1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Генетика
  4. T. 56, № 5, 2020

Генетика, 2020, T. 56, № 5, стр. 592-601

Влияние нокаута гена THBS1 на формирование радиационно-индуцированного клеточного ответа в модельной системе in vitro

Р. Р. Савченко 1, *, С. А. Васильев 1, В. С. Фишман 2, Е. С. Сухих 3, 4, Л. Г. Сухих 4, А. А. Мурашкина 5, И. Н. Лебедев 1

1 Научно-исследовательский институт медицинской генетики, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук
634050 Томск, Россия

2 Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
630090 Новосибирск, Россия

3 Томский областной онкологический диспансер
634050 Томск, Россия

4 Национальный исследовательский Томский политехнический университет
634050 Томск, Россия

5 Национальный исследовательский Томский государственный университет
634050 Томск, Россия

* E-mail: renata.savchenko@medgenetics.ru

Поступила в редакцию 06.05.2019
После доработки 25.07.2019
Принята к публикации 30.07.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Проведен анализ влияния нокаута гена THBS1 на выживаемость опухолевых клеток человека, частоту спонтанных и радиационно-индуцированных микроядер, а также на профиль экспрессии генов в модельной системе in vitro. Показано, что клеточная линия HeLa, нокаутная по гену THBS1, характеризуется снижением способности к образованию колоний до и после облучения (в 1.4 раза, p = 0.0002 и в 1.7 раз, p = 0.00009 соответственно), повышением частоты спонтанных и радиационно-индуцированных микроядер (в 1.9 раз, p = 0.02 и в 2.5 раза, p = 0.01 соответственно) и дифференциальной экспрессией генов, участвующих в процессах апоптоза, репарации ДНК и контроле клеточного цикла на стадии G2/M. Таким образом, нокаут гена THBS1 приводит к повышению радиочувствительности клеток HeLa в модельной системе in vitro, что свидетельствует о возможной роли данного гена в регуляции радиационно-индуцированного клеточного ответа.

Ключевые слова: радиочувствительность, CRISPR/Cas9, THBS1, HeLa, репарация ДНК.

Воздействие ионизирующего излучения на клетки человека вызывает значительные повреждения генетического материала, приводящие к гибели клеток и индукции мутаций. Способность клеток восстанавливать поврежденные молекулы ДНК, обеспечивать нормальное функционирование сигнальных путей, контрольных точек клеточного цикла и запуск программы апоптоза варьирует на уровне различных типов клеток, тканей и целых организмов, составляя феномен индивидуальной радиочувствительности. Известно, что в основе данного феномена лежат генетические причины, такие как вариации на уровне последовательности ДНК или экспрессии генов репарации ДНК, а также метаболизма ксенобиотиков и антиоксидантной защиты [1]. Известно, что клетки, нокаутные по генам, продукты которых участвуют в процессах репарации ДНК, характеризуются повышенной радиочувствительностью [2], однако нарушение работы данных генов значительно снижает жизнеспособность организма и приводит к гибели или формированию наследственных синдромов, в частности синдрома Ниймегена, пигментной ксеродермы, атаксии-телеангиэктазии и ряда других [3, 4]. Поэтому, вероятно индивидуальную радиочувствительность здоровых индивидов определяют гены с менее выраженным влиянием на жизнеспособность, например косвенные участники радиационно-индуцированного ответа, преимущественно обеспечивающие сигнальные функции.

Проведенные нами ранее эксперименты позволили выявить связь дифференциальной экспрессии гена THBS1 у индивидов с различным спонтанным уровнем фокусов белков репарации γH2AX и частотой радиационно-индуцированных микроядер в лимфоцитах периферической крови человека [5]. Ген THBS1 кодирует тромбоспондин-1 – гомотримерный гликопротеин внеклеточного матрикса, С-терминальный домен которого обеспечивает связывание с рецептором CD47 [6]. По данным базы The Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/), THBS1 экспрессируется практически во всех тканях организма, включая опухолевые клетки различного происхождения, а кодируемый им белок участвует в реализации сигнальных путей, таких как пути TGFβ [7–11], VEGF [12, 13], NO-сигнальный путь [14, 15] и некоторые другие. Так, взаимодействуя с рецепторами CD47 и CD36, тромбоспондин-1 выступает эндогенным ингибитором ангиогенеза через негативную регуляцию NO-опосредованной передачи сигналов в эндотелиальных клетках, гладкомышечных клетках кровеносных сосудов и тромбоцитах [16–19]. Кроме того, связывание тромбоспондина-1 с рецептором CD47 может ингибировать как ранние активирующие сигналы эндотелиальной синтазы оксида азота, так и независимую от оксида азота передачу сигналов через рецептор фактора роста эндотелия сосудов 2 (VEGFR2), что также приводит к подавлению ангиогенеза [12, 13]. Помимо эффектов, реализуемых через взаимодействия с CD47, центральная область тромбоспондина-1, называемая 3TSR, может связываться с мембранным рецептором CD36, что также влечет за собой ингибирование ангиогенеза [20].

