л BAP (6-Benzylaminopurine), Km 100 мг/л и Cb 500 мг/л). Раз в две недели экспланты перекладывали на свежую среду А3. Образующиеся побеги срезали с каллуса, укореняли на среде А3 без BAP, адаптировали к грунту и тепличным условиям.

Анализ целевого участка гена NtPDS. Геномную ДНК экстрагировали из целого листа каждой трансгенной линии Т₀ с использованием набора ZR-96 Plant/Seed DNA Kit (Zymo Research, США). Область 178 п. н. гена NtPDS, содержащую целевой сайт gРНК, амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров PDS2exF и PDS3exR (табл. 1) при следующих условиях: начальная денатурация 5 мин при 95°С, 35 циклов (30 с при 95°С, 30 с при 59°С, 1 мин при 72°С), 10 мин при 72°С. Продукты ПЦР ожидаемого размера выделяли из агарозного геля с помощью набора QIA-EX® II Gel Extraction Kit (QIAGEN, Германия), клонировали в вектор pGEM®-T Easy (pGEM®-T Easy Vector System I, Promega, США) и секвенировали на секвенаторе ДНК ABI Prism 377 (Applied Biosystems, США). Полученные последовательности ДНК анализировали на возможные полиморфизмы с помощью программы MEGA 7.0 (https://www.megasoftware.net/).

Анализ экспрессии генов. Для анализа использовали ткань верхушечных листьев побега, достигшего фазы развития 8–10 листьев. Из ткани листа (~0.2–0.5 г), предварительно измельченной растиранием в ступке в жидком азоте, выделяли суммарную РНК с помощью набора RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Германия). Удалив возможные примеси геномной ДНК (RNase-free DNase set, QIAGEN, Германия), препарат анализировали на качество (электрофорез в 1.5% агарозном геле) и использовали для синтеза (с праймером oligo-dT) первой цепи кДНК (GoScript Reverse Transcription System, Promega, США). Концентрации РНК и кДНК измеряли флуориметрически (Qubit® Fluorometer, Thermo Fisher Scientific).

Количественную ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) проводили в двух биологических и трех технических повторах на приборе CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, США) с использованием 3.0 нг кДНК, ген-специфических праймеров (табл. 1) и смеси SYBR Green RT-PCR (Синтол, Россия) при следующих условиях: исходная денатурация 5 мин при 95°С, далее 40 циклов (15 с при 95°С; 40 с при 60°С). Полученные данные нормализовали по экспрессии референсного гена Nicotiana tabacum Actin-7 (LOC107831145) [18].

Анализ содержания каротиноидов, хлорофиллов и антоцианов. В ткани листа трансгенных/редактированных и контрольных растений измеряли количество (мг/г сырого веса) хлорофиллов (a и b), каротиноидов (сумма) и антоцианов (сумма) согласно [19]. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Eppendorf BioSpectrometer® basic (Eppendorf, Германия).

Структурный и статистический анализ. Для сопутствующего работе структурного анализа последовательностей ДНК и белка использовали программы NCBI-BLAST и NCBI-CDD (https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/) и MEGA 7.0 (https://www.megasoftware.net/). Статистическую обработку экспрессионных и биохимических данных проводили с помощью программы Graph Pad Prism v. 8 (https://www.graphpad.com, США). Результаты выражали как среднее значение ± стандартное отклонение (SD) на основе двух биологических и трех технических повторов. Для оценки различий применяли критерий Стьюдента; P < 0.01 считали показателем статистической значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Трансгенные линии табака N. tabacum с редактированным геном NtPDS. Для редактирования гена NtPDS в качестве gРНК была выбрана последовательность 5'-GAGATTGTTATTGCTGGTGCAGG-3' (в положении 334–356 п. н. от ATG-кодона, кДНК, конец экзона II). Была собрана плазмидная конструкция p201N-NtPDS-gRNA и введена в штамм A. tumefaciens LBA4404, который был использован для трансформации листовых эксплантов табака сорта Samsun.

