Генетика, 2019, T. 55, № 2, стр. 136-145

Salmonella enterica подвид enterica серотип Enteritidis (S. Enteritidis) остается первым по значимости серотипом в этиологии сальмонеллезной инфекции у человека во многих странах мира [1] и в том числе России. Широко известно, что некоторые серотипы Salmonella enterica подвид enterica содержат серотипоспецифические плазмиды вирулентности [2]. Общим для всех известных плазмид вирулентности S. enterica подвид enterica является оперон spvRABCD размером 7.8 тпн, необходимый для развития системной инфекции на животных моделях [3]. S. Enteritidis содержит плазмиду вирулентности размером 59 тпн, обозначенную pSEV (plasmid Salmonella Enteritidis Virulence) [4]. По данным 25-летнего мониторинга за S. Enteritidis в РФ, около 94% клинических штаммов и 89% штаммов из окружающей среды содержат плазмиду вирулентности (наши неопубликованные данные).

Поскольку плазмиды вирулентности сальмонелл имеют значительный размер, их копийность низка (2–3 копии на клетку) и поэтому они более стабильны по сравнению с плазмидами меньшего размера [5]. Напротив, некоторые авторы полагают, что из-за малого числа копий плазмиды вирулентности их случайное распределение в дочерние клетки приводило бы к очень частой утрате плазмиды [6], однако этого не происходит. Гены на плазмиде вирулентности в основном хорошо охарактеризованы, но значимость некоторых из них до сих пор остается неясной.

У некоторых серотипов сальмонелл плазмиды вирулентности различны по размеру (например, S. Choleraesuis и S. Dublin) [4, 7]. Хорошо известно, что плазмиды вирулентности сальмонелл содержат специфичные репликоны FIB(S) и FII(S), которые представляют собой подгруппу плазмид IncF, без каких-либо генов антибиотикорезистентности [8]. В последние годы плазмиды, сочетающие в себе часть плазмиды вирулентности вместе с генами антибиотикорезистентности, обнаружены у некоторых серотипов сальмонелл (S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Dublin, S. Choleraesuis). Конъюгативные плазмиды, несущие кассеты вирулентности и антибиотикорезистентности, переносимые интегроном, были выделены в клинических изолятах S. Typhimurium [9]. Гибридная плазмида вирулентности–антибиотикорезистентности S. Enteritidis pUO-SeVR1 была обнаружена в клинических изолятах из Испании в 2003 г. [10]. Показано, что в эволюции таких гибридных плазмид S. Enteritidis основную роль играет инсерционная последовательность IS26 [11]. Слияние R‑плазмид с плазмидами вирулентности имеет большое значение для эволюции высоковирулентных и антибиотикорезистентных клонов S. Enterica [12].

Технологии секвенирования ДНК значительно продвинулись за последние десять лет, а экспоненциальный рост баз данных секвенированных геномов обеспечил возможность для сравнительного анализа геномных последовательностей. Тем не менее все еще существует проблема правильной аннотации геномов [13]. Большинство плазмидных и хромосомных последовательностей, доступных в GenBank, аннотировано автоматически без какой-либо последующей проверки. Этим продиктована необходимость в применении новых усовершенствованных методов для реаннотации с последующей проверкой перед выполнением любого сравнительного анализа геномов.

Предполагается, что S. Enteritidis приобрела плазмиду вирулентности путем горизонтального переноса от эволюционно далеких серотипов [14], но изучение эволюции плазмиды pSEV в S. Enteritidis до настоящего времени не было проведено. За последние несколько лет секвенированы плазмиды вирулентности из различных изолятов S. Enteritidis [15–17].

Цель данной работы – сравнительное изучение последовательностей плазмид вирулентности различных штаммов S. Enteritidis для оценки вариабельности размеров и состава плазмиды вирулентности, нахождения возможного предка pSEV и определение ее точного размера.

Бактериальные штаммы и плазмиды. Полные последовательности плазмид вирулентности 13 штаммов S. Enteritidis были отобраны из базы нуклеотидов NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/) (табл. 1). Для целей сравнения в анализ были включены последовательности двух предположительно гибридных плазмид вирулентности–антибиотикорезистентности: pFORC7 (Acc. No. CP009767) и pSEN-BT (Acc. No. LN879484), из штаммов S. Enteritidis FORC_007 и D7795 соответственно [18], поскольку они имели в своем составе spv-оперон. Для подтверждения принадлежности используемых штаммов к серотипу S. Enteritidis использован сайт SeqSero для проверки последовательности хромосомы, где это было возможно [19].

Реаннотация. Автоматическая реаннотация была выполнена с помощью программ GeneMarkS [20], Prodigal [21], AMIGene [22] и сервера RAST [23]. Комбинация нескольких программ для автоматической аннотации с применением мажоритарной системы с проверкой вручную позволила повысить точность предсказаний [24, 25]. Инсерционные последовательности (IS-элементы) и гены антибиотикорезистентности определяли с помощью программ IS Finder [26] и ResFinder [27] соответственно. Определение группы несовместимости проводили на сервере PlasmidFinder [8].

Сравнительная геномика. Выравнивание последовательностей полных плазмид выполняли в программах Mauve [28] и Kalign2 [29]. Транслированные кодирующие последовательности сравнивали с последовательностями известных белков с использованием BLASTP [30]. Ортологи определяли как транслированные кодирующие последовательности с гомологией >90% с известными последовательностями белков в базе данных NCBI. Филогенетическое родство плазмид выявляли с помощью программы MEGA6 [31].

Секвенирование ДНК показало, что точный размер плазмид вирулентности S. Enteritidis варьирует от 59 336 до 59 374 пн. Более половины плазмид (7 из 13) имели размер 59 372 пн. Эти данные соответствуют описанным ранее, в которых было установлено, что размер pSEV составляет 59 372 пн [12]. Нами было показано, что размер может изменяться в определенных пределах, в зависимости от наличия инделов. Все исследованные плазмиды имели два специфичных для плазмид вирулентности сальмонелл репликона – FIB(S) и FII(S) [8].

После множественного выравнивания с помощью программ Mauve и Kalign2 было установлено, что плазмида вирулентности из генома S. Enteritidis SEJ идентична консенсусной последовательности и использовалась в последующем в качестве референсной, что положительным образом повлияло на качество результатов реаннотации. Для автоматической реаннотации использованы четыре программы: GeneMarkS, Prodigal, AMIGene и RAST. Число выявленных открытых рамок считывания (ORF) приведено в табл. 1. Наименьшее число ORF было получено при использовании AMIGene, а наибольшее – при использовании RAST. Мы сравнили результаты оригинальной аннотации с полученной нами реаннотацией с применением мажоритарного подхода для более корректного определения позиции старт-кодонов выявленных ORF. Число ORF для плазмид вирулентности размером 59 372 пн определено нами как 81, в то время как в оригинальных аннотациях оно значительно колебалось – от 62 (для плазмиды штамма pCFSAN000006) до 103 (для плазмиды штамма pSLA5). Два генома плазмиды вирулентности (штаммы OLF-SE2-98984-6 и OLF-SE3-98983-4) были изначально депонированы неаннотированными, а также не имели названия для плазмид вирулентности. Кроме того, не было обнаружено никаких различий по нуклеотидному составу среди обеих плазмид. Список 81 ORF (предполагаемых кодирующих последовательностей) представлен в табл. 2. Из них белки с известной функцией составили 54 (66.7%), предполагаемые и гипотетические белки – 19 (23.4%) и мобильные элементы – 8 (9.9%). Поиск гомологов подтвердил наличие следующих кластеров (оперонов) генов: pef-оперон (плазмид-кодируемые фимбрии), неполный tra-оперон [5], spv-оперон, а также гены, кодирующие белки деления плазмиды (parA/parB), белки, участвующие в SOS-репарации (psiA/psiB, umuC/umuD), и белки системы токсин–антитоксин II типа (ccdA/ccdB).

Сравнение геномов показало, что плазмиды вирулентности из нескольких штаммов S. Enteritidis имели мутации (сдвиг рамки считывания), которые могут приводить к возможному образованию псевдогенов. В табл. 3 приведен список замен аминокислот и их возможный эффект на трансляцию белка. Плазмиды S. Enteritidis штаммов Durban, OLF-SE2-98984-6, OLF-SE3-98983-4 имели только мутации в межгенных регионах и не имели мутаций, которые могли бы повлиять на состав белков. Поэтому функционально они являются такими же, как и S. Enteritidis штамм SEJ, и имеют такой же размер.

Гибридная плазмида pSEN-BT из штамма S. Enteritidis D7795 содержит репликоны FIB(S) и FII(S), а также репликон IncQ1. Она имеет часть генов плазмиды вирулентности вместе с детерминантами антибиотикорезистентности для аминогликозидов (strAB), бета-лактамов (blaTEM-1B), сульфаниламидов (sul1 и sul2), тетрациклина (tetA) и триметоприма (dfrA7). Гибридная плазмида pFORC7 из штамма S. Enteritidis FORC_007 содержит только один репликон FIB(S) от плазмиды вирулентности и репликон IncX1. Однако нам не удалось обнаружить какие-либо детерминанты антибиотикорезистентности в плазмиде pFORC7 (табл. 1).

Полные последовательности 13 плазмид pSEV использовали для построения дерева по алгоритму максимального правдоподобия (ММП) в программе MEGA6 [31]. Неукорененное ММП-дерево показало, что предком плазмиды вирулентности в центре дерева является последовательность, идентичная последовательности S. Enteritidis штамма SEJ (рис. 1). Это подтверждает данные о том, что данная плазмида идентична консенсусной при множественном выравнивании. Кроме того, она не имеет мутаций и псевдогенов при сравнении с остальными 12 последовательностями плазмид. Из дерева видно, что две наиболее генетически отдаленные плазмиды это плазмиды вирулентности штаммов S. Enteritidis 18569 и LK5.

Рис. 1.

Неукорененное ММП-дерево, показывающее родство исследованных плазмид вирулентности штаммов S. Enteritidis.

Сравнение всех доступных к настоящему времени последовательностей плазмиды вирулентности S. Enteritidis показало, что они ограничены в размерах. Эти размеры варьируют от 59 336 до 59 374 пн, при этом более половины плазмид имеют размер, равный 59 372 пн. Состав генов является довольно консервативным и состоит из 81 открытой рамки считывания с признаками псевдогенизации некоторых генов у плазмид, отличающихся по размеру от 59 72 пн.

Таким образом, можно утверждать, что предком плазмиды вирулентности S. Enteritidis (pSEV) является плазмида из SEJ-подобного штамма [15] размером 56 372 пн с таким же нуклеотидным и генным составом, как и S. Enteritidis штамм SEJ. Последовательность этой плазмиды может быть использована как референсная плазмида вирулентности pSEV для всех последующих работ с использованием плазмиды вирулентности S. Enteritidis.

Таким образом, установлено, что плазмида вирулентности S. Enteritidis (pSEV) является консервативной, что затрудняет использование ее в качестве молекулярно-генетического маркера в методах, основанных на ПЦР и секвенировании.