Кроме влияния на ангиогенез, тромбоспондин-1 регулирует ряд процессов, связанных с поведением и устойчивостью опухолевых клеток к терапии. Среди них адгезия [21] и пролиферация опухолевых клеток [22], выживание или апоптоз [23–25], опухолевая инвазия и метастазирование [26, 27], воспаление, иммунный ответ [28] и ответ опухоли на терапию [21, 29]. Влияние тромбоспондина-1 на эти процессы является многогранным и часто противоположным в зависимости от его концентрации, происхождения опухоли, а также молекулярного и клеточного состава ее микроокружения. Так например было показано, что связывание тромбоспондина-1 с рецептором CD47 вызывает гибель опухолевых клеток при раке молочной железы [23], но блокирует апоптоз и способствует развитию лекарственной устойчивости клеток карциномы щитовидной железы [25]. Кроме того, описано селективное действие тромбоспондина-1 на здоровые и опухолевые ткани. В исследовании J.S. Isenberg с соавт. отмечалось, что мыши с нокаутом гена Thbs1, сохраняли радиочувствительность опухолевых тканей, демонстрируя при этом снижение гибели мышечных клеток и клеток костного мозга через 12 часов после облучения, а также минимальные радиационные повреждения кожных покровов и мышц через два месяца после воздействия радиацией [30]. Схожие эффекты были характерны и для мышей, лишенных рецептора CD47 [30]. В связи с этим, целью настоящего исследования был анализ влияния нокаута гена THBS1 на выживаемость, частоту спонтанных и радиационно-индуцированных микроядер, а также полнотранскриптомный профиль экспрессии генов в модельной системе in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Создание нокаутной клеточной линии

Клеточная линия с нокаутом гена THBS1 была получена на основании исходной линии HeLa, любезно предоставленной к.б.н. М.А. Булдаковым (НИИ онкологии Томского НИМЦ РАН). Нокаутная клеточная линия была создана с помощью технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 путем введения в последовательность гена THBS1 мутации, приводящей к отсутствию нормального продукта транскрипции. Олигонуклеотиды, содержащие целевую последовательность sgRNA и липкие концы для встраивания в плазмиду, были синтезированы в ООО “Биоссет” (г. Новосибирск). Подбор последовательностей sgRNA производился с помощью биоинформационного ресурса sgRNAScorer (https://crispr.med.harvard.edu/ sgRNAScorer/). Для повышения эффективности введения мутаций были одновременно использованы две последовательности sgRNA, представленные в табл. 1. В качестве вектора для клонирования был использован gRNA cloning vector BsmBI.

Таблица 1.  

Олигонуклеотиды, использованные для создания и анализа клеточной линии с нокаутом гена THBS1

Наименование Последовательность
THBS1_gRNA1_F 5'-CACCGTGACATCTTTGAACTCACCGGTT-3'
THBS1_gRNA1_R 5'-CTAAAACCGGTGAGTTCAAAGATGTCAC-3'
THBS1_gRNA2_F 5'-CACCGTCTGGGCGCCGACTGGTGAAGTT-3'
THBS1_gRNA2_R 5'-CTAAAACTTCACCAGTCGGCGCCCAGACC-3'
THBS1_F 5'-ACTTTGTGTTCTCTCCTGTCTAA-3'
THBS1_R 5'-GCATCCTCGATGCGGAAA-3'
THBS1_exp_F 5'-CCAATGCCACAGTTCCTGA-3'
THBS1_exp_R 5'-TTGCCACAGCTCGTAGAACA-3'
ACTB_F 5'-GAGAAGATGACCCAGATCATGTT-3'
ACTB_R 5'-ATAGCACAGCCTGGATAGCAA-3'
GAPDH_F 5'-GCCAGCCGAGCCACATC-3'
GAPDH_R 5'-GGCAACAATATCCACTTTACCAGA-3'

Примечание. THBS1_gRNA – последовательности sgRNA прямой и обратной цепи (два варианта), полужирным шрифтом выделены последовательности sgRNA; THBS1_F(R) – праймеры, фланкирующие сайты редактирования, использованные для таргетного массового параллельного секвенирования; THBS1_exp_F(R), ACTB_F(R) и GAPDH_F(R) – праймеры для оценки экспрессии гена THBS1 и референсных генов ACTB и GAPDH в нокаутной клеточной линии с помощью количественной ПЦР в реальном времени.

Последовательность фрагментов гена, содержащих мутации, была установлена с помощью таргетного секвенирования нового поколения на секвенаторе MiSeq с использованием олигонуклеотидных праймеров (табл. 1) и набора секвенирующих реагентов MiSeq Nano v2 (Illumina, США). Полученные риды картировались на исходную последовательность ампликонов на базе геномной сборки hg38.

