1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Генетика
  4. T. 55, № 1, 2019

Генетика, 2019, T. 55, № 1, стр. 40-51

Сравнительный анализ методов генетического типирования Bacillus anthracis

Е. И. Еременко 1, *, А. Г. Рязанова 1, С. В. Писаренко 1, Л. Ю. Аксенова 1, О. В. Семенова 1, Е. А. Котенева 1, О. И. Цыганкова 1, Д. А. Ковалев 1, Т. М. Головинская 1, Д. К. Чмеренко 1, А. Н. Куличенко 1

1 Ставропольский противочумный институт
355035 Ставрополь, Россия

* E-mail: ejer@mail.ru

Поступила в редакцию 25.12.2017
После доработки 26.03.2018
Принята к публикации 14.02.2018

Полный текст (PDF)

Аннотация

Генетическое типирование возбудителя сибирской язвы применяется в эпидемиологических расследованиях вспышек инфекции и служит инструментом изучения эволюции этого патогенного вида. Изучены аналитические, технические и экономические возможности наиболее распространенных современных методов генетического типирования B. anthracis на основе собственных и литературных данных. Установили, что canSNP-генотипирование выделяет у 23 штаммов B. anthracis 10 генотипов с индексом разнообразия DI 0.8261. DI для MLST составляет не более 0.5495–0.5790 в зависимости от выборки штаммов. DI для MLVA-15, 25 и 31 одинаков и равен 0.9881. Анализ SNP коровой области геномов 181 штамма обеспечивает самую высокую дискриминацию (DI = 1). MVLST с DI, равным 0.9960, как и SNR-анализ, выявляет различия между генотипами изолятов из одной вспышки. CanSNP13-генотипирование вполне достаточно в качестве предварительного этапа генотипирования для разделения штаммов на основные генетические линии. MLST B. anthracis нецелесообразно ввиду малой разрешающей способности и трудоемкости, а MVLST, несмотря на высокую разрешающую способность, – из-за длительности и трудоемкости исследования. Идентичность изолятов из одной вспышки сибирской язвы можно подтвердить методами MLVA15–31, тонкие различия между ними – методами анализа SNR и SNP коровой области генома.

Ключевые слова: Bacillus anthracis, генетическое типирование, индекс разнообразия.

Сибирская язва распространена глобально, исключая часть северных регионов, Новую Зеландию и небольшие островные территории. Значимость этой инфекции определяется вспышками природной этиологии, приводящими к падежу скота и заболеванию людей. Молекулярное типирование B. anthracis в практических целях призвано определить географическое происхождение штамма и источник инфекции. Теоретические аспекты молекулярного типирования связаны с развитием представлений об эволюции B. anthracis как патогенного вида.

Современные методы генетического типирования сибиреязвенного микроба эксплуатируют несколько стратегий.

Одна из них основана на анализе областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR-локусов и SNR-локусов с единичными нуклеотидными повторами – поли A/T трактов). VNTR-типирование B. anthracis, начиная с анализа единственного VNTR-локуса vrrA, описанного Andersen et al. [1], получило развитие в схемах многолокусного анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA), различающихся количеством анализируемых локусов, и позволило получить первое представление о генетической структуре глобальной популяции этого патогена [2–6]. Использованию MLVA B. anthracis посвящена обширная литература [7–21]. SNR-типирование в силу наиболее высокой разрешающей способности дало возможность различать даже изоляты штамма, выделенные в ходе одной вспышки сибирской язвы [22–27].

Другая стратегия реализуется в методах исследования единичных нуклеотидных вариантов полиморфизма (SNP) – однонуклеотидных замен в разных областях генома. Секвенирование фрагментов нескольких генов “домашнего хозяйства” (MLST) широко используется в генотипировании многих патогенов, наборы анализируемых генов разнообразны, но данные о типировании B. anthracis ограничены и представлены в двух базах данных: Bacillus cereus MLST Databases (https:// pubmlst.org/bcereus/) и Bacillus cereus group MLST + + AFLP + MLEE Oslo Typing Databases (http://mlstoslo.uio.no/). Анализ 13 локусов с так называемыми “каноническими” SNP (canSNP-анализ) дает возможность определить принадлежность штамма к одной из 12 подгрупп трех основных генетических линий A, B и C [28]. Увеличение числа анализируемых canSNP до 27 оказалось полезным для быстрого отнесения изолята к одной из возросшего числа подгрупп основных генетических линий и определения его филогенетического положения в субструктуре популяции B. anthracis [29]. Полногеномное секвенирование (WGS) дает возможность идентифицировать множество SNP при сравнении геномов нескольких штаммов. Коровый геном (ядро генома) определяют как совокупность нуклеотидных последовательностей (или генов), которые присутствуют в каждом геноме выборки, его определяют путем попарного выравнивания полногеномных последовательностей всех геномов выборки с помощью специализированного программного обеспечения. SNP коровой области генома представляют собой единичные нуклеотидные полиморфные варианты, локализованные в гомологичных нуклеотидных последовательностях всех геномов выборки. Существуют также программы, позволяющие на основе коровых SNP провести филогенетический анализ [30, 31]. Анализ SNP полного генома B. anthracis использован в ряде работ [32–35].

