Генетика, 2022, T. 58, № 10, стр. 1210-1220

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проведение настоящего исследования одобрено Комитетом по биомедицинской этике НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ. Материал для исследования представлен биоптатами материнской части плаценты женщин с физиологическим течением беременности (N = 7). Сбор биоптатов осуществлялся по стандартной методике [11] акушерами-гинекологами на базе ОГАУЗ “ОПЦ им. И.Д. Евтушенко” г. Томска. Полученный материал немедленно промывался физиологическим раствором и помещался в криопробирки, которые далее хранились в жидком азоте, чтобы свести к минимуму деградацию РНК. У всех пациентов срезы плацентарной ткани были охарактеризованы гистологически с окрашиванием гематоксилин-эозином. Лазерная микродиссекция осуществлена на оборудовании PALM (Carl Zeiss, Германия) с технологией автоматизированного захвата фрагментов (“Laser Capture Microdissection”). Для выделения тотальной РНК использован набор Single Cell RNA Purification Kit (Norgen, США). Концентрация и качество РНК были оценены с помощью Agilent 2100 Bioanalyzer. Приготовление библиотек проведено по протоколу SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 (Takara, США). Массовое параллельное секвенирование выполнено на приборе Next-seq 2000 (Illumina). Выравнивание на референсный геном (hg38) было выполнено с помощью программы STAR. Аннотацию транскрипционных активных областей, полученных в настоящей работе в результате секвенирования децидуальных клеток, проводили в программной среде R c использованием базы данных “gencode.v19”. Функциональный анализ последовательностей, демонстрирующих АС, проводили с помощью веб-инструмента “WebGestalt” (WEB-based Gene SeT AnaLysis Toolkit) и базы данных “STRING” (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) [12, 13]. Анализ событий альтернативного сплайсинга выполнен в среде R с помощью пакета “SGSeq”, позволяющего прогнозировать и количественно оценивать события сплайсинга на основе данных полногеномного РНК-секвентрования. Профиль АС и экзоны в данном подходе предсказываются из прочтений, сопоставленных с эталонным геномом, и собираются в граф, описывающий события сплайсинга. События сплайсинга идентифицируются циклично с использованием графа и оцениваются количественно на основании локальных прочтений, приходящихся на начало или конец вариантов сплайсинга [14]. Экспериментальные исследования были выполнены на базе Центра коллективного пользования научно-исследовательским оборудованием ЦКП “Медицинская геномика” НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты аннотации транскрипционных активных областей, полученных в настоящей работе, свидетельствуют, что большинство из анализируемых генов соответствуют протеинкодирующим регионам генома человека (15 843). В оставшемся кластере преобладают локусы длинных некодирующих РНК и транскрибируемых непроцессированных псевдогенов (в табл. 1 приводятся усредненные данные по всем анализируемым образцам).

В соответствии с рекомендуемым подходом к анализу, описанному в ранее опубликованном исследовании [14], мы идентифицировали 149067 событий АС в 20 463 генах. Основываясь на паттернах сплайсинга, данные события можно классифицировать на семь основных типов: альтернативный промотор, взаимоисключающие экзоны, сохранение интрона, пропуск экзона, альтернативный акцепторный сайт, альтернативный терминатор и альтернативный донорский сайт, преобладающими из которых являются сохранение интрона и пропуск экзона (рис. 1). Из более чем 20 тыс. генов, экспрессирующихся в ДК плаценты, 91% (около 18 тыс.) имели больше одной изоформы РНК, а 21% (4038 генов) – более десяти изоформ. Наибольшее количество изоформ (27) идентифицировано для гена HNRNPH1, кодирующего гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин H1, представляющий собой РНК-связывающий белок, который обеспечивает субстрат для событий процессинга пре-мРНК.

Рис. 1.

Основные типы событий альтернативного сплайсинга в децидуальных клетках плаценты.

Для количественной оценки обнаруженных событий АС были рассчитаны значения коэффициента PSI (percentage spliced in); который характеризует долю каждого обнаруженного события сплайсинга во всех экспрессируемых изоформах. Экспрессия некоторых изоформ была довольно низкой (PSI < 0.05), и большинство событий АС не могли быть стабильно обнаружены во всех данных образцах. Для идентификации наиболее значимых событий АС использовали следующие критерии: значение показателя CPM (counts per million) больше десяти, доля альтернативного транскрипта (значение коэффициента PSI) больше или равна 0.05 и меньше или равна 0.95. Указанным критериям соответствовал 1871 событие АС 352 генов, из них два и более транскрипта имели 312 генов, основные биологические функции и молекулярные процессы которых, согласно базы данных “GeneOntology”, статистически значимо (false discovery rate (FDR) > 0.05) связаны с негативной и посттранскрипционной регуляцией экспрессии генов, метаболизмом мРНК, процессом биосинтеза пептидов и катаболическим процессом макромолекул клетки, связыванием с РНК, молекулами клеточной адгезии, кадгерином и др. (рис. 2).

Рис. 2.

Основные GO-категории, ассоциированные с кластером генов, для которых было идентифицировано более двух транскриптов, экспрессирующихся в ДК. Желтым цветом обозначены биологические процессы, зеленым – молекулярные функции.

В целях более детальной функциональной аннотации альтернативно сплайсированных генов нами были выбраны 158 генов, для которых были обнаружены пять и более транскриптов, экспрессирующихся в ДК (список генов доступен по запросу у авторов статьи). Анализ реконструированной с использованием программы “STRING” белок-белковой сети (рис. 3), включающей 101 продукт данных генов, свидетельствует о высокой степени их взаимодействий (более 130 парных взаимодействий имеют значения коэффициента combined_score ≥ 0.9).

Рис. 3.

Сеть белок-белковых взаимодействий продуктов альтернативно сплайсированных генов, экспрессирующихся в ДК.

Центральное место в построенной сети с максимальным числом и силой взаимодействий (node_degree ≥ 10, score ≥ 0.99) занимают следующие 17 генов: RPS27A, HNRNPK, CTNNB1, EIF4G1, HNRNPM, ACTB, HNRNPA2B1, HNRNPH1, RPS9, RPL6, EEF1B2, RPL10, RPL15, RPL23, RPL38, RPL7A, SERBP1, ассоциированных, согласно аннотации сигнальных путей в базах данных “KEGG” и “Reactome”, с инициацией и элонгацией трансляции у эукариот, а также регуляцией экспрессии белков Slit и Robo, обладающих множеством разнообразных функций, включая модуляцию ангиогенеза и адгезии клеток, опосредованную DE-кадгерином. Примечательно, что для 13 генов из данного кластера (RPS27A, HNRNPK, HNRNPM, HNRNPA2B1, HNRNPH1, RPS9, RPL6, EEF1B2, RPL10, RPL15, RPL23, RPL38, RPL7A) характерно явление ко-экспрессии.

Результаты функциональной аннотации кластера генов, характеризующихся экспрессией пяти и более транскриптов в ДК, демонстрируют их сверхпредставленность в процессах, связанных с каноническим сигнальным путем Wnt/β-катенин, регуляцией сплайсинга мРНК, убиквитинирования и формированием адгезивных контактов, что свидетельствует о важной роли альтернативно сплайсированных генов ДК в межклеточной коммуникации в плацентарной ткани, а также в механизмах эпителиально-мезенхимального перехода (табл. 2).

Известно, что путь Wnt/β-катенина является каноническим сигнальным путем Wnt, который регулирует несколько биологических процессов, включая пролиферацию, миграцию, инвазию и апоптоз. К настоящему времени накоплены данные, в основном полученные на животных моделях, которые демонстрируют ключевую роль этого сигнального пути в развитии плаценты, имплантации бластоцисты, а также регуляции пролиферации и инвазии клеток трофобласта [15–18]. Помимо этого, нарушение экспрессии компонентов пути Wnt/β-катенина было связано с широким спектром гестационных заболеваний у мышей [19].

Аналогично животным моделям, сбалансированное действие передачи сигналов по пути Wnt/β-катенина критически важно и для нормальной плацентации человека. Как гиперактивация, так и недостаточная активация передачи сигналов Wnt-пути были ассоциированы с различными репродуктивными нарушениями: снижением инвазии трофобласта, хориокарциномой, молярной беременностью, преэклампсией и невынашиванием беременности [18, 20, 23]. Механизмы, лежащие в основе данных наблюдений, предположительно связаны с ведущей ролью сигнального пути Wnt в процессах инвазии и дифференцировки трофобласта человека, опосредованной межклеточными взаимодействиями в децидуальной ткани плаценты [24]. Кроме того, обнаружено участие молекул сигнального пути Wnt в регуляции уровня ангиогенных факторов, таких как VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), гипоэкспрессия которых является важным компонентом патогенеза осложненного течения беременности [25].

В настоящее время не вызывает сомнений ключевая роль сигнального пути Wnt/β-катенина в опухолевой трансформации и прогрессии некоторых злокачественных новообразований [26, 27]. Данное наблюдение представляет особый интерес в контексте полученных нами результатов аннотации кластера генов, характеризующихся экспрессией пяти и более транскриптов в ДК, в базе данных “DisGeNET” на платформе веб-ресурса “WebGestalt” (табл. 3). Вышеобозначенные гены преимущественно ассоциированы с онкологическими заболеваниями, тем не менее, для двух генов показана связь с патологическим течением беременности. Так, ген CD46 ассоциирован с развитием HELLP-синдрома (score в базе данных “DisGeNET” составил 0.330), а ген FN1 связан с невынашиванием беременности (score = 0.300). Наряду с этим, согласно литературным данным, продукт гена FN1 – белок фибронектин является скрининговым маркером преждевременных родов и ассоциирован с развитием преэклампсии (ПЭ) [28, 29], а однонуклеотидные полиморфные маркеры гена CD46 ассоциированы как с ПЭ [30], так и с идиопатическим привычным невынашиванием беременности [31].

Необходимо отметить, что проблема взаимоотношений беременности и роста злокачественных новообразований занимает особое место в современной медицине. В первую очередь интерес к данной проблеме обусловлен сходством обоих процессов по многим признакам на молекулярном, клеточно-тканевом и организменном уровнях, включая изменения нейроэндокринного, иммунного и метаболического статуса организма, сходные фенотипические свойства эмбриональных и злокачественных клеток, такие как способность к инвазивному росту, аутокринной секреции ростовых факторов, индукции микроциркуляции, “ускользанию” из-под иммунного надзора организма и другие [32]. В рамках данной проблемы особое внимание исследователей в последние годы уделяется поиску общих сигнальных путей инвазии клеток трофобласта в децидуальную ткань плаценты и процессов опухолевой инвазии. Показано, что клетки вневорсинчатого трофобласта и раковые клетки демонстрируют очень похожий молекулярный фенотип, как на уровне транскрипционной активности генов, так и на уровне метилирования промоторов [33–35]. Следует отметить, что клетки трофобласта с их способностью к пролиферации и дифференцировке, апоптозу и выживанию, миграции, ангиогенезу и иммунной модуляции, использующие в процессе инвазии сходные с раковыми процессами молекулярные пути, делают их привлекательной моделью для изучения рака.

Примечательно, что канонический Wnt-каскад, контролирующий связывание β-катенина с транскрипционными факторами TCF/LEF, является наиболее важным патогенетическим звеном в поддержании фенотипа опухолеинициирующих клеток и эпителиально-мезенхимального перехода, необходимых для метастазирования опухоли [36]. Важно отметить, что формирование плаценты начинается с прорастания ворсинок трофобласта в децидуальную оболочку матери с последующим формированием активно пролиферирующих участков – цитотрофобластических колонн, часть наиболее дистально расположенных клеток которых также претерпевает эпителиально-мезенхимальный переход и приобретает способность к миграции и инвазии. После инициации инвазии трофобласта в децидуальную оболочку начинает формироваться пул вневорсинчатого трофобласта, принимающего активное участие в ремоделировании спиральных артерий. На молекулярном уровне эпителиально-мезенхимальный переход в плаценте может реализовываться путем различных сигнальных каскадов, включая и путь Wnt/β-катенина [37]. Примечательно, что мутации в этом каскаде ассоциированы с опухолевым ростом, участвуют в поддержании опухолеинициирующих клеток и метастазировании, а ингибиторы сигнального пути Wnt рассмативаются в качестве перспективных противоопухолевых препаратов. Так, показано, что подавление экспрессии или делеции β-катенина ингибирует образование опухолеинициирующих клеток в модели хронического миелолейкоза, острой миелоцитарной лейкемии и опухолях молочной железы [36].

Современные исследования продемонстрировали, что АС РНК, является важным уровнем регуляции экспрессии генов, нарушения которого могут способствовать росту и химиорезистентности опухолевых клеток [38, 39]. В связи с этим, аномальные изменения сплайсинга пре-мРНК считаются одной из ключевых особенностей раковых клеток, а изучение АС – одним из перспективных направлений поиска потенциальных биомаркеров для диагностики злокачественных опухолей.

Сплайсинг пре-мРНК осуществляет сплайсосома, представляющая собой высоко динамичную структуру, состоящую из рибонуклеопротеиновых комплексов, включающих в состав ряд малых ядерных РНК и около 200 белков [40]. Большая часть этих белков является регуляторами сплайсинга, которые контролируют выбор сайта сплайсинга посредством распознавания определенных участков пре-мРНК и определяют, какие участки должны войти в конечный транскрипт зрелой мРНК. В данном контексте интересными представляются полученные нами результаты функциональной аннотации генов, характеризующихся экспрессией пяти и более транскриптов в ДК, которые свидетельствуют об ассоциации данного кластера генов с такими биологическими процессами (Gene Ontology) и сигнальными путями KEGG как “Регуляция альтернативного сплайсинга мРНК с помощью сплайсосомы” и “Сплайсосома”.

Таким образом, представляются чрезвычайно перспективными дальнейшие исследования, характеризующие функциональную роль альтернативно сплайсированных генов в ген-генных сетях сигнального пути Wnt/β-катенина при физиологической и патологической беременности, а также онкологических заболеваниях. Изучение альтернативного сплайсинга ДК открывает возможности для понимания формирования на уровне транскрипции тканевых и клеточных различий, путей развития различных патологических процессов, а также некоторых механизмов плацентации и канцерогенеза, что позволит обнаружить критически важные гены и сигнальные пути, которые могут служить биомаркерами и/или мишенями для разработки таргетной терапии акушерских заболеваний и злокачественных новообразований.

АС играет фундаментальную роль во многих важнейших аспектах физиологии человека, включая гомеостаз, дифференцировку клеток, а также приобретение и поддержание идентичности тканей. В настоящей работе впервые в мире проведен анализ событий альтернативного сплайсинга в децидуальных клетках плацентарной ткани человека. Полученные результаты подтверждают важность альтернативного сплайсинга, который существенно увеличивает транскрипционное разнообразие и представляет собой значимый механизм регуляции генов в децидуальных клетках. Логический анализ реконструированной генной сети продемонстрировал высокую степень взаимодействий альтернативно-сплайсированных генов и позволил выявить регуляторные связи, обеспечивающие координированную экспрессию большинства центральных генов. Центральное место в построенной сети занимают гены RPS27A, HNRNPK, CTNNB1, EIF4G1, HNRNPM, ACTB, HNRNPA2B1, HNRNPH1, RPS9, RPL6, EEF1B2, RPL10, RPL15, RPL23, RPL38, RPL7A, SERBP1, ассоциированные с инициацией и элонгацией трансляции у эукариот, а также модуляцией ангиогенеза и адгезии клеток, опосредованной DE-кадгерином. Для более детального изучения АС и характеристики соотношения отдельных изоформ генов в ДК требуется выполнение дальнейшего комплексного анализа на основе данных геномного и транскриптомного секвенирования, а также количественной оценки представленности изоформ мРНК ключевых генов с применением метода ПЦР в реальном времени над которым в настоящее время и работают авторы.

Настоящее исследование показало, что ряд генов, подверженных альтернативному сплайсингу в децидуальных клетках, ассоциирован с осложнениями беременности, что обусловливает высокую актуальность дальнейшего изучения данного механизма процессинга РНК в когорте пациенток c акушерской патологией. Необходимо отметить, что продукты альтернативно сплайсированных генов по результатам функциональной аннотации и литературным данным также ассоциированы с развитием онкологических заболеваний через сигнальный путь Wnt/β-катенина. В связи с этим, представляются чрезвычайно перспективными дальнейшие исследования, характеризующие функциональную роль АС в ген-генных сетях каскада Wnt при физиологической и патологической беременности, а также при развитии опухолевых заболеваний, что может обеспечить не только разработку новых стратегий профилактики и терапии акушерской патологии и злокачественных новообразований, но и лучшее понимание молекулярных механизмов данных патологических состояний.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ № 20-34-90128.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.