Воздействие ионизирующим излучением

Воздействие γ-излучением проводилось с мощностью дозы 1 Гр/мин при комнатной температуре в дозах 2, 4, 6 и 8 Гр для оценки способности клеток к образованию колоний, а также в дозе 2 Гр для оценки частоты микроядер и уровня экспрессии генов. Облучение проводили на базе Областного онкологического диспансера (г. Томск) на гамма-терапевтическом аппарате Theratron Equinox (Best Theratronics, Канада). Транспортировка клеток осуществлялась на льду.

Анализ способности клеток к образованию колоний

Клеточную линию HeLa и линию с нокаутом гена THBS1 культивировали в питательной среде DMEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США) при 37°С в условиях 5%-ного CO2. Для оценки способности клеток к образованию колоний клеточные культуры растили во флаконах Т-25 (TPP, Швейцария) в течение двух пассажей до 70% площади покрытия, после чего производили пересев в шестилуночные планшеты (TPP, Швейцария) в количестве 0.6 × 106 клеток/мл. Затем клетки подвергали воздействию γ-излучения, после которого клетки снимались трипсином с последующим подсчетом и посевом в новые шести-луночные планшеты. Далее клеточные линии культивировали в CO2-инкубаторе (Panasonic, Япония) при 37°С со сменой среды каждые трое суток. По истечении двух недель колонии фиксировались метанол-уксусной кислотой (3 : 1) с последующей инкубацией с красителем Гимза (ПанЭко, Россия). Число колоний оценивалось визуально, после чего по следующей формуле вычислялась эффективность посева (ЭП):

${\text{ЭП}} = \frac{{{\text{Кол - во}}\,\,{\text{колоний}}\,\,{\text{на}}\,\,{\text{14 - й}}\,\,{\text{день}}}}{{{\text{Исходное}}\,\,{\text{кол - во}}\,\,{\text{клеток}}}} \times 100\% .$

Анализ частоты микроядер

Для оценки частоты микроядер для каждой клеточной линии было подготовлено по два флакона T‑25 (TPP, Швейцария), содержащих 1 × 106 клеток. После облучения была проведена смена питательной среды, после чего флаконы с клеточными культурами были перенесены в CO2-инкубатор на 24 ч при 37°С. По истечении 24 ч клетки фиксировались с использованием метанол-уксусной кислоты (3 : 1).

Препараты микроядер были изготовлены путем раскапывания на предметные стекла 20 мкл полученной клеточной суспензии с последующим заключением в среду Vectashield, содержащую краситель DAPI (VectorLab, США), под покровные стекла. Частота микроядер оценивалась с помощью микроскопа Axio Imager Z2 (Zeiss, Германия) с автоматической системой регистрации препаратов Metafer (Metasystems, Германия) при увеличении 630×. Для каждой клеточной линии была оценена частота микроядер в 1000 облученных и 2000 необлученных клеток.

Анализ экспрессии генов

Культивирование клеточных линий для эксперимента по оценке экспрессии генов было проведено в тех же условиях, что и в описанных выше экспериментах. После облучения клеточные линии помещали в CO2-инкубатор на 30 мин при 37°С. По истечении 30 мин из флаконов с клеточными линиями удаляли среду для культивирования, проводили отмывку в фосфатном буфере (1× PBS), лизировали клетки с помощью реагента “Лира” (Биолабмикс, Россия) и проводили выделение РНК по протоколу, рекомендованному производителем. После выделения образцы РНК были очищены с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) с последующей оценкой качества на биоанализаторе Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, США).

Полученная РНК была использована для оценки экспрессии генов в исходной клеточной линии HeLa и в линии с нокаутом гена THBS1 до облучения и через 30 мин после воздействия γ-излучения в дозе 2 Гр. Мечение и гибридизация на экспрессионных микрочипах SurePrint G3 Human Gene Expression v2 8 × 60 K (Agilent Technologies, США) были проведены по протоколу, рекомендованному производителем (версия 6.9.1 от декабря 2015 г.).

Для анализа экспрессии гена THBS1 в нокаутной клеточной линии HeLa с помощью ПЦР в реальном времени была проведена обратная транскрипция с использованием набора реактивов ОТ-M-MuLV-RH (Биолабмикс, Россия) по протоколу, рекомендованному производителем. Реакция ПЦР в реальном времени проводилась на амплификаторе AriaMx (Agilent Technologies, США) с использованием синтезированных праймеров (табл. 1) и буфера для проведения количественной ПЦР в реальном времени БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue (Биолабмикс, Россия) по протоколу производителя. В качестве референсных генов были использованы гены домашнего хозяйства ACTB и GAPDH (табл. 1).

Исследование было выполнено на базе Центра коллективного пользования “Медицинская геномика” НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ.

