Генетика, 2019, T. 55, № 3, стр. 273-279

В настоящее время EAST является одним из немногих охарактеризованных белков ядерного матрикса дрозофилы [1–3]. При физиологических условиях в интерфазных клетках EAST локализуется в межхромосомном пространстве ядер [1]. Увеличение концентрации EAST приводит к увеличению межхромосомного пространства и сокращению объема, занимаемого хромосомами. В структуре EAST предсказаны семь последовательностей сигналов ядерной локализации (NLS) и 12 сайтов протеолитических сигналов (PEST), что свидетельствует о разнообразных вариантах посттрансляционной модификации белка [1]. Ранее мы показали, что белок EAST функционально взаимодействует с инсулятором Su(Hw) [2, 3]. Инсулятор Su(Hw) был впервые обнаружен в 5'-нетранслируемой области (5'UTR) ретротранспозона МДГ4 (gypsy). Он состоит из 12 сайтов связывания белка Su(Hw) [4], который рекрутирует в состав комплекса белки Mod(mdg4)-67.2 и CP190 [5, 6]. Белок EAST напрямую взаимодействует с белками Mod(mdg4)-67.2 и CP190 [2]. Влияние EAST на инсуляторную и репрессионную активность Su(Hw)-зависимого комплекса было продемонстрировано на примере гена yellow [3].

Ген yellow отвечает за пигментацию кутикулярных структур дрозофилы [7]. В диком типе тело, крылья и щетинки мух окрашены в темный цвет. В аллеле y² ретротранспозон МДГ4 встроился между энхансерами тела и крыльев и промотором гена yellow. В этом случае инсулятор Su(Hw) полностью блокирует активацию экспрессии yellow в теле и крыльях, в результате чего они приобретают желтую окраску. Однако щетинки мух остаются пигментированными, так как энхансер щетинок расположен в интроне гена [8].

Инактивация белка Mod(mdg4)-67.2 вследствие делеции 145 ак С-концевого домена (мутация mod(mdg4)^u1) влияет на активность Su(Hw)-инсулятора и, с одной стороны, частично восстанавливает энхансер-промоторное взаимодействие, а с другой – превращает инсулятор в сайленсер. В линии y²;mod(mdg4)^u1/mod(mdg4)^u1 Su(Hw)-зависимая репрессия выражается в депигментации щетинок – они становятся желтыми [5, 9]. Интересно, что такую же тканеспецифичную репрессию транскрипции гена yellow в щетинках вызывает и суперэкспрессия белка EAST. В линии y²;P{w⁺; east⁺}/CyO;P{w⁺; east⁺}/TM6,Tb введение двух копий конструкции P{w⁺ east⁺}, экспрессирующей белок EAST, в аллель y² не влияет на окраску тела и крыльев, но приводит к полной депигментации щетинок [10]. Ранее мы показали, что при локализации трансгена в различных участках генома репрессия, обусловленная белком EAST, часто зависит от присутствия в составе трансгена последовательности длинного концевого повтора (ДКП) ретротранспозона МДГ4 [11]. В последовательности ДКП ретротранспозона МДГ4 был локализован инвертированный повтор, включающий сайт связывания белка Mad, ключевого компонента сигнального каскада TGF-β/BMP [12]. Результаты предыдущих работ [11, 12] позволяют предположить, что белок Mad рекрутирует на хроматин регуляторный комплекс, который не только функционально взаимодействует с белком EAST и усиливает EAST-зависимую репрессию, но и обусловливает локализацию трансгенов в репрессионных компартментах ядра.

Цель представленной работы состояла в изучении влияния геномной локализации трансгенов, содержащих Su(Hw)-инсулятор и последовательность ДКП из МДГ4, на репрессию, обусловленную Su(Hw)-зависимым комплексом, и EAST-зависимую репрессию. Для этого мы использовали созданные нами ранее [11] трансгенные линии дрозофил E(Su)(L^301dir)YW, E(Su)(L^301rev)YW, E(Su)(L⁹²)YW, E(Su)(L^5 × 92)YW и E(Su)YW (рис. 1), в которых соответствующий трансген был встроен в хромосому Х. Для получения коллекции линий, в которых перечисленные трансгены встроены в различные места генома, мы индуцировали транспозиции конструкций с хромосомы Х на аутосомы на фоне мутации mod(mdg4)^u1. В качестве источника Р-транспозазы [13] использовалась линия y²w¹¹¹⁸;P[ry⁺Δ2-3](99B),mod(mdg4)^u1/TM6,Tb. Самцы этой линии индивидуально скрещивались с пятью-шестью самками из трансгенных линий y²w¹¹¹⁸,P{y⁺w⁺};mod(mdg4)^u1/TM6,Tb, где P{y⁺w⁺} обозначает каждый из перечисленных трансгенов. Из потомков F₁ этого скрещивания отбирались самцы y²w¹¹¹⁸,P{y⁺w⁺};mod(mdg4)^u1/P[ry⁺Δ2-3](99B),mod(mdg4)^u1, которые в свою очередь скрещивались с самками y²w¹¹¹⁸, mod(mdg4)^u1/ mod(mdg4)^u1. Мухи гомо- и гемизиготные по мутации w¹¹¹⁸ имеют белые глаза. Самцы y²w¹¹¹⁸;mod(mdg4)^u1/ mod(mdg4)^u1 с транспозициями трансгена, маркированного геном miniwhite, на аутосому выявлялись в потомстве F₂ по изменению цвета глаз. Отбирались только самцы с окрашенными глазами. В результате мы получили коллекцию трансгенных линий с гомозиготной мутацией mod(mdg4)^u1 и проанализировали частоту проявления Su(Hw)-зависимой репрессии (рис. 1).

Рис. 1.

Проявление репрессии, опосредованной Su(Hw)-зависимым инсуляторным комплексом, в полученных в результате транспозиций трансгенных линиях. а – схематичное изображение последовательности ретротранспозона МДГ4 и последовательностей, использованных в конструкциях, изображенных ниже. Цифрами обозначены размеры ретротранспозона МДГ4 (gypsy) и его фрагментов в составе конструкций; пн – пары нуклеотидов; направление транскрипции МДГ4 показано стрелками; б – приведены схематичные изображения конструкций, на которых энхансер крыльев обозначен как W, энхансер тела – В, энхансер щетинок – Br, инсулятор Su(Hw) – Su. Направление транскрипции указано горизонтальными стрелками. Темно-серые вертикальные стрелки обозначают сайты связывания Cre-рекомбиназы loxР, белые вертикальные стрелки – сайты связывания FRT, узнаваемые рекомбиназой Flp. Буква E в названиях конструкций обозначает энхансеры тела и крыльев гена yellow. Под схемами конструкций представлены результаты фенотипического анализа мух в трансгенных линиях. “+” – линии, в которых на фоне мутации mod(mdg4)^u1 наблюдалась Su(Hw)-зависимая репрессия, “–” – линии, в которых такая репрессия не наблюдалась. Пигментация тела и крыльев у самцов обозначена цифрами от 5 – темная окраска, как в диком типе, до 2 – желтая окраска, соответствующая фенотипу аллеля у². Число трансгенных линий каждого фенотипа обозначено цифрами.

В подавляющем большинстве линий (от 90 до 98%) E(Su)(L^301dir)YW, E(Su)(L^301rev)YW и E(Su)(L^5 × 92)YW от 60 до 100% щетинок у мух имели желтую окраску, т.е. наблюдалась Su(Hw)-зависимая репрессия. В линиях E(Su)(L⁹²)YW и E(Su)YW Su(Hw)-зависимая репрессия наблюдалась лишь в половине случаев (55–51%). Интересно, что Su(Hw)-зависимая репрессия не была тесно связана с инсуляцией. Для каждой конструкции были получены линии с желтой окраской тела и крыльев, т.е. с эффективной инсуляцией, и линии с промежуточной или даже очень слабой инсуляцией, в которых тело и крылья мух имели темную окраску. При этом депигментация щетинок на фоне мутации mod(mdg4)^u1 наблюдалась в обоих случаях.

Затем мы протестировали частоту проявления EAST-зависимой репрессии в полученных линиях (табл. 1). Для каждой из тестируемых конструкций мы отобрали самцов из линий с разной степенью Su(Hw)-зависимой репрессии и скрестили их с самками линии y²w¹¹¹⁸;P{w⁺east⁺}/CyO; P{w⁺east⁺}/TM6,Tb, где P{w⁺east⁺} обозначает конструкцию, оверэкспрессирующую белок EAST. В F₁ потомстве этого скрещивания мы получили мух y²w¹¹¹⁸;P{w⁺east⁺}/+;P{w⁺east⁺}/P{y⁺w⁺},mod(mdg4)^u1 либо y²w¹¹¹⁸;P{w⁺east⁺}/P{y⁺w⁺}; P{w⁺east⁺}/ mod(mdg4)^u1. Мутация mod(mdg4)^u1 является рецессивной, поэтому в гетерозиготных по ней линиях Su(Hw)-зависимая репрессия не проявляется. Таким образом, депигментация щетинок в линиях, где суперэкспрессировался белок EAST, была связана только с EAST-зависимой репрессией. В результате EAST-зависимая репрессия возникала почти во всех линиях E(Su)(L^301dir)YW, E(Su)(L^301rev)YW и E(Su)(L^5 × 92)YW, где наблюдалась Su(Hw)-зависимая репрессия, и не проявлялась ни в одной линии, где на фоне мутации mod(mdg4)^u1 щетинки оставались черными (табл. 1). Среди линий E(Su)(L⁹²)YW и E(Su)YW обнаружились отдельные линии, в которых не проявлялась Su(Hw)-зависимая репрессия, но наблюдалась слабая EAST-зависимая репрессия, т.е. на фоне суперэкспрессии белка EAST около 30–40% щетинок у мухи становились непигментированными. При этом EAST-зависимая репрессия возникала только в половине mod(mdg4)^u1-чувствительных линий E(Su)YW.

Чтобы выяснить, не связана ли наблюдаемая репрессия с транспозициями конструкций в области репрессионного хроматина, мы выбрали линии с различной степенью Su(Hw)-зависимой и EAST-зависимой репрессии и картировали в них места встраивания соответствующих трансгенов (табл. 2). Для этого использовалась обратная ПЦР с последующим секвенированием амплифицированных последовательностей ДНК (стандартный протокол из Berkeley Drosophila Genome Project http://www.fruitfly.org/about/methods/inverse.pcr.html). Проанализировав полученные данные, мы не обнаружили какой-либо закономерности в геномном распределении линий с различной степенью репрессии. Также не наблюдалось зависимости между местом инсерции трансгена и силой инсуляции. Однако даже в линиях с ярко выраженной репрессией не наблюдалась специфическая репрессия маркирующего конструкции гена miniwhite. Следовательно, трансгены не были интегрированы в геномные районы, способные вызывать репрессию транскрипции, например в теломерные повторы, HP1-обогащенные эухроматиновые районы, области мобильных элементов или PREs (Polycomb Response Elements) [14–18].

Известно, что в интерфазе хромосомы занимают в пространстве ядра определенные локации – хромосомные территории. Расположение участков хромосом влияет на возможность протекания trans-взаимодействий и определяет активный или репрессированный статус геномного локуса [19, 20]. Перемещение участков хромосом между хромосомными территориями приводит к изменению активности генов [21, 22]. Например, активно транскрибирующийся на данной стадии развития ген может перемещаться во внутриядерные скопления транскрипционных комплексов, так называемые транскрипционные фабрики [23]. В свою очередь, инактивация транскрипции достигается привлечением локуса в репрессионные ядерные структуры.

Полученные результаты показывают, что в случае присутствия в составе конструкций E(Su)(L^301dir)YW, E(Su)(L^301rev)YW и E(Su)(L^5 × 92)YW фрагментов ДКП EAST-зависимая репрессия и Su(Hw)-зависимая репрессия возникают почти во всех трансгенных линиях. Следовательно, можно предположить, что обусловливающие, как было показано ранее, EAST-зависимую репрессию последовательности ДНК [11] способствуют встраиванию трансгена в локусы, находящиеся в наиболее доступной для репрессионных факторов области ядра, где возможны сборка и функционирование любых репрессионных комплексов.

При транспозиции конструкции E(Su)(L⁹²)YW, содержащей маленький фрагмент ДКП, недостаточный для обеспечения стабильной EAST-зависимой репрессии, и конструкции E(Su)YW, включающей только последовательность Su(Hw)-инсулятора, Su(Hw)-зависимая репрессия наблюдается лишь в половине линий. При этом в линиях E(Su)YW нет взаимосвязи между EAST-зависимой и Su(Hw)-зависимой репрессиями. Это свидетельствует о случайном характере транспозиций.

В сумме результаты работы доказывают, что на последовательность ДКП МГД4 рекрутируется белковый комплекс, который не только функционально взаимодействует с белком EAST, но и обусловливает локализацию трансгенов в репрессионных компартментах ядра. Такой комплекс может связываться с хроматином через белок Mad, сайт связывания которого в составе ДКП ретротранспозона МДГ4 был локализован нами ранее [12].

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 18-14-00295).