Генетика, 2021, T. 57, № 10, стр. 1215-1220

Кариес зубов является многофакторным заболеванием, которое ассоциируется с присутствием микроорганизмов, вызывающих кариозное поражение, и ферментируемых сахаров, а также обусловлено генетическими и средовыми факторами, индивидуальной устойчивостью зубов к факторам поражения и длительностью воздействия этих факторов [1, 2]. Установлена взаимосвязь между развитием поражения зубов кариесом и иммунным ответом иммунокомпетентных клеток [3]. Цитокины являются продуктами моноцитов-макрофагов, активированных для контроля воспалительного ответа на бактериальную инфекцию [4]. Показано, что цитокины ассоциируются с патогенезом воспаления не только мягких тканей [5], но и способствуют возникновению и развитию кариеса зубов [6]. Генетические и иммунные различия между индивидуумами обусловливают различия в рисках кариеса зубов [2, 3].

Streptococcus mutans – один из основных возбудителей кариеса [2]; было показано, что компоненты S. mutans стимулируют продукцию провоспалительных цитокинов [3]. Интерлейкин 1 (IL-1) является провоспалительным цитокином, который кодируется геном IL-1, локализованным в области 2q13–21. Белок I/II, прикрепленный к клеточной стенке S. mutans, играет важную роль в колонизации поверхностей зубов и индуцирует синтез моноцитами провоспалительных цитокинов, таких, как IL-1β [5]. Установлено, что IL-1ra (IL1RN), напротив, ингибирует активность IL-1β [6].

Описано вариабельное количество тандемных повторов (VNTR) с субъединицей в 86 пн (rs2234663), присутствующих в интроне 2 гена IL1RN, выявлено шесть аллелей. Среди этих шести присутствуют “короткие” (S) аллели с одним (VNTR/6) и двумя повторами (VNTR/2) и “длинные” L-аллели (VNTR/L), содержащие от трех до шести повторов [7]. Провоспалительный иммунный ответ индивидуумов (гомозиготных по аллелю VNTR/2 гена IL1RN) более продолжительный и сильный в сравнении с носителями других VNTR-генотипов по гену IL1RN [8]. В этой связи влияние аллеля VNTR/2 гена IL1RN изучали при различных заболеваниях, включая аутоиммунные [9–11]. В результате метаанализа проведенных исследований выявлена роль 86 пн VNTR-полиморфизма гена IL1RN в развитии сепсиса (комплексного заболевания с нарушенной регуляцией воспалительного ответа и высокой смертностью): в качестве аллеля риска установлен VNTR/2 [10]. Изучение VNTR-полиморфизма в интроне 2 гена IL1RN включено в наше исследование по изучению развития кариеса у детей в Краснодарском крае, так как не исключена его роль в кариозном процессе с учетом ранее выявленной роли полиморфизмов этого гена с заболеваниями в ротовой полости и другими инфекционными заболеваниями.

IL-4 (интерлейкин 4) действует как антивоспалительный агент, ген интерлейкина 4 (IL4) локализуется на длинном плече хромосомы 5 (q23-31) вместе с другими генами цитокинов. Этот ген содержит тандемный повтор в 70 пн с вариабельным количеством тандемных повторов VNTR или минисателлитный повтор, который находится в интроне 3 и ассоциируется с продукцией IL-4 [12]. Обнаружены два основных аллеля, обусловленные VNTR-полиморфизмом IL4: один с делецией 70 пн (c двумя повторами), а другой с инсерцией 70 пн (с тремя повторами), которые обозначают как P1 и P2 соответственно [12, 13]. Генотипы P2/P2 гена IL4 ассоциированы с более низкими концентрациями IL-4; в этой связи предположили, что аллель P1 индуцирует более высокую экспрессию гена IL4 по сравнению с P2-аллелем [13]. Проведен целый ряд исследований по ассоциации VNTR-полиморфизма гена IL4 с иммунными и аутоиммунными заболеваниями, в том числе с заболеваниями ротовой полости, включая рецидивирующий афтозный стоматит и периодонтит [13]. В нашем исследовании анализировали возможную ассоциацию этого полиморфизма с развитием кариеса зубов у детей в Краснодарском крае.

На базе детской краевой клинической больницы и стоматологической поликлиники Кубанского государственного медицинского университета (КубГМУ) изучены дети (N = 159) школьного возраста, проживающие на территории Краснодарского края. Биологические образцы детей собраны преимущественно в виде соскобов буккального эпителия в ротовой полости, частично в виде образцов крови, из которых выделена ДНК с помощью наборов “Изоген” (Москва). У всех детей проведено стоматологическое обследование в амбулаторных условиях в ходе профилактического осмотра или при поступлении в лечебно-профилактическое учреждение. Исследование одобрено этическим комитетом КубГМУ, что отражено в протоколе № 63 от 21 мая 2018 г.

Стоматологический осмотр проводили согласно рекомендациям ВОЗ. Дети подразделялись по возрасту в соответствии с периодами развития прикуса: 0–6 лет – временный прикус, 7–12 лет – смешанный и 13–17 лет – постоянный прикус. У всех детей была определена степень кариозного процесса, выявлены здоровые дети – не более 15% от выборки. Интенсивность кариозного процесса оценивали с использованием суммарного индекса “кпу/КПУ” (кариес/пломба/удаленный не по смене зуб). В соответствии с полученными значениями “кпу/КПУ” дети в выборках подразделялись на следующие группы: с компенсированной формой кариеса (КФК) – значения индекса от 0 до 3, с субкомпенсированной формой кариеса (СФК) – значения от 4 до 5, и декомпенсированной формой кариеса (ДФК) при значениях от 6 и выше [14]. Средний возраст детей в группах: с КФК (и здоровых) составил 12.08 ± 0.38, с СФК – 11.66 ± 0.46 и с ДФК – 10.19 ± 0.54. Таким образом, средний возраст детей в трех изученных группах соответствует смешанному прикусу, что позволяет проводить сравнительные исследования.

Для исследования выбрали минисателлитный (VNTR – variable number of tandem repeats – вариабельное число тандемных повторов) маркер гена IL1RN (rs2234663) и VNTR-маркер гена IL4 (rs8179190), который изучали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием наборов реагентов для фирмы “Изоген” (Москва), условия описаны в работах [11] и [13] соответственно. Выявленный спектр полиморфных вариантов гена IL1RN представлен следующими фрагментами: фрагмент длиной 410 пн соответствует аллелю IL1RN1 (A1) (содержит четыре повтора субъединицы по 86 пн); фрагмент 240 пн – IL1RN2 (A2) – (две копии повтора); фрагмент 500 пн – IL1RN4 (A4) – (пять копий повтора) и фрагмент 155 пн – IL1RN6 (A6) – (одну копию). В нашей выборке были представлены только аллели IL1RN1, ILRN2 и ILRN4. Аллели IL1RN3 и IL1RN5 не обнаружены, а аллель IL1RN6 обнаружен у одного, не вошедшего в исследование индивидуума. Аллели A1 и A2 наиболее распространены в различных популяциях [13]. Для аллеля P1 гена IL4 ПЦР-продукт был длиной 183 пн и для аллеля P2 – длиной 253 пн. В изученной выборке выявлен также минорный аллель в 113 пн – P3 с одной копией субъединицы в 70 пн (индивидуум с P3 не вошел в рассматриваемые нами выборки). Для надежности типирования и воспроизводимости метода для каждого генотипа включали внутренние контроли.

Для статистической обработки данных использовали алгоритмы программы Statistica 6.0 и алгоритм WinPepi (для определения OR (odds ratio)), определяли 95%-ный интервал разброса величины при вероятности p < 0.05 по точному тесту Фишера (two-tailed – для двух распределений). С помощью программы “Statistica” определяли частоты аллелей, равновесие Харди–Вайнберга, ожидаемую и наблюдаемую гетерозиготности, а также проводили сравнение выборок с использованием G-критерия.

Частоты аллелей для IL4 (rs8179190) и IL1RN (rs2234663) в группах детей с различной степенью кариеса зубов (КФК, СФК и ДФК), а также оценки наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготностей представлены соответственно в табл. 1 и 2. Для IL4 (rs8179190) и IL1RN (rs2234663) во всех трех группах рассчитывали равновесие Харди–Вайнберга – не установлено достоверных различий по распределению генотипов при попарном сравнении групп. Тем не менее, установлены достоверные различия по присутствию генотипа A1/A1 попарно между группами детей с КФК (и здоровых) и ДФК, а также с СФК и ДФК, причем генотип A1/A1 выступает как генотип, обусловливающий устойчивость к декомпенсированной форме кариеса (табл. 2).

В трех изученных группах выявлено девять двухлокусных генотипов по rs2234663 и rs8179190. Наиболее распространенными были: A1/A1 P2/P2 и A1/A1 P1/P2 – c частотами 43.1 и 30.6% в группе детей с КФК, 47.0 и 22.5% в группе детей с СФК, а также 39.5 и 13.2% в группе детей с ДФК. При проведении статистического анализа по особенностям распределения генотипов установлены следующие достоверные различия между группами по присутствию в генотипе двух “длинных” аллелей L/L по rs2234663, к которым относятся выявленные аллели A1 и A4: детей с КФК (и здоровых) и с ДФК, а также с СФК и ДФК – OR = = 0.33, p = 0.01, 95%CI 0.13–0.87 и OR = 0.35, p = = 0.035, 95%CI 0.12–1.00 соответственно. Таким образом, L/L выступает как генотип устойчивости к декомпенсированной форме кариеса зубов.

По некоторым данным [3], уровень инфицированности S. mutans положительно коррелировал с уровнем концентрации IL-1β в слюне и отрицательно коррелировал с концентрацией IL-1ra. Выявленные в настоящей работе ассоциации для IL1RN L/L с ДФК согласуются ранее полученным литературным данным [3], так как у носителей этого генотипа установлена более высокая концентрация IL1RN. Установлены также достоверные различия по присутствию суммарной группы генотипов, гомозиготных по P2 и содержащих хотя бы один аллель A2: A1/A2 P2/P2 и A2/A2 P2/P2 – попарно между группами детей с ДФК и КФК (и здоровых) и с ДФК и СФК: OR = = 3.26, p = 0.031, 95%CI 1.05–10.36 и OR = 3.59, p = = 0.048, 95%CI 1.00–14.44 соответственно. Следовательно эти генотипы выступают как факторы риска по наибольшей активности кариеса (декомпенсированной формы). Установлены достоверные различия по присутствию генотипов хотя бы с одним аллелем P2 по rs8179190 и с одним аллелем A2 (“коротким”) по rs2234663 между группами с ДФК и КФК (и здоровых) и с ДФК и СФК: OR = 2.96, p = 0.021; 95%CI 1.11–7.88 и OR = 3.34, p = 0.026; 95%CI 1.11–10.46 соответственно. Итак, генотипы, содержащие одновременно P2 по rs8179190 и A2 по rs2234663 являются генотипами риска по декомпенсированной форме кариеса.

Итак можно заключить, что генотипы с двумя “длинными” аллелями L/L в генотипе (500 или 410 пн) обусловливают устойчивость к ДФК, и что составные двухлокусные генотипы по rs8179190 и по rs2234663 (A1/A2 P2/P2 и A2/A2 P2/P2) и генотипы, содержащие P2 по rs8179190 и A2 (“короткий”) по rs2234663, обусловливают чувствительность к ДФК. Группа детей с СФК аналогично группе с КФК (и здоровых) достоверно отличается от группы с ДФК по тому же спектру маркеров изученных генов цитокинов. Выявленные особенности распространения полиморфных вариантов VNTR двух изученных генов цитокинов IL1RN и IL4 в группах детей с ДФК, СФК и КФК (и здоровых) предполагают роль этих маркеров в развитии кариеса с максимальной степенью активности процесса (декомпенсированной формы кариеса). Ассоциации с кариесом по генотипам гена IL-4 выявлены только для составных двухлокусных генотипов с участием аллелей IL1RN, что предполагает вероятную ассоциацию IL-4 с высокой активностью кариозного поражения только в составе генотипов с геном IL1RN. При сравнении группы детей с СФК с группой КФК (и здоровых) не выявлено достоверных различий по распределению генотипов по IL-4 и IL1RN. Группа СФК аналогично группе КФК (и здоровых) достоверно отличается от ДФК по тому же спектру маркеров изученных генов цитокинов. Это позволяет заключить, что изученные маркеры цитокинов вносят наибольший вклад в развитие кариозного процесса с высокой активностью поражения (ДФК) и не оказывают выраженного эффекта на кариозное поражение средней и низкой интенсивности (КФК и СФК), что предполагает возможные отличия в механизмах развития кариеса с разной активностью поражения. Полученные результаты могут служить доказательством о вовлеченности VNTR-локусов генов цитокинов IL1RN (rs2234663) и IL4 (rs8179190) в ассоциацию с развитием высокоактивного поражения кариесом.

Работа выполнена в рамках Государственного задания “Геномные исследования и генетический полиморфизм клетки, организма и популяции” № 0112-2019-0001 и гранта РФФИ № р_а 16-44-230636.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.