Статистическая обработка

Статистический анализ данных, полученных в экспериментах по оценке способности клеток к формированию колоний и частоты микроядер, был проведен с помощью t-критерия Стьюдента в программном пакете Statistica 10 (Statsoft). Статистическая обработка результатов полнотранскриптомного экспрессионного анализа была проведена с помощью программной среды R для статистического анализа с использованием программы Limma от Bioconductor на log2-трансформированных данных при условии фоновой коррекции необработанных данных чипов и межчиповой квантильной нормализации. Статистический анализ различий уровня экспрессии в каждой группе сравнения был проведен с помощью модифицированного t-критерия Стьюдента с оценкой значений доли ложноположительного предсказания (False Discovery Rate – FDR) и поправкой на множественность сравнения по методу Бенджамини–Хохберга. Были сформированы списки генов, экспрессия которых статистически значимо (p ≤ 0.05) изменялась более чем в два раза по сравнению с исходной линией HeLa, а также два списка, полученных после применения поправки на множественность сравнения Бенджамини–Хохберга (FDR < 0.4 и FDR < 0.05). Кроме того, с помощью инструмента STRING (https://string-db.org/) для дифференциально экспрессирующихся генов были построены сети функциональных взаимодействий на уровне белков.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В настоящем исследовании была получена клеточная линия HeLa с нокаутом гена THBS1. Применение таргетного секвенирования нового поколения позволило установить характер мутаций, внесенных в ген THBS1 с помощью технологии редактирования генома CRISPR/Cas9. Было установлено, что полученная клеточная линия HeLa является компаундной гетерозиготой по различным мутациям в экзоне 3 гена THBS1 (рис. 1,а). Так, один из аллелей характеризовался делецией нуклеотида, приводящей к сдвигу рамки считывания на протяжении 37 пн, после чего инсерция другого нуклеотида выравнивала рамку считывания (49.3% прочтений, среднее покрытие – 73 прочтения на нуклеотид). В результате внесения данных мутаций была изменена последовательность из 13 аминокислотных остатков (37–49). Второй аллель характеризовался делецией 39 пн, что приводило к потере тех же 13 аминокислотных остатков в конечном белковом продукте (45.2% прочтений). Полногеномное секвенирование с целью поиска нецелевых мутаций не проводилось, что оставляет потенциальную возможность введения дополнительных неохарактеризованных мутаций.

Рис. 1.

Нокаут THBS1 и его влияние на способность клеток к формированию колоний и частоту радиационно-индуцированных микроядер в клеточной линии HeLa. а – последовательность мутаций, введенных в ген THBS1, wt – референсная последовательность, красным шрифтом выделены направляющие РНК, подчеркнуты участки мотива смежного с протоспейсером (protospacer adjacent motif, PAM); б – экспрессия гена THBS1 в исходной и нокаутной клеточной линии HeLa; в – частота микроядер в клеточной линии с нокаутом гена THBS1 по сравнению с исходной клеточной линией HeLa до и после облучения, p < 0.05; г – эффективность посева в клеточной линии с нокаутом THBS1 по сравнению с исходной клеточной линией HeLa до и после облучения, p < 0.01.

Анализ мутаций в гене THBS1 с помощью ресурса MutationTaster (http://www.mutationtaster.org/) показал прогнозируемую потерю домена, связывающего гепарин, а также возможную потерю функций остальных доменов вследствие изменения сайта сплайсинга. Таким образом, мутации в гене THBS1 в нокаутной клеточной линии HeLa вероятно приводят к существенным изменениям функции кодируемого белка. Кроме того, с помощью ПЦР в реальном времени было показано, что полученная нокаутная клеточная линия характеризуется снижением экспрессии гена THBS1 в 5.6 раз (p = 0.000002) по сравнению с исходной клеточной линией HeLa (рис. 1,б).

Эффективность посева, характеризующая способность клеток к формированию колоний, в необлученных клетках с нокаутом гена THBS1 была снижена в 1.4 раза (p = 0.0002) по сравнению с интактной линией HeLa и в 1.7 раз (p = 0.00009) после облучения в дозе 2 Гр, но не отличалась от эффективности посева в контроле при облучении более высокими дозами (рис. 1,г).

Частота спонтанных микроядер в нокаутной клеточной линии была в 1.9 раз (p = 0.02) выше, чем в интактной линии HeLa. Кроме того, после облучения в дозе 2 Гр в линии с нокаутом гена THBS1 частота радиационно-индуцированных микроядер в 2.5 раза превышала таковую в интактной клеточной линии HeLa (p = 0.01) (рис. 1,в).

Анализ транскрипционного профиля позволил зарегистрировать в нокаутной клеточной линии значимые изменения экспрессии 43 генов до облучения (23 гена повышали и 20 генов снижали уровень экспрессии), и 69 генов после облучения в дозе 2 Гр (36 гена повышали и 33 гена снижали уровень экспрессии) по сравнению с исходной клеточной линией HeLa (p < 0.05). После применения поправки на множественность сравнения оба списка были сокращены до семи генов (FDR < 0.40) (табл. 2).

Таблица 2.  

Дифференциально экспрессирующиеся гены в клеточной линии с нокаутом гена THBS1 по сравнению с исходной клеточной линией HeLa

0 Гр 2 Гр
повышение экспрессии
(FDR < 0.4) 		снижение экспрессии
(FDR < 0.4) 		повышение экспрессии (FDR < 0.4) снижение экспрессии
(FDR < 0.4)
SEPP1 lnc-MRPL39-4 LOC100506178 FAM124A
TESC FAM124A LIF* ENST00000549261*
LIF* ENST00000549261* TESC EPB41L3
  GAGE7*   GAGE7*

* – FDR < 0.05.

Для генов, дифференциально экспрессирующихся в клеточной линии с нокаутом THBS1 (отличия более чем в 2 раза, p < 0.05) с помощью инструмента STRING был проведен анализ значимых функциональных взаимодействий (score > 0.9) с генами, участвующими в процессах репарации ДНК, апоптоза и в работе G2/M контрольной точки клеточного цикла (база данных Molecular Signatures Database v6.2, http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp). Было показано, что ряд генов, дифференциально экспрессирующихся при нокауте гена THBS1, имеют значимые связи с данными процессами на уровне белков (табл. 3, рис. 2).

Таблица 3.  

Дифференциально экспрессирующиеся гены в клеточной линии с нокаутом гена THBS1, связанные с процессами репарации ДНК, апоптозом и работой контрольной точки клеточного цикла на стадии G2/M

Апоптоз Репарация ДНК Контрольная точка G2/M
0 Гр 2 Гр 0 Гр 2 Гр 0 Гр 2 Гр
CDK14 ↓ CDK14 ↓ CEP83 ↑ CSTF2T ↓ CDK14 ↓ CDK14 ↓
ESR2 ↓ COG5 ↓ CSTF2T ↓ NXF1 ↓ CSTF2T ↓ CSTF2T↓
HBS1L ↓ HLA-DPA1 ↓ HIF3A ↑ PRKDC ↓ HBS1L ↓ NXF1 ↓
HIF3A ↑ HLA-DPB1 ↓ HLA-DPA1 ↓ RFC3 ↓ HIF3A ↑ PRKDC ↓
HLA-DPA1↓ HLA-DQB1 ↓ HLA-DPB1 ↓     RFC3 ↓
HLA-DRA ↓ HLA-DRA ↓ HLA-DQB1 ↓      
NCALD ↑ IFI44L ↓ HLA-DRA ↓      
NGEF ↑ NGEF ↑ RNASET2 ↑      
SEPP1 ↑ NXF1 ↓        
  PRKDC ↓        
  RFC3 ↓        
  SEPP1 ↑        
  SPTBN1 ↓        

Примечание. Cтрелками показано изменение экспрессии в клеточной линии с нокаутом гена THBS1 по сравнению с исходной клеточной линией HeLa: ↑ – повышение экспрессии, ↓ – снижение экспрессии.

Рис. 2.

Связи продуктов генов, изменяющих экспрессию в клеточной линии с нокаутом гена THBS1, с кластером белков репарации ДНК. Толщина линий пропорциональна силе связи. Серой заливкой обозначены продукты генов, дифференциально экспрессирующиеся в клеточной линии с нокаутом THBS1; белой заливкой обозначены белки, участвующие в процессах репарации ДНК.

ОБСУЖДЕНИЕ

Снижение эффективности посева в линии с нокаутом гена THBS1, наблюдаемое нами до облучения и после воздействия γ-излучения только в дозе 2 Гр, свидетельствует о влиянии нокаута данного гена на способность клеток к образованию колоний. Однако остается неясным, реализуется ли этот эффект через механизмы клеточной гибели или через нарушение процесса клеточного деления.

Среди генов, повышающих экспрессию при нокауте гена THBS1, были SEPP1, LIF и TESC (табл. 2), потенциально связанные с радиочувствительностью и выживаемостью клеток. Ген SEPP1 кодирует селенопротеин – антиоксидантный белок, активирующийся в ответ на воздействие радиации. Было показано, что нокдаун SEPP1 приводит к окислительному стрессу и снижению жизнеспособности миофибробластов, в то время как сверхэкспрессия данного гена влечет за собой снижение уровня поздних активных форм кислорода [31]. Повышенная экспрессия гена LIF, кодирующего цитокин из семейства ИЛ-6, способствовала росту и развитию радиорезистентности опухолевых клеток карциномы носоглотки in vitro [32]. Ген TESС, высоко экспрессирующийся в некоторых опухолевых клетках, кодирует Ca2+-связывающий белок, участвующий в процессах клеточного роста и дифференцировки [33]. Ген GAGE7, характеризующийся снижением экспрессии в нокаутной клеточной линии в нашем исследовании, кодирует опухолевый антиген 7. Повышенная экспрессия данного гена в клетках HeLa вызывает устойчивость к апоптозу, индуцированному fas-лигандом [34].

Нокаут гена THBS1 приводил не только к снижению способности клеток к образованию колоний, но и к повышению частоты спонтанных и радиационно-индуцированных микроядер по сравнению с исходной клеточной линией HeLa. Наблюдаемый фенотип может быть обусловлен нарушением процессов репарации ДНК или нарушением работы G2/M контрольной точки клеточного цикла в нокаутной клеточной линии. Так например ген PRKDC, снижающий экспрессию в линии с нокаутом THBS1 в нашем исследовании, кодирует каталитическую субъединицу ДНК-зависимой протеинкиназы – фермента, играющего ключевую роль в процессах репарации двунитевых разрывов ДНК и регуляции клеточной радиочувствительности [35]. Согласно литературным данным, нокдаун гена PRKDC приводит к нарушению функции ДНК-зависимой протеинкиназы и фенотипу, характерному для клеточного старения после облучения опухолевых клеток человека [36]. Кроме того, мутации данного гена были обнаружены у пациентов с нарушениями репарации двухцепочечных разрывов ДНК и процессов рекомбинации [37]. Обращают на себя внимание также гены NXF1, RFC3, CDK14 и ESR2, характеризующиеся сниженной экспрессией при нокауте THBS1. Так продукт гена NXF1 участвует в процессе экспорта зрелой мРНК из ядра в цитоплазму [38], ген RFC3 – кодирует субъединицу фактора репликации С, нокдаун данного гена ингибирует пролиферацию опухолевых клеток при аденокарциноме пищевода [39]. CDK14 кодирует белок из семейства циклин-зависимых киназ, участвующих в регуляции клеточного цикла [40], а через активацию рецептора эстрогена 2, кодируемого геном ESR2, реализуется антиапоптотическое действие в клетках медуллобластомы [41, 42].

Таким образом, тромбоспондин-1 является важным компонентом клеточного микроокружения. На основании полученных нами данных, можно предположить, что данный белок играет роль в формировании радиационно-индуцированного клеточного ответа, участвуя в процессах, приводящих к изменению эффективности репарации повреждений ДНК, нарушениям в контроле клеточного цикла на стадии G2/M и запуску программы апоптоза.

Исследование выполнено при поддержке гранта Президента Российской Федерации МК-5944.2018.4.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Andreassen C.N. Searching for genetic determinants of normal tissue radiosensitivity – are we on the right track? // Radiotherapy and Oncol. 2010. V. 97. № 1. P. 1–8. https://doi.org/10.1016/j.radonc.2010.07.018

  2. Guo Z., Shu Y., Zhou H. et al. Radiogenomics helps to achieve personalized therapy by evaluating patient responses to radiation treatment // Carcinogenesis. 2015. V. 36. № 3. P. 307–317. https://doi.org/10.1093/carcin/bgv007

  3. Surrallés J., Jackson S.P., Jasin M. et al. Molecular cross-talk among chromosome fragility syndromes // Genes & Development. 2004. V. 18. № 12. P. 1359–1370. https://doi.org/10.1101/gad.1216304

  4. Chrzanowska K.H., Gregorek H., Dembowska-Bagińska B. et al. Nijmegen breakage syndrome (NBS) // Orphanet J. Rare Diseases. 2012. V. 7. № 1. P. 13. https://doi.org/10.1186/1750-1172-7-13

  5. Васильев С.А. Особенности спонтанного и индуцированного мутагенеза в соматических клетках человека с различным эпигенетическим фоном: Дис. … д-ра биол. наук. Томск: ФГБНУ “Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук”, 2018. 332 с.

  6. Isenberg J.S., Annis D.S., Pendrak M.L. et al. Differential interactions of thrombospondin-1, -2, and -4 with CD47 and effects on cGMP signaling and ischemic injury responses // J. Biol. Chem. 2009. V. 284. № 2. P. 1116–1125. https://doi.org/10.1074/jbc.M804860200

  7. Murphy-Ullrich J.E., Poczatek M. Activation of latent TGF-β by thrombospondin-1: mechanisms and physiology // Cytokine & Growth Factor Rev. 2000. V. 11. № 1–2. P. 59–69.

  8. Daniel C., Wiede J., Krutzsch H.C. et al. Thrombospondin-1 is a major activator of TGF-β in fibrotic renal disease in the rat in vivo // Kidney International. 2004. V. 65. № 2. P. 459–468.

  9. Nör J.E., DiPietro L., Murphy-Ullrich J.E. et al. Activation of latent TGF-β1 by Thrombospondin-1 is a major component of wound repair // Oral Biosci. & Med.: OBM. 2005. V. 2. № 2. P. 153.

  10. Sweetwyne M.T., Murphy-Ullrich J.E. Thrombospondin-1 in tissue repair and fibrosis: TGF-β-dependent and independent mechanisms // Matrix Biol. 2012. V. 31. № 3. P. 178–186. https://doi.org/10.1016/j.matbio

  11. Daubon T., Léon C., Clarke K. et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development // Nature Communications. 2019. V. 10. №  1. P. 1146. https://doi.org/10.1038/s41467-019-08480-y

  12. Kaur S., Martin-Manso G., Pendrak M.L. et al. Thrombospondin-1 inhibits VEGF receptor-2 signaling by disrupting its association with CD47 // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. № 50. P. 38923–38932. https://doi.org/10.1074/jbc.M110.172304

  13. Soto-Pantoja D.R., Kaur S., Roberts D.D. CD47 signaling pathways controlling cellular differentiation and responses to stress // Critical Rev. Biochem. Mol. Biol. 2015. V. 50. № 3. P. 212–230. https://doi.org/10.3109/10409238.2015.1014024

  14. Zhao H., Han Z., Ji X. et al. Epigenetic regulation of oxidative stress in ischemic stroke // Aging Disease. 2016. V. 7. № 3. P. 295. https://doi.org/10.14336/AD.2015.1009

  15. Roberts D.D., Kaur S., Isenberg J.S. Regulation of cellular redox signaling by matricellular proteins in vascular biology, immunology, and cancer // Antioxidants & Redox Signaling. 2017. V. 27. № 12. P. 874–911. https://doi.org/0.1089/ars.2017.7140

  16. Isenberg J.S., Frazier W.A., Roberts D.D. Thrombospondin-1: a physiological regulator of nitric oxide signaling // Cell Mol. Life Sci. 2008. V. 65. № 5. P. 728–742. https://doi.org/10.1007/s00018-007-7488-x

  17. Isenberg J.S., Martin-Manso G., Maxhimer J.B. et al. Regulation of nitric oxide signalling by thrombospondin-1: Implications for anti-angiogenic therapies // Nat. Rev. Cancer. 2009. V. 9. № 3. P. 182. https://doi.org/10.1038/nrc2561

  18. Isenberg J.S., Shiva S., Gladwin M. Thrombospondin-1–CD47 blockade and exogenous nitrite enhance ischemic tissue survival, blood flow and angiogenesis via coupled NO–cGMP pathway activation // Nitric Oxide. 2009. V. 21. № 1. P. 52–62. https://doi.org/10.1016/j.niox.2009.05.005

  19. Zhang X., Kazerounian S., Duquette M. et al. Thrombospondin-1 modulates vascular endothelial growth factor activity at the receptor level // The FASEB Journal. 2009. V. 23. № 10. P. 3368–3376. https://doi.org/10.1096/fj.09-131649

  20. Jeanne A., Schneider C., Martiny L. et al. Original insights on thrombospondin-1-related antireceptor strategies in cancer // Frontiers in Pharmacology. 2015. V. 6. P. 252. https://doi.org/10.3389/fphar.2015.00252

  21. Li S.S., Liu Z., Uzunel M. et al. Endogenous thrombospondin-1 is a cell-surface ligand for regulation of integrin-dependent T-lymphocyte adhesion // Blood. 2006. V. 108. № 9. P. 3112–3120. https://doi.org/10.1182/blood-2006-04-016832

  22. Sick E., Jeanne A., Schneider C. et al. CD47 update: a multifaceted actor in the tumour microenvironment of potential therapeutic interest // Brit. J. Pharmacol. 2012. V. 167. № 7. P. 1415–1430. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2012.02099.x

  23. Manna P.P., Dimitry J., Oldenborg P.A., Frazier W.A. CD47 augments Fas/CD95-mediated apoptosis // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. № 33. P. 29637–29644. https://doi.org/10.1074/jbc.M500922200

  24. Saumet A., Slimane M.B., Lanotte M. et al. Type 3 repeat/C-terminal domain of thrombospondin-1 triggers caspase-independent cell death through CD47/αvβ3 in promyelocytic leukemia NB4 cells // Blood. 2005. V. 106. № 2. P. 658–667. https://doi.org/10.1182/blood-2004-09-3585

  25. Rath G.M., Schneider C., Dedieu S. et al. The C-terminal CD47/IAP-binding domain of thrombospondin-1 prevents camptothecin-and doxorubicin-induced apoptosis in human thyroid carcinoma cells // Biochim. Biophys. Acta (BBA)-Mol. Cell Res. 2006. V. 1763. № 10. P. 1125–1134. https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2006.08.001

  26. Jayachandran A., Anaka M., Prithviraj P. et al. Thrombospondin-1 promotes an aggressive phenotype through epithelial-to-mesenchymal transition in human melanoma // Oncotarget. 2014. V. 5. № 14. P. 5782. https://doi.org/10.18632/oncotarget.2164

  27. Borsotti P., Ghilardi C., Ostano P. et al. Thrombospondin-1 is part of a Slug-independent motility and metastatic program in cutaneous melanoma, in association with VEGFR-1 and FGF-2 // Pigment Cell & Melanoma Res. 2015. V. 28. № 1. P. 73–81. https://doi.org/10.1111/pcmr.12319

  28. Grimbert P., Bouguermouh S., Baba N. et al. Thrombospondin/CD47 interaction: A pathway to generate regulatory T cells from human CD4+ CD25− T cells in response to inflammation // J. Immunol. 2006. V. 177. № 6. P. 3534–3541.

  29. Bi J., Bai Z., Ma X. et al. Txr1: An important factor in oxaliplatin resistance in gastric cancer // Med. Oncol. 2014. V. 31. № 2. P. 807. https://doi.org/10.1007/s12032-013-0807-1

  30. Isenberg J.S., Maxhimer J.B., Hyodo F. et al. Thrombospondin-1 and CD47 limit cell and tissue survival of radiation injury // Am. J. Pathol. 2008. V. 173. № 4. P. 1100–1112. https://doi.org/10.2353/ajpath.2008.080237

  31. Eckers J.C., Kalen A.L., Xiao W. et al. Selenoprotein P inhibits radiation-induced late reactive oxygen species accumulation and normal cell injury // Inter. J. Rad. Oncol.* Biol.* Physics. 2013. V. 87. № 3. P. 619–625. https://doi.org/0.1016/j.ijrobp.2013.06.2063

  32. Liu S.C., Tsang N.M., Chiang W.C. et al. Leukemia inhibitory factor promotes nasopharyngeal carcinoma progression and radioresistance // J. Clin. Investig. 2013. V. 123. № 12. P. 5269–5283. https://doi.org/10.1172/JCI63428

  33. Kolobynina K.G., Solovyova V.V., Levay K. et al. Emerging roles of the single EF-hand Ca2+ sensor tescalcin in the regulation of gene expression, cell growth and differentiation // J. Cell Sci. 2016. V. 129. № 19. P. 3533–3540. https://doi.org/10.1242/jcs.191486

  34. Cilensek Z.M., Yehiely F., Kular R.K., Deiss, L.P. A Member of the GAGE Family of Tumor Antigens is an Anti-Apoptotic Gene that Confers Resistance to Fas/CD95/APO-1, Interferon-g, Taxol and g-irradiation // Cancer Biol. & Therapy. 2002. V. 1. № 4. P. 379–386. https://doi.org/10.4161/cbt.1.4.11

  35. Ihara M., Ashizawa K., Shichijo K., Kudo T. Expression of the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit is associated with the radiosensitivity of human thyroid cancer cell lines // J. Rad. Res. 2018. V. 60. № 2. P. 171–177. https://doi.org/10.1093/jrr/rry097

  36. Azad A., Jackson S., Cullinane C. et al. Inhibition of DNA-dependent protein kinase induces accelerated senescence in irradiated human cancer cells // Mol. Cancer Res. 2011. V. 9. № 12. P. 1696–1707. https://doi.org/10.1158/1541-7786.MCR-11-0312

  37. Mathieu A.L., Verronese E., Rice G.I. et al. PRKDC mutations associated with immunodeficiency, granuloma, and autoimmune regulator-dependent autoimmunity // J. Allergy Clin. Immunol. 2015. V. 135. № 6. P. 1578–1588. https://doi.org/10.1016/j.jaci.2015.01.040

  38. Heath C.G., Viphakone N., Wilson S.A. The role of TREX in gene expression and disease // Biochem. J. 2016. V. 473. № 19. P. 2911–2935. https://doi.org/10.1042/BCJ20160010

  39. Lockwood W.W., Thu K.L., Lin L. et al. Integrative genomics identified RFC3 as an amplified candidate oncogene in esophageal adenocarcinoma // Clin. Cancer Res. 2012. V. 18. № 7. P. 1936–1946. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-11-1431

  40. Malumbres M. Cyclin-dependent kinases // Genome Biol. 2014. V. 15. № 6. P. 122.

  41. Wen Y., Perez E.J., Green P.S. et al. nNOS is involved in estrogen mediated neuroprotection in neuroblastoma cells // Neuroreport. 2004. V. 15. № 9. P. 1515–1518.

  42. Cookman C.J., Belcher S.M. Estrogen receptor-β up-regulates IGF1R expression and activity to inhibit apoptosis and increase growth of medulloblastoma // Endocrinology. 2015. V. 156. № 7. P. 2395–2408. https://doi.org/10.1210/en.2015-1141

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Генетика

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал