Генетика, 2021, T. 57, № 11, стр. 1297-1305

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование включено 78 пациентов с ХСН, развившейся на фоне сочетанного течения ишемической болезни сердца и артериальной гипертензии. Возраст пациентов составил 64 (59; 69) года. Выборка включала 63 (80.8%) мужчины и 15 (19.2%) женщин. Клиническая характеристика пациентов представлена в табл. 1. Принимаемые лекарственные препараты указаны на момент поступления.

Функциональный класс (ФК) ХСН в соответствии с классификацией Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA) был определен с помощью теста 6-минутной ходьбы. Пройденное расстояние в 426–550 и 301–425 м соответствует I и II ФК, а расстояние в 151–300 м соответствует III ФК [12].

Всем пациентам выполнено эхокардиографическое исследование сердца. Эхокардиографию проводили, используя аппарат Philips HD15 (Нидерланды) из стандартных позиций с оценкой размеров отделов сердца и фракцией выброса левого желудочка (ЛЖ) по методу Симпсона. Также диагностировалось наличие гипертрофии ЛЖ при увеличении индекса массы миокарда ЛЖ >115 у мужчин и >95 г/м² у женщин [12].

Для генетического исследования использовали интраоперационные биоптаты сердца – ушко правого предсердия, иссекаемые при подключении аппарата искусственного кровообращения во время плановой операции коронарного шунтирования. Сразу после иссечения биоптаты помещали в ледяной раствор Кребса–Хензеляйта следующего состава в мМ: NaCl – 120, KCl – 4.8; CaCl₂ – 2.0, MgSO₄ – 1.2, KH₂PO₄ – 1.2, NaHCO₃ – 20.0, глюкоза – 10.0. Данный раствор позволяет поддерживать жизнеспособность кардиомиоцитов с сохранением их сократительной функции [13]. В условиях стерильного бокса биоптаты освобождали от соединительной ткани и забирали образцы 20–25 мг. При невозможности немедленного выделения РНК образцы помещали в RNAlater RNA Stabilization Reagent (Кат. № 76104 QIAGEN, Германия) и хранили при –80°C. Образцы миокарда разрушали на гомогенизаторе TissueLyser LT (QIAGEN), и из гомогената выделяли тотальную РНК с помощью коммерческого набора RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit (Кат. № 74704, QIAGEN). Качество образцов РНК оценивали спектрофотометрическим методом по отношению A260/A280 (NanoVue, Heaithcare Bio-Science, Швеция), которое варьировало в пределах от 1.93 до 2.03. Для синтеза кДНК использовали реактивы RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Кат. № K1622, Thermo Scientific, США).

Полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени проводили на амплификаторе LightCycler 96 (Roche) с использованием праймеров, разработанных и синтезированных OOO “ДНК-Синтез” (Россия): hADRB1-F = CAGGTGAACTCGAAGCCC; hADRB1-R = CTCCCATCCCTTCCCAA; hADRB1-probe = FAM-AAAGCCACGGACCGTTGCAC-BHQ1. Подбор праймеров осуществлялся так, чтобы была исключена возможность амплификации геномной ДНК за счет расположения праймеров/зонда в разных экзонах. Для повышения эффективности реакции подбирались праймеры/зонд, не содержащие димеры и шпильки. Все праймеры/зонды проходят проверку в системе BLAST. В качестве референсного был использован ген глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы GAPDH (TaqMan® Gene Expression Assays, Hs03929097_g1 (VIC), Thermo Scientific), рекомендованный в качестве гена “домашнего хозяйства” при исследовании разных отделов и патологий сердца [14, 15].

Постановку реакции проводили в триплетах, в одном планшете параллельно проводили реакции для целевого гена и гена “домашнего хозяйства”. Для мастер-микса использованы 10× DreamTaq Buffer (Кат. № B65, Thermo Scientific), DreamTaq DNA Polymerase (Кат. № EP0701, Thermo Scientific), Invitrogen dNTP Set 100 mM (Кат. № 10297117, Thermo Scientific). Расчет уровня экспрессии проводили с помощью программного обеспечения LightCycler 96 (Roche) с применением стандартной кривой, поправкой на эффективность реакции и калибратор постановок по методу Pfaffl [16]: Ratio = = (E_target)^{∆Ct,target(calibrator – test)}/(E_ref)^{∆Ct,ref(calibrator – test)}, где Е – эффективность реакции; Ct – пороговый цикл генов мишеней (target) и референсного гена (ref); ∆Ct, target(calibrator – test) – Ct гена мишени в калибраторе минус Ct гена мишени в опытном образце; ∆Ct, ref(calibrator – test) – Ct референсного гена в калибраторе минус Ct референсного гена в опытном образце.

Статистический анализ проводили с помощью стандартного пакета программ SPSS версии 13 (IBM, США). Количественные данные были предварительно проверены на соответствие нормальному закону распределения с помощью критерия Шапиро–Уилка. Так как большая часть исследуемых параметров, включая уровень экспрессии гена ADRB1, не соответствовала нормальному закону распределения, то дальнейший анализ проводили с помощью критерия Манна–Уитни или теста Краскела–Уоллиса. Результаты представляли в виде медианы и интерквантильного размаха. Также оценивали силу линейной взаимосвязи между количественными показателями с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Связь между качественными данными определяли с помощью χ² Пирсона или двустороннего точного теста Фишера. Уровень значимости различий принимали p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При проведении ПЦР в режиме реального времени эффективность реакции для гена ADRB1 в среднем составляла 1.94 ± 0.12 (94%), коэффициент детерминации R² – 0.98 ± 0.01; для гена GAPDH эффективность реакции составила 1.93 ± 0.1 (93%), коэффициент R² – 0.98 ± 0.02.

В исследуемой выборке относительная экспрессия гена ADRB1 была сопоставима (p = 0.526) у мужчин и женщин – 1.2 (0.7; 1.7) и 1.3 (0.8; 1.7) – и линейно не связана с возрастом пациентов (r = = 0.154, p = 0.191). Отсутствовали различия в уровне экспрессии гена в миокарде пациентов с ХСН ФК I, II, III, что показано на рис. 1.

Рис. 1.

Уровень экспрессии гена ADRB1 относительно GAPDH у пациентов с ХСН ФК I (1.4 (0.8; 1.6)), ФК II (1.2 (0.8; 1.8)), ФК III (1.3 (0.7; 1.6)). При сравнении использован тест Краскела–Уоллиса.

Наличие инфаркта миокарда (ИМ) в анамнезе также не влияло на экспрессию ADRB1 (p = 0.556). Экспрессия гена составила у пациентов без ИМ 1.3 (0.8; 1.7) и у больных с ИМ в анамнезе 1.2 (0.7; 1.7). В исследуемой выборке наблюдалась тенденция к более высокой экспрессии гена ADRB1 при сахарном диабете 2-го типа – 1.5 (0.9; 2.1) против 1.2 (0.7; 1.6) у пациентов без гипергликемии, но различия не достигли статистической значимости (p = 0.069). У пациентов с ожирением и без него уровень экспрессии оказался одинаков (p = = 0.956) – 1.2 (0.7; 1.7) и 1.2 (0.8; 1.7). Статистически значимых различий не выявлено у лиц с дилатацией левого предсердия (1.5 (0.9; 1.7) против 1.1 (0.7; 1.7), p = 0.110) или левого желудочка (1.2 (0.7; 2.2) против 1.2 (0.8; 1.7), p = 0.984) по сравнению с пациентами без изменений отделов сердца. Экспрессия гена ADRB1 у пациентов с диастолической дисфункцией ЛЖ составила 1.2 (0.7; 1.6), без нее – 1.3 (0.8; 1.7) (p = 0.369). Коэффициент корреляции между уровнем экспрессии гена ADRB1 и фракцией выброса левого желудочка составил r = = –0.202 (p = 0.085). Имела место слабая прямая линейная взаимосвязь (r = 0.248, p = 0.039) между уровнем экспрессии и скоростью пика A, но корреляция с другими показателями ЭхоКГ, в том числе скоростью пика E и отношением E/A, отсутствовала.

Тем не менее выявлено значимое (p = 0.022) снижение экспрессии ADRB1 на 21–35% в миокарде пациентов с гипертрофией ЛЖ. Результаты представлены на рис. 2. Хорошо известно, что к развитию гипертрофии ЛЖ приводит митральная недостаточность. Аналогичная зависимость получена и для нашей выборки (Fisher’s Exact Test = 16.621, p < 0.001, рис. 3,а). Но при этом уровень экспрессии ADRB1 между лицами с митральной недостаточностью I, II степени и без нее оказался сопоставимым (рис. 3,б), как и при наличии и отсутствии трикуспидальной недостаточности (1.2 (0.9; 1.6) и 1.3 (0.7; 1.7) соответственно, p = 0.818).

Рис. 2.

Уровень экспрессии гена ADRB1 относительно GAPDH у пациентов с гипертрофией ЛЖ (1.1 (0.6; 1.3)) и без нее (1.4 (0.8; 2.0)). При сравнении использован критерий Манна–Уитни.

Рис. 3.

Частота гипертрофии левого желудочка (а) и уровень экспрессии гена ADRB1 относительно GAPDH (б) у пациентов с митральной недостаточностью (МН). Экспрессия гена при отсутствии МН – 1.3 (0.7; 1.7), при МН 1-й степени – 1.5 (0.8; 1.9), при МН 2-й степени – 1.2 (1.1; 1.3). При сравнении частот использован χ² Пирсона, при сравнении уровней экспрессии – тест Краскела–Уоллиса.

Выполнен анализ уровня экспрессии гена ADRB1 в зависимости от приема лекарственных препаратов на момент поступления пациента в стационар. В нашей выборке ни β-адреноблокаторы (1.2 (0.7; 1.7) у принимавших и 1.2 (0.9; 1.6) у не принимавших, p = 0.353), ни гиполипидемические препараты (1.2 (0.7; 1.6) против 1.3 (0.6; 1.8), p = 0.868), ни ингибиторы АПФ и блокаторы рецепторов ангиотензина II (1.2 (0.7; 1.6) против 1.4 (0.9; 2.0), p = 0.115) не показали значимого влияния на значения ADRB1/GAPDH. В то же время пациенты, принимавшие препараты ацетилсалициловой кислоты (АСК), отличались значимо более высокой экспрессией ADRB1 (p = 0.048), что показано на рис. 4. При этом в группе лиц, принимавших препараты АСК, частота случаев гипертрофии ЛЖ (6 (12.5%) из 48 пациентов) была значимо (p = 0.006) ниже, чем среди пациентов, по каким-либо причинам не принимавших АСК (10 (43.5%) из 23 пациентов).

Рис. 4.

Уровень экспрессии гена ADRB1 относительно GAPDH у пациентов, принимавших препараты АСК (1.4 (0.8; 2.0)) и не принимавших АСК (0.9 (0.6; 1.4)). Группа “Выпавшие” – лица, у которых не удалось выяснить информацию о приеме препаратов АСК на момент поступления. При сравнении групп, принимавших и не принимавших препараты АСК, использован критерий Манна–Уитни.

ОБСУЖДЕНИЕ

Классический путь внутриклеточной трансляции сигналов β1-АР хорошо изучен – это активация комплекса аденилатциклаза–Gs-белки, приводящая к повышению уровня цАМФ. Первичной мишенью для цАМФ является протеинкиназа A. Она фосфорилирует белки (Ca²⁺-каналы L-типа, фосфоламбан, тропонин I, рианодиновые рецепторы и др.), которые влияют на сократимость кардиомиоцитов за счет увеличения притока Ca²⁺, обратного захвата Ca²⁺ в саркоплазматический ретикулум или за счет модулирования чувствительности миофиламентов к этим ионам [17].

Известно, что при ХСН из-за повышенной концентрации катехоламинов имеет место хроническая гиперсимпатикотония, характеризующаяся длительной активацией β1-АР. Это приводит к десенситизации, т.е. угнетению рецепторного ответа с течением времени в условиях наличия постоянного стимула высокой интенсивности, снижается экспрессия β1-АР на кардиомиоцитах. Как следствие, у пациентов с ХСН наблюдается уменьшение инотропного резерва миокарда и насосной функции сердца [2, 18].

Оценка экспрессии гена β1-АР ADRB1 является одним из способов изучить влияние различных клинических параметров на состояние симпатоадреналовой системы при ХСН. Мы определяли относительный уровень экспрессии ADRB1/GAPDH в миокарде пациентов с ХСН ФК I, ФК II и ФК III, но не обнаружили статистически значимых различий. Отсутствовала линейная корреляция с фракцией выброса ЛЖ. Также не было различий по уровню экспрессии гена ADRB1 у пациентов с диастолической дисфункцией ЛЖ и без нее. И хотя в исследуемой выборке была выявлена слабая прямая зависимость между уровнем экспрессии и скоростью кровотока в период предсердной систолы (пик A), мы не обнаружили связи между экспрессией и скоростью кровотока через митральный клапан в раннюю фазу диастолы (пик Е) и отношением E/А, характеризующим трансмитральный кровоток.

Известно, что на скорость пика A оказывает влияние податливость ЛЖ и сократимость ЛП. Несмотря на отсутствие явной зависимости уровня экспрессии гена от тяжести ФК ХСН и корреляции с параметрами ЭхоКГ, экспрессия ADRB1 оказалась значительно снижена в миокарде пациентов с гипертрофией ЛЖ. Более того, ранее в той же выборке пациентов мы оценили уровень экспрессии гена ATP2A2, кодирующего SERCA2a, и гена рианодиновых рецепторов RYR2. Относительная экспрессия генов ATP2A2 и RYR2 также была снижена у пациентов с гипертрофией ЛЖ, показатель ATP2A2/GAPDH коррелировал со скоростью пика A и RYR2/GAPDH [13]. При исследовании экспрессии гена ADRB1 была обнаружена прямая линейная связь между изучаемым фактором и экспрессией гена ATP2A2 (r = 0.293, p = 0.030). Однако отсутствовала статистически значимая линейная зависимость между уровнями экспрессии гена ADRB1 и гена RYR2 (r = 0.165, p = 0.223).

Cтимуляция β1-АР через цАМФ приводит к фосфорилированию одного из ключевых белков Са²⁺-транспортирующей системы саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов – фосфоламбана. Дефосфорилированный фосфоламбан является ингибитором активности SERCA2a, осуществляющей обратный захват ионов Ca²⁺ из цитозоля в депо. Фосфорилирование снимает это торможение, соответственно стимуляция β1-АР ведет к увеличению активности SERCA2a [3]. Известно, что снижение активности или содержания SERCA2a приводит к ухудшению обратного захвата Ca²⁺ в саркоплазматический ретикулум, что может провоцировать развитие сердечной недостаточности [19]. Следовательно, меньший уровень экспрессии генов ADRB1 и ATP2A2 в миокарде пациентов с гипертрофией ЛЖ может свидетельствовать о неблагоприятных процессах, способствующих прогрессированию сократительной дисфункции миокарда.

С другой стороны, сниженная экспрессия гена ADRB1 может быть компенсаторным ответом на повышенный уровень катехоламинов крови, характерный для пациентов с ХСН и коррелирующий со степенью тяжести дисфункции ЛЖ [2, 20]. Однако в исследуемой выборке почти 81% пациентов принимали β-адреноблокаторы. Такая терапия позволяет устранить избыточное влияние катехоламинов на β-адренергические рецепторы и уменьшить степень ремоделирования сердца, что улучшает клинический прогноз [12]. Оказалось, что по уровню экспрессии гена ADRB1 группы пациентов, принимавших β-адреноблокаторы и не принимавших их, не различались.

При анализе влияния лекарственной терапии на уровень экспрессии гена ADRB1 зависимость обнаружена только в отношении приема препаратов АСК. Пациенты, принимавшие АСК, имели значимо более высокую экспрессию гена ADRB1. Среди пациентов, принимавших препараты АСК, также реже встречалась гипертрофия ЛЖ. Однако препараты АСК применяются у больных ХСН при строгих показаниях, например после инфаркта миокарда или в случаях ангиопластики с применением стентов с лекарственным покрытием в рамках двойной антитромботической терапии [12].

Важным фактором развития гипертрофии ЛЖ является митральная недостаточность. Митральная недостаточность I степени характеризуется незначительной митральной регургитацией (МР), II степени – умеренной, III степени – выраженной, а IV степени – тяжелой митральной регургитацией. Пациенты с незначительной или умеренной МР могут длительное время оставаться бессимптомными на фоне небольших гемодинамических компенсаторных изменений. Известно, что МР приводит к компенсаторной гипертрофии ЛЖ и увеличению конечного диастолического объема, что позволяет восстановить эффективный сердечный выброс [21]. Исследуемая нами выборка не является исключением, пациенты с митральной недостаточностью чаще имели гипертрофию ЛЖ. Однако уровень экспрессии гена ADRB1 оказался сопоставим между лицами с незначительной, умеренной МР и без МР.

Одним из ограничений нашего исследования является то, что мы не определили уровень катехоламинов у пациентов, адренореактивность организма и количество рецепторов на мембранах кардиомиоцитов, что затрудняет оценку связи между относительным уровнем экспрессии гена ADRB1 и адренореактивностью организма больных ХСН.

Таким образом, в выборке пациентов с хронической сердечной недостаточностью, развившейся на фоне ишемической болезни сердца и артериальной гипертензии, выявлено значимое снижение уровня экспрессии гена β1-адренорецептора ADRB1 в миокарде пациентов с гипертрофией левого желудочка. В то же время пациенты с разным функциональным классом сердечной недостаточности имели сопоставимый уровень экспрессии гена ADRB1. Относительная экспрессия ADRB1 оказалась более высокой у пациентов, принимавших препараты ацетилсалициловой кислоты, но не показала значимой связи с приeмом β-адреноблокаторов или ингибиторов АПФ.

Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда, проект № 20-75-00003: “Оценка ассоциации экспрессии генов Ca(2+)-транспортирующих белков саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов с тяжестью течения хронической сердечной недостаточности ишемического генеза”.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.