В качестве контроля использовали нетрансгенные растения (WT) и растения, трансформированные пустым вектором (p201N). Каких-либо морфологических отличий от WT-контроля растения p201N не имели. В сравнении с WT, укоренившиеся на канамицине регенеранты Т₀NtPDS-gRNA имели измененную в разной степени окраску листа – от полностью белой (такие регенеранты гибли после образования корней и первых истинных листьев) до зеленой. Из полученных 27 жизнеспособных трансгенных (укоренившихся, канамицин-резистентных) линий 18 формировали зеленые листья, и девять – мозаично альбиносные (зеленые с белыми пятнами) (рис. 1). Цветки всех трансгенных линий не имели каких-либо заметных фенотипических отклонений.

Рис. 1.

Трансгенные растения табака N. tabacum с мозаично нокаутированным геном фитоиндесатуразы NtPDS (б, в, д) в сравнении с нетрансгенным контролем (а, г).

Полученные трансгенные растения NtPDS-gRNA формировали две группы, характеризующиеся заметной мозаичной альбиносностью листьев (I) и ее отсутствием (II). В свою очередь, каждая группа делилась на три подгруппы: рано цветущие (А) (2 и 4 линии, соответственно), поздно цветущие (Б) (4 и 1) и цветущие, как контроль (В) (3 и 10). Кроме того, трансгенные линии (I) и (II) отличались от нетрансгенного контроля нарушением ряда других морфологических параметров (табл. 2).

Так, в сравнении с WT, линии группы (I) формировали укороченный за счет сокращения междоузлий стебель и меньше цветков/коробочек (все три подгруппы А–В), а также меньше листьев (А и Б) и семян (Б и В). Подгруппа Б цвела раньше (в ~2 раза) и подгруппа В позже (в ~2.5 раза), чем WT (табл. 2).

Линии группы (II), несмотря на отсутствие визуально регистрируемой альбиносности листьев, характеризовались сходными с (I) изменениями в сравнении с WT, за исключением количества семян (вес семян на одну коробочку не отличался от контроля) (табл. 2).

Анализ целевого сайта NtPDS в геноме трансгенных линий (клонирование и секвенирование) обнаружил различные варианты мутаций (однонуклеотидные индели со сдвигом рамки считывания и замены (SNP)) в редактируемом участке гена. Было показано, что в группе (I) из 10 клонов каждой линии 10–20% содержат пять вариантов измененного аллеля NtPDS: SNPs 341t→c и 351t→c; индели t351→del(1nt)#, 350^351→ins^g# или 350^351→ins^t#. Анализ клонов, полученных для одного нежизнеспособного растения с почти полностью белыми листьями, показал вставку 350^351→ins^g# в 9 случаях из 10 секвенированных. В случае растений группы (II) среди 10 клонов каждой линии были обнаружены только варианты с SNPs (рис. 2, табл. 2).

Рис. 2.

Результаты секвенирования (сверху) и выравнивания (снизу) целевого сайта гена фитоиндесатуразы NtPDS с указанием обнаруженных полиморфизмов (замены и индели даны в соответствии с табл. 2).

Таким образом, однонуклеотидные индели со сдвигом рамки считывания легко детектировались у линий табака группы (I), которые формировали мозаично обесцвеченные листья. У растений группы (II) индели не обнаружены. Учитывая аналогичные группе (I) отличия растений группы (II) от контроля, данный факт может быть связан с существенно меньшим количеством редактированных клеток и секвенированием числа клонов, недостаточного для обнаружения мутаций.

Структурный анализ редактированной последовательности NtPDS показал, что все три инделя приводят к сбою рамки считывания. Образуются преждевременные стоп-кодоны и, как следствие, значительно укороченные и измененные на С-конце варианты белка: 154 (в случае 350^351→ins^g# и 350^351→ins^t#) и 144 (t351→del(1nt)#) аминокислотных (а. о.) остатка при корректном размере NtPDS 582 а. о. В случае инсерций первый преждевременный стоп-кодон образуется через 111 нуклеотидов после сбивки рамки считывания, и С-конец мутантного белка состоит из 37 некорректных а. о. остатков [CRSGWFVYSKISGRCWSQTAIAGGKRCPRWKGSCMER]. При делеции неправильный С-конец формируется из 27 а. о. [QVWVVCLQQNIWQMLVTNRYCWRQEMS].