Многолокусное секвенирование нескольких генов факторов патогенности, получившее название MVLST (Multivirulence-locus sequence typing), было применено для типирования Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, Salmonella enterica и Staphylococcus aureus [36]. Такой подход, выявляющий вариабельность, вносимую SNP и инсерциями/делециями (инделами), использован нами для анализа последовательностей генов факторов патогенности B. anthracis [37, 38].

Для многих методов типирования существуют или создаются базы данных, позволяющие сравнивать генотипы штаммов, созданы компьютерные программы для биоинформационного и филогенетического анализов.

При эпидемиологическом расследовании вспышки сибирской язвы на Ямале в 2016 г. нами для генотипирования изолятов B. anthracis использованы все упомянутые методы, кроме MLST [37, 38]. Полученные результаты дали определенное представление о возможностях этих методов, однако необходимо более полное исследование с расширением набора штаммов и анализируемых методов. Дискриминирующие возможности вариантов MLVA B. anthracis описаны только в работе Thierry et al. [6] и с цитатой из этой статьи в только что опубликованном обзоре Тимофеева и др. [21], но относительно других методов генотипирования таких данных нет.

Цель исследования – оценить аналитические, технические и экономические возможности методов генетического типирования B. anthracis на основе собственных и литературных данных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы и геномы микроорганизмов

Использовали 13 штаммов B. anthracis (№ 1–13) и полные нуклеотидные последовательности секвенированных нами 19 штаммов (№ 1–19) из коллекции патогенных микроорганизмов ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Рос-потребнадзора (табл. 1), а также нуклеотидные последовательности штаммов из базы данных GenBank и MLVA-генотипы из базы данных MLVA-bank for Microbes Genotyping (http://microbesgenotyping.i2bc.paris-saclay.fr/databases/view/655). Выборки из геномов 23, 57, 101, 181 и 540 штаммов B. anthracis формировали для сравнения получаемых значений индекса разнообразия в зависимости от объема выборки и степени молекулярного разнообразия штаммов (табл. 2). В выборку из 23 генетически разнообразных штаммов входили геномы 13 штаммов из коллекции Ставропольского противочумного института и 10 штаммов – из GenBank, представляющие 10 из 12 canSNP13-подгрупп. Эта выборка была также составной частью выборок из 181 и 540 геномов. Выборку из 181 генома формировали доступные полные геномы штаммов из GenBank и геномы секвенированных нами 19 штаммов. Выборку из 540 MLVA31-генотипов составляют, помимо выборки из 23 штаммов, все представленные в базе данных MLVAbank for Microbes Genotyping. Выборки из 57 и 101 штамма включают все MLST-генотипы штаммов B. anthracis из баз данных Bacillus cereus MLST Databases и Bacillus cereus group MLST + AFLP + MLEE Oslo Typing Databases соответственно.

Таблица 1.  

CanSNP13-генотипы 23 штаммов B. anthracis

№ п.п. Штамм
B. anthracis		 Место выделения Год выделения Доступ в GenBank CanSNP13-генотип
1 1342/12 Россия, ЯНАО 2016 Нет B.Br. 001/002
2 1339/24 Россия, ЯНАО 2016 » B.Br. 001/002
3 1051/35 Россия, г. Уфа 1935 » B.Br. 001/002
4 14/41 Россия, Дагестан 1963 » B.Br. 001/002
5 1284 Россия, г. Омск 2010 » B.Br. 001/002
6 140П Россия, Тверская область 1979 » B.Br. 001/002
7 81/1 Россия, Ставропольский край 1969 » A.Br.008/009
8 1266 Россия, Ставропольский край 2006 » A.Br.008/009
9 1269 Россия, РСО-А 2007 » A.Br.008/009
10 1(СО) Россия, РСО-А 1968 » A.Br.008/009
11 1307 Россия, Ставропольский край 2013 » A.Br.008/009
12 1322 Россия, Ставропольский край 2013 » A.Br.008/009
13 И-271 Россия, Якутская АССР 1980 » A.Br.001/002
14 312/163 Азербайджан 1978 » A.Br.Aust94
15 737/10 Грузия 1984 » A.Br.Aust94
16 1 Украина 1967 » A.Br.005/006
17 228/269 Российская Федерация 1977 » A.Br.008/009
18 140Пcap-б/м Вариант штамма 140П 1980 » A.Br.008/009
19 12/16 Россия, Дагестан 1957 » B.Br. 001/002
20 Ames Ancestor США, Техас 1981 NC_007530.2; NC_007322; NC_007323.3 A.Br.Ames
21 HYU01 Корея 2009 NZ_CP008846.1; NZ_CP008847.1; NZ_CP009339.1 B.Br. 001/002
22 Canadian bison Канада Неизвестен NZ_CP010322.1; NZ_CP010321.1; NZ_CP010320.1 A.Br.WNA
23 Ohio ACB США » NZ_CP009341.1; NZ_CP009340.1; NZ_CP009339.1 A.Br.Aust94
24 K3 ЮАР » NZ_CP009331.1; NZ_CP009330.1; NZ_CP009329.1 A.Br.005/006
25 2002013094 США 1956 NZ_CP009902.1; NZ_CP009901.1; NZ_CP009900.1 C.Br.A1005
26 Vollum 1B США 1951 NZ_CP009328.1; NZ_CP009327.1; NZ_CP009326.1 A.Br.Vollum
27 CNEVA-9066 Франция Неизвестен AAEN01.1.fsa_nt.gz B.Br.CNEVA
28 SVA11 Швеция » NZ_CP006742.1; NZ_CP006743.1; NZ_CP006744.1 B.Br.001/002
29 A16 Китай » NZ_CP009331.1; NZ_CP009330.1; NZ_CP009329.1 A.Br.001/002
Таблица 2.  

Дискриминирующие возможности MLVA, анализа canSNP, SNP коровой области генома, MLST и MVLST B. anthracis

Cхема геноти-пирования 23 штамма 57 штаммов 101 штамм 181 штамм 540 штаммов
DI число генотипов DI число генотипов DI число генотипов DI число генотипов DI число генотипов
canSNP13, 27 0.8260 10 Не определяли Не определяли Не определяли Не определяли
MLST Oxford 7 0.5790 3 0.5495 8
MLST T-H7 Не определяли Не определяли 0.4778 7
MLVA7 0.9585 16 Не определяли 0.6738 61
MLVA8 0.9644 17 0.8611 80
MLVA15 0.9881 20 0.8622 95
MLVA25 0.9881 20 0.8743 149
MLVA31 0.9881 20 0.8748 154
MVLST 0.9960 22 Не определяли
SNP коровой области генома Не определяли 1 181

Молекулярное типирование

Для MLVA-генотипирования использовали схемы MLVA7 [6], MLVA8 [2], MLVA15 [28], MLVA25 [4], MLVA31 [5], праймеры и параметры ПЦР-амплификации, приведенные в цитируемых работах. Размеры ампликонов определяли гель-электрофорезом и секвенированием по Сэнгеру.

CanSNP13-генотип (ГТ) штаммов из нашей коллекции определяли методом сайт-специфической амплификации в ПЦР в режиме реального времени с LNA-модифицированными зондами [39], используя последовательности ПЦР-праймеров, зондов и схему генотипирования, описанные в работе [28]. LNA-модификация и синтез олигонуклеотидов выполнены фирмой “ДНК-синтез” (Россия). CanSNP27-ГТ определяли, ориентируясь на координаты canSNP-локусов в геноме референс-штамма B. anthracis Ames Ancestor и праймеры из работы [29]. Сравнивали получаемые in silico ампликоны этого штамма и исследуемых штаммов с помощью ресурса NCBI BLASTn (www.blast.ncbi.nlm.nih.gov). CanSNP13-ГТ для последовательностей штаммов из GenBank определяли in silico, пользуясь online ресурсом MLVA-bank for Microbes Genotyping по адресу http://mlva.u-psud.fr/mlvav4/genotyping/insilico.php. MLVA ГТ типированных нами штаммов сравнивали с представленными в online базе данных MLVAbank for Microbes Genotyping по адресу http://microbesgenotyping.i2bc.paris-saclay.fr/databases/view/ 655. Филогенетический анализ результатов MLVA проводили в программе FYLOViZ 2.0. Коровый геном по данным черновой сборки полногеномного секвенирования (ПГС) был получен путем множественного выравнивания полных геномных последовательностей секвенированных нами 19 штаммов и 162 штаммов из GenBank в программе REALPHY (https://realphy.unibas.ch/fcgi/realphy). MVLST и анализ SNR-локусов по данным ПГС штаммов из нашей коллекции, а также геномов штаммов из GenBank проводили in silico, сравнивая с последовательностями генов штамма B. anthracis Ames Ancestor c использованием ресурса NCBI BLASTn, праймеров к четырем SNR-локусам HM1, HM2-2, HM6 и HM13 [24]. MLST штаммов B. anthracis проводили in silico с фрагментами генов glp, gmk, ilv, pta, pur, pyc, tpi схемы Priest et al. (2004), поскольку она представлена в двух базах данных: Bacillus cereus MLST Databases (https://pubmlst.org/bcereus/) и Bacillus cereus group MLST + AFLP + MLEE Oslo Typing Databases (http://mlstoslo.uio.no/). Для филогенетического анализа методами MVLST и MLST последовательности каждого из генов всех штаммов выравнивали в программе CLC Sequence Viewer Version 7.0, матрицы соответствующих генов объединяли в одну последовательность в программе Unipro UGENE v1.20.0, дендрограммы с алгоритмом UPGMA строили в программе MEGA 7. Филогенетическое дерево по результатам анализа SNP корового генома построили методом байесовского филогенетического анализа. Дискриминирующую способность схем молекулярного типирования определяли по индексу разнообразия Симпсона (DI) в описании Hunter & Gaston [40].

Секвенирование по Сэнгеру и капиллярный фрагментный анализ проводили в автоматическом ДНК-анализаторе ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США), полногеномное секвенирование (ПГС) – с помощью секвенатора Ion Torrent PGM.

РЕЗУЛЬТАТЫ

CanSNP-генотипирование

Результаты определения canSNP13-ГТ 23 штаммов B. anthracis приведены в табл. 1. Они были представлены десятью canSNP13-ГТ. Штаммы из нашей коллекции относились к ГТ A.Br.008/009, B.Br.001/002 и A.Br.001/002, кроме них ГТ B.Br.001/002 имели штаммы HYU01 (Корея) и SVA11 (Швеция), а ГТ A.Br.001/002 – штамм A16 из Китая. Индекс разнообразия для этой схемы генотипирования и выборки штаммов составлял 0.8261 (табл. 2). CanSNP27-генотипирование выявило также 10 canSNP27-ГТ. Филогенетический анализ обнаружил минимальные различия в топологии дендрограмм canSNP13 и canSNP27, прикорневого деления на три основные генетические линии не отмечалось (рис. 1, 1).

Рис. 1.

Кластерный анализ 23 штаммов B. anthracis по данным: 1 – canSNP13-генотипирования; 2 – MLVA31; 3 – MVLST. Дендрограммы построены по алгоритму UPGMA. A, B и C – основные генетические линии B. anthracis. В прямоугольниках и треугольниках приведены обозначения “канонических” SNP13-генотипов.

MLST

Генотипирование на основе генов glp, gmk, ilv, pta, pur, pyc, tpi провели in silico с использованием баз данных Bacillus cereus MLST Databases (Oxford 7) и Bacillus cereus group MLST + AFLP + MLEE Oslo Typing Databases (T-H7). В первой базе данных находилось 57 штаммов, генотипирование выделило восемь MLST-генотипов, DI для которых составил 0.5495. Применив эту схему для 23 штаммов из табл. 1, получили три MLST-генотипа с DI 0.5790. Во второй базе данных был 101 штамм, относящийся к семи генотипам с DI 0.4778 (табл. 2).

MLVA

Результаты показали, что для выборки из 23 штаммов различия DI были заметными между двумя группами: MLVA7–8 и MLVA15–31, при этом MLVA7 и MLVA8 между собой различались незначительно (0.9585 – 16 ГТ и 0.9644 – 17 ГТ у 23 штаммов соответственно). Схемы MLVA15, MLVA25 и MLVA31 обладали равной дискриминирующей силой с ID 0.9881 и позволяли дифференцировать 20 MLVA-ГТ у 23 штаммов (табл. 2).

MLVA31, 25 и 15 выявили идентичность ГТ у изолятов, выделенных в ходе одной вспышки инфекции. MLVA8 и MLVA7 определяли идентичными ГТ не только изолятов из одной вспышки, но также изолятов разного географического происхождения и времени выделения. Имелись отличия в топологии дендрограмм MLVA: прикорневое разделение ГТ на три общепризнанные основные линии A, B и C [7, 14] прослеживалось для MLVA31, MLVA25 и MLVA15 (рис. 1, 2), топология дендрограмм MLVA7 и MLVA8 не соответствовала этому делению.

Для выборки из 540 штаммов, в которую кроме генотипов тех же 23 штаммов вошли MLVA31-генотипы изолятов разного географического происхождения (США, Корея, ЮАР, Канада, Швеция, Китай, Турция, Греция, Пакистан, Германия, Бангладеш, Австрия, Бразилия, Ямайка, Грузия, Намибия), представленные в базе данных MLVAbank for Microbes Genotyping, максимальный показатель DI соответствовал MLVA31, минимальный – MLVA7. По данным MLVA31 идентифицировано 154 ГТ. Дендрограмма MLVA31 для 540 штаммов также сохраняла деление на три генетические линии (рис. 2).

Рис. 2.

Кластерный анализ 540 штаммов B. anthracis по данным MLVA31. Дендрограмма построена по алгоритму UPGMA. Отмечены 23 штамма, генотипы которых определены анализом canSNP, MLVA31 и MVLST. Крупным планом выделены кластеры дендрограммы, имеющие топологию, совпадающую с топологией ветвей соответствующих штаммов в дендрограмме MLVA31 23 штаммов (рис. 1).

MVLST

Исследовали 11 вариабельных структурных и регуляторных генов хромосомной (htrA, mpvF, gerSA, gerSC) и плазмидной (pagA, lef, cya, acpA, acpB, atxA, capA) локализации, имеющих отношение к факторам патогенности B. anthracis.

SNP встречались во всех генах, кроме atxA, больше всего их было в генах cya, lef и pagA. Инделов не было в генах pagA, htrA и mpvF. По совокупности полиморфных вариантов наиболее вариабельными были гены cya и lef, т.е. структурные гены отечного и летального факторов токсинов сибиреязвенного микроба. Трансверсия A–T в позиции 981 гена pagA характерна для штаммов из нашей коллекции с canSNP13-генотипом A.Br.008/009 и была ранее идентифицирована в последовательности этого гена у нескольких штаммов [41]. Всего в 11 генах 23 штаммов отмечено 70 вариантов полиморфизма – 36 SNP и 34 индела. Более всего отличался от референс-штамма Ames Ancestor штамм B. anthracis 2002013094, имевший 20 полиморфных вариантов (18 SNP и 2 индела). MVLST также позволил выявить различия между генотипами изолятов из одной вспышки, показатель DI для 23 штаммов приближался к единице и составлял 0.9960 (табл. 2). Филогенетический анализ поддерживал классическое распределение ГТ между тремя основными генетическими линиями (рис. 1, 3).

Анализ SNP коровой области генома

В анализе использовали полные последовательности геномов 181 штамма B. anthracis, 19 из которых были секвенированы в ФКУЗ Ставропольский противочумный институт, остальные, представленные окончательными и черновыми сборками, взяты из GenBank. Идентифицирован 181 ГТ, отличия имели все штаммы, в том числе изоляты 1342/12 и 1339/24, выделенные в ходе одной вспышки сибирской язвы в 2016 г. на Ямале от больного человека и от северного оленя, соответственно. Различия между ними были только в одном SNP в позиции 679 227 по референсному геному штамма Ames Ancestor с заменой С → T у изолята 1339/24. Эта замена приводит к аминокислотной замене Gly → Glu в гене glpT, кодирующем транспортер глицерол-3-фосфата. DI для этой выборки составлял максимально возможное значение 1 (табл. 2). Филогенетический анализ подтверждал деление ГТ штаммов B. anthracis на три основные генетические линии, только шесть штаммов из нашей коллекции относились к линии B, остальные 13 составляли разные кластеры линии A (рис. 3).

Рис. 3.

Кластерный анализ 181 штамма B. anthracis по данным SNP-типирования коровой области генома. Филогенетическое дерево построено методом байесовского филогенетического анализа. Жирным курсивом отмечены штаммы, секвенированные в ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора. Прямоугольниками выделены штаммы, анализ которых проведен методами анализа canSNP, MLVA31 и MVLST.

SNR-анализ

Все пары штаммов из одной вспышки (серый фон) имели идентичный MLVA31-генотип, но их SNR-генотипы имели отличия (табл. 3). Характерно, что пары изолятов из одной вспышки были выделены из разных объектов.

Таблица 3.

SNR-аллели штаммов B. anthracis

Штамм SNR-аллели и размеры повторов
CL10 CL12 CL35 CL33
1342/12 20A 13A 12A 9A
1339/24 18A 12A 11A 9A
Ames Ancestor 16A 15A 15A 35A
1266 17A 14A 14A 14A
1269 16A 13A 13A 14A
1307 16A 15A 14A 20A
1322 17A 21A 15A 22A

ОБСУЖДЕНИЕ

Дискриминирующие возможности методов молекулярного типирования возбудителя сибирской язвы различны. MLST-типирование в силу самого низкого индекса разнообразия не позволяет адекватно дифференцировать штаммы, трудоемко и целесообразно только для самой общей их генетической характеристики. Данные о MLST-генотипах B. anthracis немногочисленны и представлены в двух базах данных MLST Bacillus cereus.

CanSNP-генотипирование имеет невысокий индекс разнообразия, но при этом позволяет дифференцировать штаммы на 12 генетических кластеров, представляющих глобальную структуру популяции B. anthracis, технически несложно и может использоваться в качестве быстрого предварительного теста в эпидемиологическом расследовании с целью определить происхождение штамма, вызвавшего вспышки, есть возможность сравнения с международной базой данных canSNP-генотипов.

MLVA15, 25 и 31 имеют высокий индекс разнообразия, достаточный для дифференциации и определения идентичности штаммов. В работе Thierry et al. [6] анализ 130 штаммов из французской коллекции позволил идентифицировать 35 ГТ MLVA31 и дал меньшие значения DI, чем в нашем исследовании, для всех схем MLVA. При этом показатель для MLVA7 (0.8551) оказался выше, чем для MLVA8 (0.7259), что послужило основанием рекомендовать схему MLVA7 в качестве возможности быстро получить результаты, хорошо коррелирующие со схемой MLVA31, без использования капиллярного электрофореза [6]. В нашей работе схема MLVA7 всегда была менее дифференцирующей, чем все остальные. Существенно, что в нашей выборке из 540 изолятов B. anthracis 491 выделен только в трех странах – Франция, Италия и Намибия, в связи с чем DI для всех схем был ниже, чем в выборке из 23 генетически разнообразных штаммов, и ближе к значениям, полученным в работе [6].

Поддерживается и пополняется база данных MLVAbank for Microbes Genotyping, содержащая генотипы штаммов из разных стран. Технология MLVA хорошо отработана, но анализ 31 VNTR-локуса отнимает достаточно много времени и средств. Кроме того, существует определенная сложность с конвертацией размеров аллелей локусов MLVA, получаемых при фрагментном анализе в парах оснований, в цифровой код, означающий число повторов, который используется в базе данных MLVAbank for Microbes Genotyping [6].

MLST, canSNP-типирование и MLVA не позволяли различить изоляты из одной вспышки. Возможность дифференцировать изоляты из одной вспышки дает MVLST, что может быть связано с тем, что мутации в генах факторов патогенности не являются, в отличие от большинства генов домашнего хозяйства, селективно нейтральными и возникают с более высокой частотой. DI этого метода максимальный для выборки из 23 штаммов и составляет 0.9960. Комплексный анализ SNP и делеций/инсерций (SNV), подобный примененному нами MVLST, дал возможность провести генетический эпидемиологический анализ штаммов, выделенных в ходе одной вспышки из разных источников [42]. Практическая реализация MVLST затруднительна в той же мере, что и MLST, из-за необходимости секвенирования нескольких фрагментов каждого из генов и отсутствия баз данных.

Молекулярное типирование на основе анализа высоковариабельных SNR-локусов выявляет тонкие различия между изолятами одного штамма, имеющими один и тот же MLVA-генотип, что подтверждается нашими данными о парах изолятов B. anthracis (1342/12 и 1339/24), (1266 и 1269) и (1307 и 1322), каждая из которых выделена в ходе отдельной вспышки сибирской язвы. Аналогичный анализ разделил 47 изолятов из одной вспышки в Южной Дакоте (США) на шесть генотипов [25]. Показано, что 53 изолята одного штамма из эпизоотии летом 2004 г. в Италии дифференцировались на пять генотипов при анализе четырех SNR-локусов [27]. Дифференциация изолятов из одной вспышки при SNR-генотипировании может быть осуществлена методом фрагментного капиллярного анализа.

Сравнение результатов филогенетического анализа данных молекулярного типирования методами MLVA, MVLST, SNP-типирования коровой области генома показывает их совпадение между собой и с полученными результатами других авторов, подтверждая корректность проведенного исследования.

Следует отметить, что штаммы 14/41, 12/16 и 140П, выделенные в европейской части России, в отличие от других выделенных там же штаммов и принадлежащих к основной линии A кластеризовались вместе со штаммами из азиатской части и принадлежали к основной линии B. Эта закономерность проявлялась при всех методах молекулярного типирования и отмечалась нами ранее [43]. Штаммы 14/41, 12/16 и 140П были атипичными по ряду признаков, но типичный штамм 140Пcap-б/м, выделенный из популяции штамма 140П при пассировании через организм белых мышей, входил вместе со штаммами из европейской части в один из кластеров основной линии А (рис. 3).

Полногеномное секвенирование дает исчерпывающую информацию о геноме и в состоянии заменить другие методы молекулярно-генетического типирования, так как на его основе можно определить SNP-, SNR-, MLST-, MVLST- и MLVA-генотипы штаммов B. anthracis in silico. Его использование ограничивается только высокой стоимостью оборудования, уже сейчас по материальным затратам и скорости выполнения анализ SNP коровой области генома сопоставим с MLVA, обеспечивая высочайшую степень дискриминации штаммов и становясь основным методом молекулярно-генетического типирования B. anthracis.

Результаты филогенетического анализа с представительной выборкой штаммов дают возможность предположить географическое происхождение изолята. Для этого необходимо создание национальной базы данных геномов штаммов B. anthracis, поскольку в базе данных GenBank геномы штаммов российского происхождения до последнего времени были представлены только тремя вакцинными штаммами. Большинство штаммов из нашей коллекции, относящихся к линии A, кластеризуются в одной субкладе с российским вакцинным штаммом Ценковского (“Tsiankovskii”), китайским вакцинным штаммом Cvac02 и штаммом K3974 из Словакии, что может указывать на общность происхождения этих штаммов (рис. 3).

Таким образом, разные методы молекулярного типирования B. anthracis дают информацию определенного содержания, так как отражают изменения в геноме, связанные с разного рода мутациями, различающимися частотой возникновения и стабильностью. Поэтому выбор схем генотипирования должен определяться целью исследования. Располагая набором методов генотипирования с разной разрешающей способностью и сложностью выполнения, можно остановиться на тех из них, которые наиболее соответствуют цели исследования и наличию необходимого оборудования. MLVA31 обеспечивает высокую дискриминирующую способность, достаточную для определения принадлежности изолятов B. anthracis к одной вспышке сибирской язвы, дифференциация между ними возможна с использованием анализа SNP коровой области генома и SNR. Для решения вопроса о происхождении штамма, вызвавшего вспышку, необходимо иметь в своем распоряжении репрезентативную базу данных о генотипах штаммов.

Список литературы

  1. Andersen G.L., Simchock J.M., Wilson K.H. Identification of a region of genetic variability among Bacillus anthracis strains and related species // J. Bacteriol. 1996. V. 178. № 2. P. 377–384.

  2. Keim P., Price L.B., Klevytska A.M. et al. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis // J. Bacteriol. 2000. V. 182. № 10. P. 2928–2936.

  3. Le Flèche P., Hauck Y., Onteniente L. et al. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus anthracis // BMC Microbiol. 2001. V. 1. № 2. http://www.biomedcentral.com/1471-2180/1/2.

  4. Lista F., Faggioni G., Valjevac S. et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis // BMC Microbiol. 2006. V. 6. № 33. P. 1–14. doi 10.1186/1471-2180-6-33

  5. Beyer W., Bellan S., Eberle G. et al. Distribution and molecular evolution of Bacillus anthracis genotypes in Namibia // PLoS Negl. Trop. Dis. 2012. V. 6. № 3. P. 1–12.

  6. Thierry S., Tourterel C., Le Flèche P. et al. Genotyping of french Bacillus anthracis strains based on 31-loci multi locus VNTR analysis: epidemiology, marker evaluation, and update of the internet genotype database // PLoS One. 2014. 9(6): 95131. doi 10.1371/journal.pone.0095131

  7. Hoffmaster A.R., Fitzgerald C.C., Ribot E. et al. Molecular subtyping of Bacillus anthracis and the 2001 bioterrorism-associated anthrax outbreak, united states // Emerg. Infect. Dis. 2002. V. 8. № 10. P. 1111–1116.

  8. Fouet A., Smith K.L., Keys C. et al. Diversity among french Bacillus anthracis isolates // J. Clin. Microbiol. 2002. V. 40. № 12. P. 4732–4734.

  9. Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Брюханов А.Ф. и др. Генотипирование штаммов сибиреязвенного микроба на территории стран СНГ // Журн. микробиологии. 2003. № 6. Прилож. С. 51–56.

  10. Gierczyński R., Kałuzewski S., Rakin A. et al. Intriguing diversity of Bacillus anthracis in eastern Poland – the molecular echoes of the past outbreaks // FEMS Microbiol. Lett. 2004. V. 239. P. 235–240.

  11. Fasanella A., Van Ert M., Altamura S.A. et al. Molecular diversity of Bacillus anthracis in Italy // J. Clin. Microbiol. 2005. V. 43. № 7. P. 3398–3401.

  12. Ryu C., Lee K., Hawng H.-J. et al. Molecular characterization of Korean Bacillus anthracis isolates by amplified fragment length polymorphism analysis and multilocus variable-number tandem repeat analysis // Applied Environm. Microbiol. 2005. V. 71. № 8. P. 4664–4671.

  13. Merabishvili M., Natidze M., Rigvava S. et al. Diversity of Bacillus anthracis strains in Georgia and of vaccine strains from the former Soviet Union // Applied Environm. Microbiol. 2006. V. 72. № 8. P. 5631–5636.

  14. Sue D., Marston C.K., Hoffmaster A.R. et al. Genetic diversity in a Bacillus anthracis historical collection (1954 to 1988) // J. Clin. Microbiol. 2007. V. 45. № 6. P. 1777–1782.

  15. Шишкова Н.А., Мокриевич А.Н., Платонов М.Е. и др. Изучение генетического разнообразия штаммов сибиреязвенного микроба из коллекции ГНЦ ПМБ // Проблемы особо опасных инфекций. 2010. № 104. С. 60–65.

  16. Aikembayev A.M., Lukhnova L., Temiraliyeva G. et al. Historical distribution and molecular diversity of Bacillus anthracis, Kazakhstan // Emerging Infect. Dis. 2010. V. 16. № 5. P. 789–796.

  17. Okutani A., Tungalag H., Boldbaatar B. et al. Molecular epidemiological study of Bacillus anthracis isolated in Mongolia by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis for 8 loci (MLVA-8) // Jpn. J. Infect. Dis. 2011. V. 64. P. 345–348.

  18. Pilo P., Frey J. Bacillus anthracis: Molecular taxonomy, population genetics, phylogeny and patho-evolution // Infect. Genet. Evol. 2011. V. 11. № 6. P. 1218–1224. doi 10.1016/j.meegid.2011.05.013

  19. Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Цыганкова О.И. и др. Генотипическое разнообразие штаммов Bacillus anthracis, выделенных в регионе Кавказа // Мол. генетика, микробиология и вирусология. 2012. № 2. С. 26–29.

  20. Афанасьев М.В., Кравец Е.В., Дугаржапова З.Ф. и др. Сравнительный мультилокусный VNTR- и SNP-анализ вакцинных штаммов Bacillus anthracis // Мол. генетика, микробиология и вирусология. 2014. № 2. С. 36–40.

  21. Тимофеев В.С., Бахтеева И.В., Дятлов И.А. Генотипирование Bacillus anthracis и близкородственных микроорганизмов // Генетика. 2018. Т. 54. № 1. С. 3–14.

  22. Keim P., Van Ert M.N., Pearson T. Anthrax molecular epidemiology and forensics: using the appropriate marker for different evolutionary scales // Infect., Gen. Evol. 2004. № 4. P. 205–213.

  23. Stratilo C.W., Lewis C.T., Bryden L. et al. Single-nucleotide repeat analysis for subtyping Bacillus anthracis isolates // J. Clin. Microbiol. 2006. V. 44. № 3. P. 777–782. doi 10.1128/JCM.44.3.777–782.2006

  24. Kenefic L.J., Beaudry J., Trim C. et al. A high resolution four-locus multiplex single nucleotide repeat (SNR) genotyping in Bacillus anthracis // J. Microbiol. Methods. 2008. V. 73. № 3. P. 269–272. doi 10.1016/j.mimet.2007.11.014

  25. Kenefic L.J., Beaudry J., Trim C. et al. High resolution genotyping of Bacillus anthracis outbreak strains using four highly mutable single nucleotide repeat markers // Let. Appl. Microbiol. 2008. V. 46. № 5. P. 600–603. doi 10.1111/j.1472-765X.2008.02353.x

  26. Stratilo C.W., Bader D.E. Genetic diversity among Bacillus anthracis soil isolates at Fine geographic scales // Appl. Environ. Microbiol. 2012. V. 78. № 18. P. 6433–6437.

  27. Garofolo G., Ciammaruconi A., Fasanella A. et al. SNR analysis: molecular investigation of an anthrax epidemic // BMC Veter. Res. 2010. 6:11. http://www.biomedcentral.com/1746-6148/6/11.

  28. Van Ert M.N., Easterday W.R., Huynh L.Y. et al. Global genetic population structure of Bacillus anthracis // PLoS One. 2007. V. 2(5). P. 1–10. e461. doi 10.1371/ journal.pone.0000461

  29. Girault G., Thierry S., Cherchame E., Derzelle S. Application of high-throughput sequencing: Discovery of informative SNPs to subtype Bacillus anthracis // Adv. Biosc. Biotech. 2014. № 5. P. 669–677. http:// dx.doi.org/ doi 10.4236/abb.2014.57079.

  30. Yamashita A., Sekizuka T., Kuroda M. GcoGSA-BA: A global core genome SNP analysis for Bacillus anthracis // Health Security 2015. V. 13. № 1. P. 64–68. doi 10.1089/ hs.2014.0076

  31. Leekitcharoenphon P., Kaas R.S., Thomsen M.C. et al. SnpTree – a web-server to identify and construct SNP trees from whole genome sequence data // BMC Genomics 2012. V. 13(Suppl. 7):S6.

  32. Keim P., Grunowc R., Vipond R. et al. Whole genome analysis of injectional anthrax identifies two disease clusters spanning more than 13 years // EBioMedicine. 2015. V. 2. № 6. P. 1613–1618. eCollection 2015. doi 10.1016/j.ebiom.2015.10.004

  33. Derzelle S., Aguilar-Bulteta L., Freya J. Whole genome SNP analysis of bovine B. anthracis strains from Switzerland reflects strict regional separation of simmental and swiss brown breeds in the past // Vet. Microbiol. 2016. V. 196. P. 1–8. http://dx.org/10.1016/j.vetmic.2016.10.014.

  34. Antwerpen M.H., Sahl J.W., Birdsell D. et al. Unexpected relations of historical anthrax strain // mBio. 2017. 8:e00440-17. https://org/ doi 10.1128/mBio.00440-17.

  35. Derzelle S., Girault G., Roest H.I. et al. Molecular diversity of Bacillus anthracis in the Netherlands: Investigating the relationship to the worldwide population using whole-genome SNP discovery // Infect., Gen. Evol. 2015. V. 32. P. 370–376. http://dx.org/10.1016/j.meegid.2015.03.030.

  36. Sabat A.J., Budimir A., Nashev D. et al. Overview of molecular typing methods for outbreak detection and epidemiological surveillance // Euro Surveill. 2013. V. 18. № 4. P. 1–14. :pii=20380. Available online: http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=2038.

  37. Куличенко А.Н., Еременко Е.И., Рязанова А.Г. и др. Биологические свойства и молекулярно-генетическая характеристика штаммов Bacillus anthracis, выделенных во время вспышки сибирской язвы в Ямало-Ненецком автономном округе в 2016 г. // Проблемы особо опасных инфекций. 2017. № 1. С. 94–99. doi 10.21055/0370-1069-2017-1-94-99

  38. Попова А.Ю., Куличенко А.Н., ред. Опыт ликвидации вспышки сибирской язвы на Ямале в 2016 году. Ижевск.: ООО “Принт-2”, 2017. 311 с.

  39. Котенева Е.А., Цыганкова О.И., Еременко Е.И. Анализ canSNP генотипов штаммов Bacillus anthracis, выделенных на территории Северного Кавказа и Закавказья // Материалы VI Всерос. научно-практ. конф. молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора “Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины”. Ставрополь, 2014. 57 с.

  40. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of simpson’s index of diversity // J. Clin Microbiol. 1988. V. 26. № 11. P. 2465–2466.

  41. Okinaka R.T., Henrie M., Hill K.K. et al. Single nucleotide polymorphism typing of Bacillus anthracis from Sverdlovsk tissue // Emerging Infect. Dis. 2008. V. 14. № 4. P. 653–656. doi 10.3201/eid1404.070984

  42. Ågren J., Finn M., Bengtsson B., Segerman B. Microevolution during an anthrax outbreak leading to clonal heterogeneity and penicillin resistance // PLoS One. 2014. V. 9. № 2. P. 1–14 : e89112. doi 10.1371/journal.pone.0089112

  43. Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Цыганкова Е.А. и др. Генотипические особенности штаммов Bacillus anthracis с разным проявлением признаков, ассоциированных с патогенностью // Проблемы особо опасных инфекций. 2010. № 104. С. 53–56.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Генетика

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал