Генетика, 2021, T. 57, № 1, стр. 44-55

Идентификация и структурный анализ генов-гомологов SbAI у видов картофеля

Были идентифицированы (амплифицированы, клонированы, секвенированы) полногеномные последовательности гомологов гена SbAI у образцов 12 видов картофеля (табл. 1). Гомологи имели характерную для SbAI четырехэкзонную структуру, однако различались по общей длине (от 1763 пн у S. tuberosum ssp. andigenum до 1869 пн у S. gourlay) и по размеру кДНК (от 609 пн у S. demissum до 642 пн у S. stoloniferum) (табл. 1). По сравнению со SbAI S. tuberosum cv. DM 1–3 516 R44 (Gene ID: 102591697; далее использовался как референс при сравнениях) вариабельность полногеномных последовательностей идентифицированных гомологов составила 19.3% (381 SNPs), а кДНК–12.6% (82 SNPs) (табл. 1).

Кодируемые белки SbAI характеризовались наличием консервативных для AAI_LTSS-семейства доменов LTP_2 (в позиции 16–102 а.о. – у всех) и PRK14971 superfamily (в позиции 77–189 а.о. по SbAI S. tuberosum cv.DM 1-3 516 R44; 77–196 а.о. по выравниванию). Около 13–14% последовательности каждого белка составляли остатки пролина, что подтверждает принадлежность гомологов к AGP-семейству Pro-обогащенных белков. Также это свидетельствует о высокой способности SbAI взаимодействовать с другими белками, как это было показано ранее для Pro-обогащенных мотивов [21]. Также все исследуемые гомологи содержали консенсусные для AAI_LTSS-белков восемь остатков цистеина, формирующих дисульфидные мостики, в позициях 30, 41, 58, 59, 72, 74, 99 и 108 (соответствует домену LTP_2).

Третичные структуры всех анализируемых гомологов SbAI были предсказаны с помощью Phyre2 на основе известных матриц (PDB ID c2rknA_ “x‑ray structure of the self-defense and signaling protein DIR1 from Arabidopsis thaliana” и c2ljoA “3d solution structure of lipid transfer protein lc-ltp2”). С достоверностью >90% были моделированы 38–40% аминокислотных остатков (~30–107 а.о., что соответствует домену LTP_2), остальные – ab initio. Около 60% последовательности, куда полностью входит домен PRK14971, имеет неупорядоченную структуру, вследствие чего достоверные предсказания вторичной структуры данной области отсутствуют. Домен LTP_2 укладывается в пучок из четырех–пяти спиралей, стабилизированных четырьмя дисульфидными мостиками. Сравнение анализируемых белков с известной структурой мембранных белков (PDBID c6ithA_, “membrane protein, syndecan-2”) позволило предсказать наличие на C-конце всех гомологов SbAI трансмембранной спирали (~189–207 а.о.), важной для передачи сигнала через клеточную мембрану. Показанное структурное соответствие анализируемых гомологов SbAI указывает на высокую вероятность сходства их функций у разных видов картофеля.

Гомологи SbAI 12 анализируемых видов картофеля содержали 41 замещение аминокислотных остатков (а.о.; 19.25% от выравненной длины 213 а.о.), одну нейтральную вставку (P138_S139insTSAP) и три нейтральные делеции (T135_P138del, S137del и G202_I204del) (табл. 1). Радикальных замещений а.о. было найдено всего семь, и все они (а также вставка и первые две делеции) локализовались в консервативных доменах. Больше всего замещений (включая радикальные) содержали гомологи SbAI образцов видов S. acaule, S. sucrense, S. vernei и S. chacoense. По одному радикальному замещению имели также некоторые варианты SbAI S. berthaultii и S. demissum. Интересно, что гомологи SbAI видов томата имели в 2–10 раз больше замещений а.о. в сравнении с S. tuberosum, однако все они носили нейтральный характер (табл. 1).

Всего было выявлено 36 аллельных вариантов гена и 31 вариант белка (табл. 1). Наибольшее число аллельных вариантов соответствовало видам S. acaule, S. berthaultii и S. kurtzianum. Какая-либо корреляция количества вариантов с плоидностью анализируемых видов отсутствовала. Так, у гексаплоида S. demissum вариантов оказалось меньше, чем у диплоида S. berthaultii (табл. 1).

Мы сравнили полученные результаты с данными по ранее идентифицированным и охарактеризованным последовательностям гомологов гена SbAI у отечественных и зарубежных сортов и линий картофеля S. tuberosum [14]. Оказалось, что общий и экзонный полиморфизм сортовых последовательностей (27.0 и 21.3% соответственно) [14] в 1.4–1.7 раза превышает выявленную в настоящем исследовании межвидовую вариабельность. Однако для видов было идентифицировано большее число (~1.5 раза) аллельных вариантов, чем для сортов (36 сортам соответствовали 70 аллельных вариантов гена и 69 – белка [14]).

Дикорастущий картофель достаточно давно используется в селекционных программах, и в родословных большинства сортов можно найти, как минимум, один из шести видов (S. demissum, S. acaule, S. chacoense, S. stoloniferum, S. vernei и S. spegazzinii), которые являются донорами признаков устойчивости к различным биотическим и абиотическим стрессовым факторам; прочие виды картофеля (S. verrucosum и другие) в сортах встречаются реже [22]. Большая вариабельность SbAI у сортов, чем у видов, может быть связана с тем, что родословная сорта включает больше одного, а часто и несколько видов картофеля.

Филогения полногеномных последовательностей гомологов SbAI видов картофеля

Чтобы оценить степень родства видов и сортов картофеля, был проведен филогенетический анализ полногеномных последовательностей соответствующих гомологов SbAI; в качестве внешней группы использовали SbAI видов томата S. lycopersicum и S. pennellii (рис. 1).

Рис. 1.

Филогенетическая дендрограмма видов и сортов картофеля, основанная на полногеномной последовательности гомологов гена SbAI. Построена в MEGA 7.0, с использованием метода максимального правдоподобия (Maximum Likelihood), модели Tamura 3 и 1000 бутстрэп-реплик. Гомологи SbAI Solanum lycopersicum и Solanum pennellii использованы в качестве внешней группы. Использованы аллельные варианты 10 сортов S. tuberosum (Голубизна, Крепыш, Браво, Фиолетовый, Ирбитский, Фаворит, Старт, Горняк, Арлекин и Кузнечанка; на дендрограмме названия даны в латинской транслитерации) и линия 3-43-6. “А” после названия вида/сорта обозначает аллельный вариант. Значения бутстрэп указаны в узлах.

На дендрограмме произошло разделение сортов и видов картофеля на несколько клад. Выделилась группа из четырех аллельных вариантов S. acaule и одного S. demissum, тогда как оставшиеся аллельные варианты данных видов объединились в другую группу внутри соседнего большого кластера (рис. 1). Кроме этой группы кластер содержит клады, состоящие: 1) из трех подкластеров, объединяющих аллели нескольких сортов/линий (Голубизна, Браво, Горняк, Старт, Ирбитский, Фаворит, Арлекин, Крепыш и 3-43-6) и видов (S. berthaultii, S. gourlay, S. tuberosum subsp. andigenum, S. stoloniferum и S. verrucosum); 2) из аллелей одних только видов (S. sucrense, S. vernei, S. tuberosum и S. chacoense); 3) из четырех аллелей S. kurtzianum; 4) из двух аллелей subsp. andigenum и аллеля сорта Фиолетовый; 5) из аллелей трех видов (S. gourlay, S. jamesii и S. stoloniferum) и сортов/линий (3-43-6, Крепыш, Фиолетовый и Кузнечанка) (рис. 1).

Таким образом, выявленные аллельные варианты пяти видов (S. acaule, S. demissum, subsp. andigenum, S. gourlay и S. stoloniferum), а также аллели одной линии (3-43-6) и двух сортов (Фиолетовый и Крепыш) оказались разнесены по разным кладам. Варианты SbAI семи из 11 взятых в анализ сортов составляют единый подкластер, тогда как остальные сорта попадают в кластеры, образованные аллельными вариантами видов.

Ранее было показано, что филогенетически виды картофеля делятся на три клады (“clade 1 + 2”, “clade 3” и “clade 4”), где “clade 4” делится на подклады “4 south”, “4 north” и “4 cultivated”, или же на “4А” и “4В” [23–25]. При этом аллельные варианты одного вида могут попадать в разные клады [23]. Обнаруженный в нашем исследовании разброс аллельных вариантов S. acaule и S. demissum по разным кладам подтверждает показанный ранее сложный состав аллелей этих двух видов. Считается, что аллели S. acaule и S. demissum в основном принадлежат кладе 4, однако оба вида имеют хотя бы по одному аллелю клады 3 [23]. В нашем же случае два аллельных варианта S. demissum распределились поровну между кладами 3 и 4, а вот из шести аллелей S. acaule четыре попали в кладу 3 и только два в кладу 4 (рис. 1). У еще одного вида со сложным составом аллелей – S. stoloniferum один из трех аллелей SbAI оказался в кладе 4, а два других объединились в одну группу с аллелями S. jamesii (рис. 1), который принадлежит кладе 1 + 2. Это подтверждает выявленное ранее присутствие у S. stoloniferum аллелей клады 1 + 2 [23]. Показанное распределение аллельных вариантов линии 3-43-6 и сортов Фиолетовый и Крепыш по отдаленным кластерам дендрограммы может отражать комплексную родословную образцов, связанную со сложными межвидовыми скрещиваниями.

Вариабельность профиля экспрессии гомологов гена SbAI видов картофеля

Для сравнительного анализа экспрессии гена SbAI были выбраны образцы клубнеобразующих видов секции Petota – S. tuberosum (сорт Надежда в качестве контроля), S. rybinii (=S. tuberosum subsp. andigenum, клада 4В) и двух дикорастущих видов S. chacoense и S. kurtzianum (клада 4 south) [22].

Предварительно профиль экспрессии гена SbAI был определен в ряде органов S. tuberosum. В не запасающих вегетативных органах (стебле, листе, бутоне, цветке и корне) наблюдался низкий уровень транскрипции гена, тогда как в клубне транскрипция резко усиливалась (рис. 2). Значительный рост экспрессии гена в запасающих органах в сравнении с другими вегетативными тканями свидетельствует об участии SbAI в предохранении резервного крахмала клубня от гидролиза.

Рис. 2.

Профиль экспрессии гена ингибитора амилаз SbAI в различных органах (стебель – St, лист – L, бутон – B, цветок – F, корень – R, столон – S, клубень – T) образцов четырех видов картофеля: Solanum tuberosum (сорт Надежда), Solanum kurtzianum, Solanum chacoense, Solanum rybinii. Буквами над столбиками указаны достоверные различия (P < < 0.01) в уровне экспрессии SbAI между отдельными органами внутри одного вида. Каждому органу присвоено свое буквенное обозначение (a–g). Например, для S. tuberosum экспрессия в цветке (e) достоверно отличается от экспреcсии в листе (a), корне (b), клубне (d) и стебле (g), соответственно над столбиком abdg.

С учетом полученных результатов экспрессию SbAI у трех выбранных видов S. rybinii, S. chacoense и S. kurtzianum определяли в листе (фотосинтезирующий орган), корне и столоне (подземные не запасающие органы), а также в клубне (подземный запасающий орган). Транскрипты гена были выявлены во всех анализируемых органах всех образцов с относительным уровнем транскрипции в интервале 0.00025–0.3 (рис. 2), что соответствовало ранее определенному профилю экспрессии SbAI у двух сортов картофеля [5].

Транскрипция SbAI S. kurtzianum повторяла профиль SbAI S. tuberosum, за исключением менее выраженного роста уровня транскрипции SbAI в клубнях, в то время как S. rybinii и S. chacoense имели другие профили экспрессии гена (рис. 2).

Согласно суточной динамике метаболизма крахмала в листьях, днем (когда собирали листья образцов на анализ) должен происходить интенсивный синтез и накопление крахмала [26], и в данной ткани ожидался повышенный уровень экспрессии SbAI. Однако в листьях анализируемых образцов транскрипция носила следовый характер, за исключением S. chacoense, где уровень экспрессии гена был выше в 13, 50 и 250 раз, чем у S. tuberosum, S. kurtzianum и S. rybinii соответственно (рис. 2). Известно, что виды S. rybinii, S. chacoense, S. kurtzianum, а также сорт Надежда (взятый как представитель S. tuberosum) обладают хорошей устойчивостью к низким температурам [22]. Поэтому корреляции уровня экспрессии SbAI в листе с холодостойкостью образцов не отмечено.

В этой связи интересны данные о разной реакции двух сортов картофеля на холодовой стресс: в листьях Desiree экспрессия генов деградации крахмала росла с одновременным накоплением редуцирующих сахаров, в то время как у RussetBurbank данные характеристики почти не менялись [3]. Это позволило заключить, что активация гидролиза крахмала зависит не только от понижения температуры, но и от содержания редуцирующих сахаров при нормальных условиях: в листьях Russet Burbank моносахаридов исходно было достаточно, чтобы, не повышая их концентрации, перенести охлаждение [3]. Более того, на примере пяти видов картофеля была показана корреляция между исходным количеством крахмала и степенью роста экспрессии SbAI в листе в ответ на холодовой стресс [18].

Поэтому различный уровень экспрессии гена ингибитора амилаз SbAI в листьях анализируемых видов может быть следствием разного исходного содержания в листьях как синтезируемого крахмала, так и редуцирующих сахаров.

Интересно, что при нормальных условиях уровень экспрессии SbAI в листьях никак не коррелирует со степенью устойчивости клубней к холодовому осахариванию. Так, ранее было показано, что в листьях чувствительного и устойчивого к CIS сортов картофеля ген ингибитора амилаз экспрессируется на одинаковом уровне [5]. Однако в клубнях SbAI транскрибируется высоко у CIS-чувствительного сорта и низко у CIS-устойчивого [5].

В настоящей работе самая высокая экспрессия SbAI в клубне была у S. tuberosum – выше в 5.2, 8.6 и 430 раз, чем у S. kurtzianum, S. chacoense и S. rybinii соответственно (рис. 2). Это может свидетельствовать о меньшей подверженности клубней образцов S. tuberosum и S. kurtzianum холодовому осахариванию.

В случае корня и столона ситуация различалась. Так, S. rybinii с минимальной экспрессией SbAI в клубне показал самый высокий уровень транскрипции в корне – в 2.4 раза выше, чем у S. chacoense, и в целых 42.3 раза выше, чем у S. kurtzianum и S. tuberosum (рис. 2).

Полученные данные профиля экспрессии “корень–столон–клубень” позволяют предположить, что разные виды и сорта картофеля могут по-разному регулировать содержание крахмала в клубнях: одни предупреждают его распад, ингибируя активность амилаз уже в корнях и столонах; другие – останавливают деградацию крахмала непосредственно в запасающих органах.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что говорить о корреляции непосредственно между уровнем экспрессии гена ингибитора амилаз и холодоустойчивостью или CIS-устойчивостью растения картофеля пока преждевременно. Для корректных заключений необходимо учитывать исходные (предстрессовые) транскриптомные, протеомные и биохимические данные каждого конкретного генотипа в нормальных условиях развития.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 17-29-08017) и ФНТП развития сельского хозяйства РФ на 2017–2025 гг. (подпрограмма “Развитие селекции и семеноводства картофеля в Российской Федерации”). Растения выращивали с использованием экспериментальной установки искусственного климата ЭУИК (Институт биоинженерии ФИЦ Биотехнологии РАН).