Генетика, 2019, T. 55, № 12, стр. 1491-1496

Молекулярно-генетическое изучение ассоциации SNP A66G гена MTRR c кариесом зубов у детей с врожденными расщелинами губы и/или неба и у детей без патологии

И. Г. Удина 1*, В. С. Учаева 1, В. В. Волобуев 2, А. С. Грачева 1, Ю. А. Васильев 2

1 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук
119991 Москва, Россия

2 Кубанский государственный медицинский университет
350063 Краснодар, Россия

* E-mail: irina_udina@mail.ru

Поступила в редакцию 22.05.2019
После доработки 02.07.2019
Принята к публикации 09.07.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Проведено изучение ассоциации SNP A66G гена MTRR с кариесом зубов у детей с врожденными пороками развития челюстно-лицевой области (ВПР ЧЛО) с врожденными изолированными расщелинами губы и/или неба (ВРГ, ВРН и ВРГН) и у детей без врожденной патологии. Сравнение выборок детей с ВРГ, ВРН и ВРГН и детей без врожденной патологии выявило ассоциацию SNP A66G гена MTRR с рассматриваемыми пороками развития, что не позволило установить вероятную связь этого маркера с кариесом (для генотипа G/G отмечен повышенный риск развития ВПР ЧЛО: OR = 2.16, p = 0.046, 95% CI (1.00–4.67). У детей без патологии выявлена ассоциация SNP A66G гена MTRR с ранним кариесом. Для носителей генотипа A/A среди детей с временным и смешанным прикусом (N = 91) со средним возрастом 6.51 ± 0.2 повышен риск развития более интенсивной формы кариеса: OR = 4.91, p = 0.006, 95% CI (1.53–15.78). У детей с временным прикусом (N = 53) со средним возрастом 4.71 ± 0.18 OR = 10.53, p = 0.024, 95% CI (1.19–485.29). Для детей носителей гетерозиготного генотипа A/G отмечена устойчивость к более интенсивной форме кариеса. Таким образом, SNP A66G гена MTRR может быть рассмотрен как маркер раннего кариеса у детей без врожденной патологии.

Ключевые слова: врожденные расщелины губы и неба, дети, A66G гена MTRR, ранний кариес, Краснодарский край.

DOI: 10.1134/S0016675819120129

Несмотря на значительные успехи технологии полногеномных ассоциативных исследований (GWAS – genome wide association studies), проведение популяционных ассоциативных исследований остается неотъемлемой частью исследований, направленных на выявление роли генетических маркеров в развитии конкретных заболеваний. Однако, установление ассоциаций по единичным генетическим маркерам с многофакторными заболеваниями зачастую осложнено недоступностью больших выборок, которые необходимы для выявления ассоциаций для маркеров с относительно слабым эффектом [1]. Часто ассоциация устанавливается только для сочетания генетического маркера и какого-то фактора окружающей среды или образа жизни. Тем не менее, популяционные ассоциативные исследования – зачастую единственный путь для выявления роли генетических маркеров в развитии многофакторных заболеваний, т.к. при проведении GWAS относительно слабые эффекты влияния для отдельных SNP (или для редких SNP) невозможно установить из-за того, что они оказываются за пределами разрешающей способности метода.

Врожденные изолированные расщелины губы и/или неба – широко распространенные тяжелые ВПР ЧЛО (врожденные пороки развития челюстно-лицевой области): в европейских популяциях встречаются с частотой 1/700 [2]. В развитии рассматриваемых ВПР ЧЛО, которые представляют собой многофакторные заболевания, установлена роль, как генетических маркеров, так и факторов образа жизни и загрязнения окружающей среды [2, 3]. По мнению некоторых исследователей эти ВПР ЧЛО следует рассматривать не как изолированные, а как синдромальные, в связи с сопутствующей стоматологической патологией [4]. По данным некоторых исследователей у детей с данной группой ВПР ЧЛО широко распространен кариес с высокой интенсивностью по сравнению с детьми без патологии [5]. В связи с этим, проводят поиск специфических молекулярных маркеров, ассоциированных с кариесом у детей с ВПР ЧЛО [6]. По данным многих исследователей важную роль в развитии кариеса у детей с ВПР ЧЛО имеет гигиена полости рта [79]. С ранним кариесом ассоциирован специфический спектр молекулярно-генетических маркеров [9]. Показано, что SNP A66G гена MTRR (5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеин трансфераза редуктаза) – гена фолатного обмена – ассоциируется с развитием рассматриваемых ВПР ЧЛО [10, 11], а по данным авторов [12] является маркером раннего кариеса. Ген локализуется на участке генома 5p15.31 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?linkname =omim_gene&from_uid=602568).

Замена A66G MTRR (rs1801394) приводит к замене аминокислотного остатка изолейцина на метионин в позиции 22 белковой цепи (I22M); предполагают, что эта замена приводит к снижению уровня гомоцистеина в плазме крови [13, 14]. В связи с функцией этого гена, рассматриваемый SNP по данным литературы ассоциируется и с целым рядом заболеваний, например [1317].

Учитывая вышеизложенное, мы провели исследование особенностей распространения SNP A66G гена MTRR у детей с ВПР ЧЛО и у детей без патологии в зависимости от интенсивности кариеса с целью установления роли этого маркера в ассоциации с ранним кариесом и с развитием ВПР ЧЛО.

Обследовались дети (N = 85) с врожденными изолированными расщелинами губы и/или неба (ВРГ, ВРН, ВРГН) и дети без патологии (N = 129, возраст от 0 до 17 лет), проживающие в Краснодарском крае.

Работа проводилась на базе Детской краевой клинической больницы и стоматологической поликлиники Кубанского государственного медицинского университета (КубГМУ). Были взяты соскобы буккального эпителия в ротовой полости, из которых выделена ДНК с помощью наборов “Изоген” (Москва). Определение стоматологического статуса детей без врожденной патологии осуществлялось путем осмотра в амбулаторных условиях, а для детей с ВПР ЧЛО частично по данным осмотра стоматологом перед поступлением в лечебно-профилактическое учреждение (69%), для остальных сведения о стоматологическом статусе получены из медицинских карт. Исследование одобрено этическим комитетом КубГМУ – протокол № 63 от 21 мая 2018 г.

Стоматологический осмотр проводили согласно рекомендациям ВОЗ. Дети подразделялись по возрасту для определения формы прикуса: 0–6 лет – временный прикус, 7–12 лет – смешанный и 13–17 лет – постоянный прикус. Все дети на момент обследования имели кариозное поражение зубов. Интенсивность кариозного процесса оценивали с использованием суммарного индекса “кпу/КПУ” (кариес/пломба/удаленный не по смене зуб). В соответствии с полученными значениями “кпу/КПУ” дети в выборках подразделялись на следующие группы: с компенсированной формой кариеса (КФК) – значения индекса от 0 до 3, с субкомпенсированной формой кариеса (СФК) – значения от 4 до 5, и декомпенсированной формой кариеса (ДФК) при значениях от 6 и выше [18]. В связи с относительно небольшой выборкой детей ВПР ЧЛО с постоянным прикусом в окончательный анализ включены только дети с временным и смешанным прикусом.

Определение генотипов по A66G гена MTRR проводили с помощью ПЦР в реальном времени с помощью набора “SNP – экспресс – SHOT” (НПФ “Литех”, (Москва) на детектирующем амплификаторе “ДТ-прайм” (96-луночном) производства фирмы “ДНК-Технология” (Москва).

Статистическая обработка результатов проведена по алгоритмам программы “Statistica”, оценка величины отношения шансов OR (odds ratio) проведена по алгоритмам программы “WinPepi”: http://www.brixtonhealth.com/pepi4window-s.html.

В табл. 1 представлены данные о частоте распространения SNP A66G гена MTRR в изученных выборках у детей без патологии и с ВРГ, ВРН и ВРГН. В обеих изученных выборках наблюдали соответствие равновесию Харди–Вайнберга по распределению генотипов. У детей с ВРГ, ВРН и ВРГН отмечена тенденция к снижению наблюдаемого уровня гетерозиготности (Но), что не характерно для группы детей без патологии. В табл. 1 представлено сравнение по распределению генотипов в двух выборках по SNP A66G гена MTRR, не выявившее достоверных различий для распределения в целом. Однако при сравнении частот генотипа G/G в двух выборках установлено достоверное различие: G = 4.5259, d.f. = 1, p < 0.05.

Таблица 1.  

Распределение генотипов по SNP A66G гена MTRR у детей с ВПР ЧЛО (ВРГ, ВРН и ВРГН) и у детей без врожденной патологии

Дети без врожденной патологии (временный и смешанный прикус)
SNP генотип N.O. F.O. частота
аллеля
N.E. χ2 параметры
гетерозиготности
A66G A/A 22 0.2418 PA = 0.5055 ± 0.0371 23.25 0.2760
d.f. = 1
p > 0.05
He = 0.4999 ± 0.0040
Ho = 0.5275 ± 0.0523
D = 0.0551 ± 0.0991,
td = 0.5246,
p > 0.05
A/G 48 0.5274 45.49
G/G 21 0.2308 PG = 0.4945 ± 0.0371 22.25
91 1.0000 ne = 1.9998 ± 0.0040
Дети ВРГ, ВРН и ВРГН (временный и смешанный прикус)
SNP генотип N.O. F.O. частота
аллеля
N.E. χ2 параметры
гетерозиготности
A66G A/A 14 0.2295 PA = 0. 4180 ± 0.0447 10.66 3.090
d.f. = 1
p > 0.05
He = 0.4866 ± 0.0156
Ho = 0.3770 ± 0.0621
D = –0.2251 ± 0.1006,
td = 1.7118,
p > 0.05
A/G 23 0.3771 29.68
G/G 24 0.3934 PG = 0.5820 ± 0.0447 20.66
61 1.0000 ne = 1.9477 ± 0.0156

Примечание. N.O. – наблюдаемая численность генотипов, N.E. – ожидаемая численность генотипов, F.O. – наблюдаемая частота генотипов; He – теоретическая гетерозиготность, Ho – эмпирическая гетерозиготность, D = (Ho– He)/He; ne – эффективное число аллелей. Обозначения даны для табл. 1–3.

Таким образом, можно заключить, что SNP A66G гена MTRR ассоциируется с развитием рассматриваемой патологии ВРГ, ВРН и ВРГН, причем G – аллель риска. Для генотипа G/G установлен достоверно повышенный риск развития патологии: OR = 2.16, p = 0.046, 95% CI (confidence interval – доверительный интервал) (1.00–4.67).

В табл. 2 представлено сравнение групп детей без патологии с временным прикусом при различной интенсивности кариеса. У детей с интенсивным кариесом (ДФК + СФК) отмечен достоверный дефицит гетерозигот, а у детей с КФК установлен противоположный эффект – достоверный избыток гетерозигот.

Таблица 2.  

Распределение генотипов по SNP A66G гена MTRR у детей без врожденной патологии с временным прикусом с различной степенью поражения кариесом

Дети без врожденной патологии (временный прикус) ДФК + СФК
SNP генотип N.O. F.O. частота
аллеля
N.E. χ2 параметры
гетерозиготности
A66G A/A 8 0.2963 PA = 0.4444 ± 0.0676 5.33 4.3200
d.f. = 1
p < 0.05
He = 0.4938 ± 0.0195
Ho = 0.2963 ± 0.0879
D = –0.4000 ± 0.1170,
td = 2.1942,
p < 0.05
A/G 8 0.2963 13.33
G/G 11 0.4074 PG = 0.5556 ± 0.0676 8.33
27 1.0000 ne = 1.9756 ± 0.0195
Дети без врожденной патологии (временный прикус) КФК
SNP генотип N.O. F.O. частота
аллеля
N.E. χ2 параметры
гетерозиготности
A66G A/A 1 0.0384 PA = 0.4231 ± 0.0685 4.65 8.6189
d.f. = 1
p < 0.01
He = 0.4882 ± 0.0245
Ho = 0.7692 ± 0.0826
D = 0.5758 ± 0.0870,
td = 3.2612,
p < 0.01
A/G 20 0.7692 12.69
G/G 5 0.1923 PG = 0.5769 ± 0.0685 8.65
26 1.0000 ne = 1.9538 ± 0.0245

Сравнение распределения генотипов детей без врожденной патологии с временным прикусом ДФК + СФК с детьми КФК показало достоверные различия: G = 13.1705, d.f. = 2; p < 0.01. В данном случае SNP A66G гена MTRR достоверно ассоциируется с развитием раннего кариеса, аллель A выступает здесь аллелем риска. Для генотипа A/A установлен достоверно повышенный риск развития раннего кариеса у детей без патологии: OR = = 10.53, p = 0.024, 95% CI (1.19–485.29). Средний возраст детей без патологии с временным прикусом (N = 53) составил 4.71 ± 0.18. Средний возраст детей без патологии с временным и смешанным прикусом (N = 91) составил 6.51 ± 0.27. Таким образом, средний возраст в объединенной группе попадает в интервал возраста детей с временным прикусом, поэтому c целью увеличения выборки мы объединили группы детей с временным и смешанным прикусом с тем, чтобы проанализировать распределение генотипов по SNP A66G гена MTRR в этой группе в зависимости от интенсивности поражения кариесом. Данные представлены в табл. 3. Характерно, что достоверный избыток гетерозигот в группе с КФК, ранее отмеченный для детей без патологии с временным прикусом, сохраняется, равно как и тенденция к снижению наблюдаемого уровня гетерозиготности для группы детей без патологии с временным и смешанным прикусом с ДФК + КФК. Установленные особенности для соотношения величин уровня гетерозиготности свидетельствуют в пользу большей устойчивости детей с гетерозиготным генотипом A/G по SNP A66G гена MTRR к раннему кариесу высокой интенсивности. Сохраняется здесь и установленная для детей без патологии с временным прикусом ассоциация SNP A66G гена MTRR. Для генотипа A/A выше риск развития более интенсивной формы кариеса (ДФК + СФК): OR = 4.91, p = 0.006, 95% CI (1.53–15.78).

Таблица 3.  

Распределение генотипов по SNP A66G гена MTRR в изученных объединенных группах детей без врожденной патологии с временным и смешанным прикусом с различной степенью поражения кариесом

Дети без врожденной патологии (временный и смешанный прикус) ДФК + СФК
SNP генотип N.O. F.O. частота
аллеля
N.E. χ2 параметры
гетерозиготности
A66G A/A 18 0.3529 PA = 0.5392 ± 0.0494 10.83 3.1949
d.f. = 1
p > 0.05
He = 0.4969 ± 0.0103
Ho = 0.3725 ± 0.0697
D = ─0.2503 ± 0.1054,
td = 1.8163,
p > 0.05
A/G 19 0.3725 25.34
G/G 14 0.2745 PG = 0.4608 ± 0.0494 14.83
51 1.0000 ne = 1.9879 ± 0.0103
Дети без врожденной патологии (временный и смешанный прикус) КФК
SNP генотип N.O. F.O. частота
аллеля
N.E. χ2 параметры
гетерозиготности
A66G A/A 4 0.2405 PA = 0.4625 ± 0.0557   8.56 8.3980
d.f. = 1
p < 0.01
He = 0.4972 ± 0.0120
Ho = 0.7250 ± 0.0706
D = 0.4592 ± 0.0863,
td = 3.1810,
p < 0.01
A/G 29 0.4051 19.89
G/G 7 0.3544 PG = 0.5375 ± 0.0557 11.56
40 1.0000 ne = 1.9888 ± 0.0120
Сравнение объединенных групп детей c временным и смешанным прикусом ДФК + СФК и КФК по распределению генотипов: G = 12.4539, d.f. = 2; p < 0.01.

Для детей с постоянным прикусом без патологии (N = 38) со средним возрастом 15.24 ± 0.23 в группах детей с ДФК + СФК и КФК не выявили различий ни по распределению генотипов по SNP A66G гена MTRR: G = 2.1347, d.f. = 2, ни по генотипу A/A: G = 1.9808, d.f. = 1.

Следовательно на основании полученных данных можно сделать вывод об ассоциации SNP A66G гена MTRR с ранним кариесом. Для носителей генотипа A/A среди детей с временным прикусом, а также среди детей с временным и смешанным прикусом достоверно повышен риск развития раннего кариеса в интенсивной форме (ДФК и СФК). Для носителей гетерозиготного генотипа A/G отмечена устойчивость к более интенсивной форме кариеса (КФК и СФК) как для детей с временным прикусом, так и для объединенной группы детей с временным и смешанным прикусом.

Несомненно, что полученные нами данные должны быть подтверждены на бóльших по объему выборках. Данную работу следует рассматривать как пилотное исследование. Достаточно высокие оценки достоверности установленных ассоциаций и специфический характер распределения уровня гетерозиготности в изученных группах, по мнению авторов, представляют научный интерес, а также предполагают необходимость дальнейшего изучения SNP A66G гена MTRR в связи с ранним кариесом и установления вероятного механизма данной ассоциации.

У объединенной группы детей с ВПР ЧЛО с временным и смешанным прикусом также были рассмотрены особенности распространения SNP A66G гена MTRR. Однако ассоциацию с кариесом не выявили. Различия как по распределению всех генотипов G = 1.4105, d.f. = 2, так и по распределению генотипов A/A: G = 1.3961, d.f. = 1 – недостоверны. Вероятно, установленная ассоциация G/G c развитием ВПР ЧЛО отчасти нивелирует возможность изучения этого маркера как маркера раннего кариеса в этой группе детей. Кроме того, для группы детей с ВПР ЧЛО с временным прикусом и объединенной группы детей с временным и смешанным прикусом средний возраст несколько выше, чем в аналогичных группах детей без врожденной патологии, соответственно 6.00 ± 0.21 и 8.05 ± 0.27, различия по возрасту в сравниваемых группах могут приводить к ошибкам в исследовании. Помимо этого, искажения в исследование могут быть привнесены за счет относительно небольшой выборки детей с ВПР ЧЛО и за счет получения информации о стоматологическом статусе детей, как из медицинских карт, так и за счет осмотра стоматологами. Для детей без патологии стоматологический статус определял один стоматолог, что исключает возможность расхождений в оценках стоматологического статуса. Кроме того, как упоминалось выше, для детей с ВПР ЧЛО отмечена множественная стоматологическая патология [19], что требует более специфичных критериев при оценке интенсивности кариеса.

Работа выполнена в рамках Государственного задания “Геномные исследования и генетический полиморфизм клетки, организма и популяции” № 0112-2019-0001.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Ballantine J.L., Carlson J.C., Ferreira A.G. et al. Exploring the genomic basis of early childhood caries: a pilot study // Intern. J. Paediatric Dentistry. 2018. V. 28. P. 217–225. https://doi.org/10.1111/ipd.12344

  2. Dixon M.J., Marazita M.L., Beaty T.H., Murray J.C. Cleft lip and palate: synthesizing genetic and environmental influences // Nat. Rev. Genet. 2011. V. 12. № 3. P. 167–178.

  3. Курбатова О.Л., Васильев Ю.А., Победоносцева Е.Ю. и др. Территориальное распределение частот врожденных расщелин губы и/или неба в Краснодарском крае в связи с загрязнением окружающей среды // Кубанский науч. мед. вестник. 2013. № 6. С. 111–113.

  4. Koruyucu M., Kasimoğlu Y., Seymen F. et al. Rethinking isolated cleft lip and palate as a syndrome // Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. 2018. V. 125. № 4. P. 307–312. https://doi.org/10.1016/j.oooo.2018.01.007

  5. Antonarakis G.S., Palaska P.K., Herzog G. Caries prevalence in non-syndromic patients with cleft lip and/or palate: a meta-analysis // Caries Res. 2013. V. 47. № 5. P. 406–413. https://doi.org/10.1159/000349911

  6. Antunes L.S., Tannure P.N., Antunes L.A. et al. Genetic association for caries susceptibility among cleft lip and/or palate individuals // J. Contemp. Dent. Pract. 2014. V. 1. № 15(3). P. 288–293.

  7. Rodrigues R., Fernandes M.H., Bessa Monteiro A. et al. Are there any solutions for improving the cleft area hygiene in patients with cleft lip and palate? A systematic review // Int. J. Dent. Hyg. 2019. V. 17. № 2. P. 130–141. https://doi.org/10.1111/idh.12385

  8. Гуленко О.В., Волобуев В.В., Васильев Ю.А. и др. Сравнительный анализ стоматологической заболеваемости и антиоксидантной защиты ротовой жидкости у детей, имеющих психоневрологические расстройства и врожденные расщелины губы и/или нёба // Росс. стоматол. журн. 2018. Т. 22. № 4. С. 188–192. https://doi.org/10.18821/1728-2802-2018-22-4-188-192

  9. Удина И.Г., Гуленко О.В. Молекулярно-генетические механизмы развития кариеса // Генетика. 2018. Т. 54. № 4. С. 426–434.

  10. Wang W., Jiao X.H., Wang X.P. et al. MTR, MTRR, and MTHFR gene polymorphisms and susceptibility to nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate // Genet. Test. Mol. Biomarkers. 2016. V. 20. № 6. P. 297–303. https://doi.org/10.1089/gtmb.2015.0186

  11. Waltrick-Zambuzzi M., Tannure P.N., Vieira T.C. et al. Genetic variants in folate and cobalamin metabolism-related genes in nonsyndromic cleft lip and/or palate // Braz. Dent. J. 2015. V. 2. № 6. P. 561–565. https://doi.org/10.1590/0103-6440201300394

  12. Antunes L.A., Machado C.M., Couto A.C. et al. A polymorphism in the MTRR gene is associated with early childhood caries and underweight // Caries Res. 2017. V. 51. № 2. P. 102–108. https://doi.org/10.1159/000451037

  13. Ouyang S., Li Y., Liu Z. et al. Association between MTR A2756G and MTRR A66G polymorphisms and maternal risk for neural tube defects: a meta-analysis // Gene. 2015. V. 515(2). P. 308–312. https://doi.org/10.1016/j.gene.2012.11.070

  14. Elizabeth K.E., Praveen S.L., Preethi N.R. et al. Folate, vitamin B12, homocysteine and polymorphisms in folate metabolizing genes in children with congenital heart disease and their mothers // Eur. J. Clin. Nutrition. 2017. V. 71. P. 1437–1441.

  15. Shi T.L., Wu Y., Li Y. et al. The relevance of MTHFR C677T, A1298C, and MTRR A66G polymorphisms with response to male infertility in Asians: A meta-analysis // Biosci. Rep. 2018. V. 7. № 38(6). pii: BSR20181160. https://doi.org/10.1042/BSR20181160

  16. Xu A., Wang W., Jiang X. et al. The roles of MTRR and MTHFR gene polymorphisms in congenital heart diseases: a meta-analysis // Biosci. Rep. 2018. V. 38(6). pii: BSR20181160.https://doi.org/10.1042/BSR20181160

  17. Wang Y., Liu Y., Ji W. et al. Analysis of MTR and MTRR polymorphisms for neural tube defects risk // Association Medicine. 2015. V. 94. № 35. e1367. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000001367

  18. Виноградова Т.Ф. Диспансеризация детей у стоматолога. М.: Медицина, 1988. 256 с.

  19. Rullo R., Festa V.M., Rullo R. et al. Prevalence of dental anomalies in children with cleft lip and unilateral and bilateral cleft lip and palate // Eur. J. Paediatr. Dent. 2015. V. 16. № 3. P. 229–232.

Дополнительные материалы отсутствуют.