Среди обнаруженных SNPs, один (t351→c) является синонимичным, тогда как второй (t341→c) приводит к нейтральному замещению V114→A в N-концевой области функционального домена PLN02612 (расположен на участке 21–578 а. о. белка NtPDS).

Содержание пигментов в линиях табака дикого типа и трансгенных/редактированных линиях. Воздействие инделей в последовательности гена фитоинсинтазы NtPDS на морфологию растений, включая пигментацию фотосинтезирующей ткани, предполагает нарушение биосинтеза каротиноидов. Для оценки такой возможности был проведен сравнительный анализ содержания каротиноидов (сумма), хлорофиллов (a и b) и антоцианов (сумма) в листьях табака дикого типа (WT) и двух трансгенных поздних линий L28 и L29 из группы (I). Кроме фенотипического проявления нокаута NtPDS, выбор линий основывался на значительном их отличии от контроля по времени инициации цветения: 346 (L28) и 461 (L29) день против 122 дней в случае WT.

В результате было показано, что в сравнении с контролем количество как каротиноидов, так и хлорофиллов в редактированных линиях уменьшилось в среднем в ~1.5 раза, тогда как содержание антоцианов не изменилось (табл. 3).

Экспрессия генов, связанных с биосинтезом каротиноидов, в листьях табака дикого типа и трансгенных/редактированных линий. Известно, что количество субстрата и/или продукта метаболических путей влияет на экспрессию соответствующих генов [8, 20]. С учетом химерности редактирования полученных линий L28 и L29 мы проверили, во-первых, уровень транскриптов полноразмерного гена NtPDS, и, во-вторых, как влияет изменение его экспрессии, а также содержания каротиноидов, на экспрессию генов NtPSY2, NtCrtISO, NtZDS, NtLCYB, NtCrtRB1 и NtVDE в листьях WT, L28 и L29.

Результаты показали, что в сравнении с WT уровень транскриптов NtPDS снизился в ~2.0 раза у линии L28 и поднялся в ~2.2 раза у L29, тогда как экспрессия NtCrtRB1 у обеих линий L28 и L29 не изменилась. Уровень транскриптов остальных анализируемых генов существенно вырос у линии L29: в ~1.7 (NtLCYB), ~4.0 (NtCrtISO), ~2.9 (NtPSY2), ~1.9 (NtZDS) и ~2.6 (NtVDE) раз. В то же время в листьях L28 он остался неизменным, за исключением NtPSY2, экспрессия которого увеличилась в ~1.7 раза (рис. 3).

Рис. 3.

Экспрессия структурных генов пути биосинтеза каротиноидов NtPDS, NtPSY2, NtCrtISO, NtZDS, NtLCYB, NtCrtR-B1 и NtVDE в листьях контрольного нетрансгенного растения (WT) и позднецветущих мозаично редактированных линий L28 и L29. * Р < 0.01 – статистически значимое различие от значений WT-контроля.

Таким образом, взаимосвязи между уровнями транскриптов NtPDS (суммарно нередактированного и редактированных), экспрессией нижестоящих генов каротиногенеза и содержанием каротиноидов в листе не наблюдалось.

Экспрессия регуляторных MADS-box генов в листьях табака дикого типа и трансгенных/редактированных линий. Из исследований томата Solanum lycopersicum L. известно, что промотор многих структурных генов каротиногенеза содержит сайт связывания с MADS-доменными белками. В тканях плода томата транскрипция этих генов находится под контролем ТФ RIN (подсемейство SEPALLATA (SEP) MADS-доменных белков), и уровень экспрессии гена RIN взаимосвязан с содержанием каротиноидов [8, 21]. В вегетативной ткани, кроме SEP, в ответ на стресс активируются гены и других MADS-доменных ТФ (к примеру, гомологи Arabidopsis thaliana AGAMOUS-LIKE 8 (AGL8) и ARABIDOPSIS NITRATE REGULATED 1 (ANR1)) [22, 23].

С учетом этих данных, мы провели оценку влияния изменений в каротиногенезе редактированных растений на экспрессию MADS-box генов NtSEP1, NtSEP2, NtSEP3 (представлены 3 клады подсемейства SEP), NtAGL8 и NtMADS23 (гомолог ANR1). В результате были обнаружены транскрипты NtSEP1 и NtAGL8, тогда как остальные анализируемые гены не экспрессировались в листе растений WT, L28 или L29. При этом уровень транскриптов NtSEP1 у L28 и L29 был более чем в 2 раза ниже, чем в контроле; NtAGL8 экспрессировался у WT, L28 и L29 приблизительно на одном уровне (рис. 4).

Рис. 4.

Экспрессия генов NtSEP1 и NtAGL8 (FUL1) в листьях контрольного нетрансгенного растения (WT) и позднецветущих мозаично редактированных линий L28 и L29. * Р < 0.01 – статистически значимое различие от значений WT-контроля.

ОБСУЖДЕНИЕ

Метаболизм каротиноидов регулируется в растении с помощью известного и хорошо охарактеризованного ферментативного механизма, в котором фитоиндесатураза PDS катализирует первую стадию модификации 15-цис-фитоина – предшественника всех каротиноидов [1, 24, 25]. Различные исследования показывают, что как подавление каталитической активности PDS, так и нокаут/замалчивание кодирующего его гена, критично для растения, поскольку приводит к нарушениям фотосинтеза, фотозащиты и гормонального баланса [2, 12–14]. Уровень экспрессии гена PDS напрямую связан с эффективностью каротиногенеза во всех тканях растения и количеством накапливаемых каротиноидов в запасающих органах [26].

В данном исследовании ген PDS был нокаутирован в геноме табака N. tabacum (сорт Samsun) с помощью CRISPR/Cas9-системы. Девять независимых трансгенных линий формировали листья со слабо пигментированными участками, мозаично локализованными на зеленом фоне (рис. 1б, д). Регенеранты с почти полным обесцвечиванием листьев (рис. 1в) были нежизнеспособными. Подобные изменения соответствовали ранее показанному фенотипу растений с отсутствием транскрипции гена PDS [14] или экспрессией нефункционального варианта белка PDS [12, 13].

Наблюдаемый паттерн пигментации наглядно свидетельствовал о мозаичности факта нокаутирования гена, что считается обычным при CRISPR/Cas9-редактировании с использованием агробактериальной трансформации растения [27]. Мозаичность способствовала выживанию регенерантов, в отличие от побегов с почти полностью белой тканью листа (рис. 1в), что еще раз подчеркивает критичность роли PDS для поддержания жизненно важных процессов в растении.

Предположительно лежащее в основе полученного фенотипа нарушение биосинтеза каротиноидов было подтверждено результатами биохимического и генетического анализа. Существенное сокращение количества каротиноидов в листовой ткани (табл. 3) согласовалось с присутствием однонуклеотидных инделей в экзоне II гена PDS (табл. 2, рис. 2), приводящих к синтезу коротких вариантов белка. По меньшей мере, их размер (144 или 154 а. о.) исключал формирование функционального гомотетрамера PDS. Так, на примере риса Oryza sativa показано, что PDS-гомодимеры в тетрамерном комплексе стабилизируются четырьмя водородными связями между Thr207, Trp216 и Arg220 одного мономера и карбонильными атомами кислорода Pro239, Leu235 и Gln263 соседнего мономера (то есть между а. о., расположенными после 200 а. о.) [2].

Таким образом, нефункциональные, нокаутированные версии PDS табака прекращали синтез каротиноидов в самом начале пути, в результате чего в хлоропластах редактированных клеток отсутствовали ксантофиллы (непосредственные участники работы фотосинтетического аппарата и фотозащиты растения [1]), что, вероятно, нарушало функцию хлоропластов [15]. Более того, там отсутствовали побочные продукты каротиногенеза – фитогормоны АБК и стриголактоны, необходимые для регуляции различных аспектов развития [4, 5], что может объяснить другие (помимо мозаичной пигментации листа) отличия редактированных линий от контроля (табл. 2).

Экспрессионный анализ линий L28 и L29, отличающихся от WT-контроля и друг от друга серьезным сдвигом по времени инициации цветения (L28/L29/WT – 346/461/122 дней), обнаружил существенные изменения уровня транскриптов NtP-DS и NtPSY2 у обеих линий, и всех генов, кроме NtCrtRB1, у линии L29 (наиболее поздней) (рис. 3). Серьезное отставание по цветению линий L28 и L29 от контроля могло быть отражением нарушений как фотосинтеза/фотозащиты (следствие дефицита ксантофиллов), так и физиологических процессов (следствие дефицита фитогормонов). К примеру, для апокаротиноида АБК показано как положительное, так и отрицательное воздействие на время цветения растения [28]. Рост уровня транскриптов почти всех генов каротиногенеза (рис. 3) сопровождается пониженным (в сравнении с WT) содержанием каротиноидов (табл. 3) в листьях линии L29. Это допускает влияние количества субстрата и/или продукта каротиногенеза на генную экспрессию, как это предполагается для различных метаболических путей [8, 20]. Повышенной экспрессии NtPSY2 в нередактированных клетках линии L28 оказалось, вероятно, достаточно для обеспечения пороговых (для цветения) значений продуктов каротиноидного пути. Существенное отставание линии L29 не только от контроля, но и от линии L28, возможно потребовало активации не только гена фитоинсинтазы NtPSY2, но и других нижестоящих генов пути (рис. 3), в особенности NtLCYB и NtVDE, играющих критичные роли в биосинтезе ксантофиллов и, следовательно, фотосинтезе и фотозащите [1].

Поскольку время цветения (как и другие аспекты развития) связано с фотопериодом и фотосинтезом [29, 30], существенное изменение содержания каротиноидов является для растения стрессом. Таким образом, дифференциальная экспрессия генов каротиногенеза в ответ на мозаичный нокаут NtPDS может свидетельствовать о вынужденной адаптации растения к изменению содержания продуктов каротиноидного пути посредством компенсаторного увеличения их синтеза в нередактированных клетках.

Повышение уровня транскриптов генов каротиногенеза может происходить за счет активации их регуляторов, какими, к примеру, могут быть MADS-доменные ТФ [10, 11]. Так, в плодах томата транскрипция гена PDS находится под контролем MADS-доменного ТФ RIN; экспрессия гена RIN прямо зависит либо от уровня транскриптов PDS, либо от содержания каротиноидов [8]. Ген RIN входит в подсемейство SEP, отдельные члены которого (SEP1 и SEP4) транскрибируются не только в плодах, но и в листьях [31]. В подтверждение предполагаемых корреляций с содержанием каротиноидов [8], листья обеих проанализированных линий L28 и L29 отличались от WT существенным снижением уровня транскриптов NtSEP1 (рис. 4). С учетом вышесказанного, а также роли MADS-доменных ТФ в АБК-опосредованном ответе растений на абиотические стрессы [22, 32, 33], дифференциальная экспрессия гена NtSEP1 (рис. 4) предполагает его участие в регуляции биосинтеза каротиноидов в листьях табака (в том числе, в ответ на стрессы).

Таким образом, в данном исследовании мы нокаутировали ген фитоинсинтазы NtPDS в геноме табака N. tabacum с использованием системы CRISPR-Cas9 и проанализировали полученные трансгенные линии на содержание каротиноидов в совокупности с экспрессией структурных генов пути синтеза каротиноидов и, возможно, участвующих в их регуляции MADS-box генов. Полученные результаты мозаичного редактирования гена свидетельствуют о том, что индели (350^351→ins^g#, 350^351→ins^t# и t351→del(1nt)#) в экзоне II гена NtPDS приводят к образованию нефункционального белка NtPDS, что изменяет метаболизм каротиноидов, время инициации цветения и морфологические характеристики растений табака. Дифференциальная экспрессия NtSEP1 в контрольных нетрансгенных растениях и позднецветущих редактированных линиях L28 и L29 предполагает участие ТФ NtSEP1 в регуляции биосинтеза каротиноидов и побочных продуктов пути, в том числе в ответ на стресс.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-16-00016) и Министерства науки и высшего образования РФ. В работе использована экспериментальная установка искусственного климата (ЭУИК, Федерального исследовательского центра Биотехнологии Российской академии наук).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследования.