Генетика, 2022, T. 58, № 12, стр. 1400-1417

Растительный материал, выделение ДНК и РНК, синтез кДНК

Объектом исследования были растения C. lanatus коллекции бахчевых культур ВИР им. Н.И. Вавилова и гибриды, полученные на Кубанской ОС ВИР (табл. 1). Выращивание растений для выделения ДНК проводилось в полевых условиях Кубанской ОС ВИР в 2020 г. Суммарная ДНК выделялась из зеленых листьев взрослых растений с использованием набора DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) согласно методике производителя. Для выделения РНК семена арбуза проращивались при 12-часовом световом дне при 20°C на светоустановке. Выделение РНК из стеблей проводилось через 63 дня после посева семян в грунт в трех биологических повторностях (по два растения на повторность). РНК была выделена с использованием набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN) и обработана RNase-free DNase set (QIAGEN). По матрице РНК была синтезирована одноцепочечная кДНК с использованием ОТ-M-MuLV-RH (Биолабмикс) в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мг РНК-матрицы. Все процедуры выполнялись согласно протоколам производителей используемых наборов.

Идентификация и анализ копий генов dw-1, df, dsh

Идентификация генов, гомологичных известным генам арбуза dw-1 (Cla010337), df (Cla015407) и dsh (Cla010726), проводилась в базе данных геномов Cucurbitaceae (http://cucurbitgenomics.org/) при использовании алгоритма BLASTN. Выявленные гены представлены в табл. 2. Структура неаннотированных генов предсказывалась при использовании программы FGENESH+. Аннотация функциональных доменов осуществлялась с помощью InterPro. Построение модели белка dsh осуществлялось в программе SWISS-MODEL, в качестве модели использовался белок 6lsv.1 (Crystal structure of JOX2 in complex with 2OG, Fe, and JA). Для построения множественного выравнивания использовалась программа Multalin. Филогенетический анализ осуществлялся в программе MEGA X при использовании метода Maximum likelihood на основании кодирующих последовательностей генов с бутстреп-поддержкой 1000; на полученных изображениях показаны данные значений бутстрэпа ≥70%.

Дизайн праймеров, ПЦР, количественная ПЦР

Дизайн праймеров был выполнен с использованием Oligo Primer Analysis Software v.7 (табл. 3). Амплификация ДНК проводилась в 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей 50 нг ДНК-матрицы, по 10 пг каждого праймера, 0.25 мМ каждого dNTP, 1× реакционного буфера, 15 мМ MgCl₂ и 1 U Taq-полимеразы (Синтол), при следующих условиях: 95°С 1.5 мин; 35 циклов 95°С 30 с, 50–60°С 30 с, 72°С 1 мин; 72°С 5 мин. Количественная ПЦР была проведена на кДНК в реакционной смеси объемом 15 мкл при использовании набора реагентов SYBR Green I (Синтол) и системы CFX96 Touch (Bio-Rad) при следующих условиях: 50°С 10 мин; 95°С 5 мин; 50 циклов 95°С 10 с, 60°С 30 с. Показания для построения кривых плавления продуктов ПЦР снимались при 95°С 10 с; 65°С 5 с; 95°С 50 с. Графики зависимости порогового цикла от исходной концентрации матриц строились на основе трех последовательных 3-кратных разведений. Для стандартизации количества кДНК матрицы проводилась количественная ОТ-ПЦР с праймерами к референсному гену C. lanatus Clathrin adaptor complex subunit (ClCAC) [39]. Каждый образец запускался в трех технических повторностях. Различия между генотипами были проверены с помощью T-теста, при котором значение p ≤ 0.05 считалось значимым.

Гидролиз продуктов ПЦР, электрофорез, секвенирование

Гидролиз продуктов ПЦР был проведен эндонуклеазой рестрикции EcoRI (Сибэнзим). Электрофорез проводился в агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Изображение геля получалось с помощью прибора Molecular Imager Gel Doc XR System (BioRad) с использованием УФ-излучения. Выделение ДНК из геля проводили с помощью набора для очистки ДНК diaGene (Диаэм). Выделенные фрагменты ДНК секвенировали с использованием реактива BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) и генетического анализатора 3500 (Applied Biosystems). Результаты секвенирования обрабатывались в программе UGENE. Полученные последовательности были размещены в GenBank (NCBI) под номерами OM401277–OM401308.

Анализ аллельного состояния генов dw-1, df и dsh

Zhu et al. [33] продемонстрировали, что нефункциональный аллель гена dw-1 является наиболее частой причиной появления карликового фенотипа арбуза. Авторы также предложили два различных типа молекулярных маркеров, направленных на идентификацию мутантного и аллеля дикого типа: 1) маркер Indel1, фланкирующий делецию в интроне гена, ассоциированную с карликовым фенотипом, и 2) маркер dCAPS3, основанный на амплификации и гидролизе эндонуклеазой EcoRI несинонимичной замены в кодирующей части гена [33]. Для анализа аллельного состояния гена dw-1 в сформированной выборке из коллекции ВИР, которая была представлена 12 кустовыми, двумя ультракустовыми, девятью короткоплетистыми и 28 плетистыми образцами (табл. 1), мы использовали оба типа молекулярных маркеров.

В результате нами было замечено, что маркеры Indel1 дали ложноположительный результат с плетистым образцом № 14 (сорт Солярис) (рис. 1). Остальные результаты анализа с обоими маркерами подтверждали друг друга. Мутантный аллель гена dw-1 был выявлен у двух ультракустовых и десяти кустовых фенотипов (рис. 1). Оставшиеся два кустовых фенотипа № 47 и 49, представленных образцом Азербайджан местный (K-4039), вероятно, являются мутантами по другому гену.

Рис. 1.

Анализ аллельного полиморфизма гена dw-1 среди образцов арбуза коллекции ВИР с маркерами Indel1 и dCAPS3. Список образцов приведен в табл. 1. Ожидаемая длина фрагментов при скрининге с маркером Indel1: нормальный аллель 171 пн, мутантный аллель 166 пн. Ожидаемая длина фрагментов при скрининге с маркером dCAPS3: нормальный аллель 121 пн, мутантный аллель 91 + 29 пн. Красным цветом обозначены номера карликовых образцов – мутантов по dw-1, синим цветом обозначен ложноположительный результат при скрининге с маркером Indel1, черными стрелками обозначены ультракустовые образцы, красными стрелками обозначены кустовые образцы – не мутанты по dw-1.

Кустовые фенотипы № 47 и 49 (образец Азербайджан местный, K-4039) и родственные им короткоплетистые № 46 и 48 были взяты для анализа других генов карликовости df и dsh. В данную выборку также попали ультракустовые формы № 42 и 44 и родственные им плетистые № 43 и 45 (сорт Sweet Treat, K-5373), поскольку по нашему предположению данные образцы являются мутантами не только по гену dw-1, но и по другому гену, в результате чего у них проявился такой фенотип (табл. 1).

В результате секвенирования кодирующей части гена df и интрона мутаций не было выявлено ни в одном анализируемом образце. В гене dsh нам удалось обнаружить одну несинонимичную замену во втором экзоне во всех образцах по сравнению с референсным сортом Charleston Gray, приводящую к замене глутаминовой кислоты (E) на глутамин (Q) (рис. 2) в положении 223. Однако каких-то существенных изменений в структуре белка эта замена не вызвала. Остальные выявленные мутации являлись однонуклеотидными инсерциями и делециями в интроне гена, не приводящими к изменению предсказанного белкового продукта. Таким образом, необходимо было расширить поиск генов-кандидатов для потенциально нового гена кустовости, характерного для K-4039.

Рис. 2.

Предсказанная структура белка dsh. а – изменение аминокислотного остатка глутаминовая кислота (E) на глутамин (Q) в положении 223 у проанализированных образцов арбуза по сравнению с референсным сортом Charleston Gray, б – сохранение предсказанной структуры белка dsh у проанализированных образцов арбуза по сравнению с референсным сортом Charleston Gray. Список образцов приведен в тексте статьи.

Поиск потенциальных новых генов-кандидатов, отвечающих за формирование кустового фенотипа арбуза

Далее нами был проведен поиск ортологичных и паралогичных копий генов dw-1, df и dsh в геномах представителей семейства Cucurbitaceae, секвенированных к настоящему моменту.

dw-1. В результате проведенного анализа для гена dw-1 было установлено, что в семействе Cucurbitaceae у образцов, принадлежащих к трибе Cucurbiteae (тыква крупноплодная C. maxima, тыква мускатная C. moschata), а также у дыни C. melo имеется дополнительная копия данного гена, а у тыквы обыкновенной C. pepo и тыквы серебристосемянной C. argyrosperma K. Koch – две копии гена dw-1 (табл. 2). На основании выявленных последовательностей был проведен филогенетический анализ, демонстрирующий, что дупликация dw-1 произошла у общего предка Cucurbiteae (рис. 3, синий цвет). Дополнительные копии гена dw-1 в геноме C. melo, C. pepo и C. argyrosperma образовались в результате независимых актов дупликации. У арбуза дополнительная копия гена не была обнаружена.

Рис. 3.

Анализ филогенетического сходства генов dw-1 (CDS). Жирным шрифтом выделен ген dw-1 арбуза. Зеленым и синим фоном выделены разные группы генов. Красными кругами обозначены выявленные акты дупликации генов.

df. Нам удалось выявить в геномах представителей Cucurbitaceae от двух до трех копий гена df, причем данные дупликации происходили на разных этапах эволюции семейства (табл. 2, рис. 4). Группа 1, в которую входит ген df (рис. 4, зеленый фон), представлена одним геном у всех изученных видов, кроме восковой тыквы B. hispida (Thunb.) Cogn. В ее геноме произошла дополнительная дупликация. Кроме того, при поиске гомологичных последовательностей в геноме B. hispida удалось также обнаружить четвертую аннотированную последовательность Bhi09G000068, которая лежит внутри Bhi09G000069 (табл. 2).

Рис. 4.

Анализ филогенетического сходства генов df (CDS). Жирным шрифтом выделен ген df арбуза. Красным, зеленым и синим фоном выделены разные группы генов. Красными кругами обозначены выявленные акты дупликации генов.

Вторая группа генов, обозначенная нами как df-2 (рис. 4, красный фон), образовалась в результате дупликации df-1 у предка Benincaseae. При этом в роду Cucumis произошла дополнительная дупликация гена, которая сохранилась у всех проанализированных генотипов (включая неаннотированную последовательность в хромосоме 1 в геноме C. melo), кроме C. sativus PI 183967 (табл. 2).

К третьей группе генов, обозначенной как df-3 (рис. 4, синий фон), принадлежат последовательности, обнаруженные только в роду Cucurbita, включая неаннотированную последовательность в скаффолде 029 C. argyrosperma. Данная клада, вероятно, образовалась в результате дупликации у предка Cucurbiteae.

Таким образом, в результате поиска по гомологии и анализу последовательностей нам удалось выявить дополнительную копию гена df арбуза, которую мы обозначили df2.

dsh. В результате поиска по гомологии нам удалось выявить дополнительные копии гена dsh только у тыквы обыкновенной C. pepo, арбуза C. lanatus и восковой тыквы B. hispida. Причем у B. hispida данный ген дуплицировался дважды в обеих кладах. Вероятнее всего, дупликация данного гена возникла на ранних этапах эволюции семейства Cucurbitaceae, однако не сохранилась в геномах остальных представителей семейства (рис. 5). Таким образом, нам удалось выявить в геноме арбуза дополнительную копию гена dsh, которую мы обозначили как dsh2.

Рис. 5.

Анализ филогенетического сходства генов dsh (CDS). Жирным шрифтом выделен ген dsh арбуза. Зеленым и синим фоном выделены разные группы генов. Красными кругами обозначены выявленные акты дупликации генов.

Анализ аллельного состояния и уровня экспрессии выявленных генов

Выявленные гены df2 (гиббереллин-2β-диоксигеназа) и dsh2 (гиббереллин-3β-гидроксилаза) обладают двухэкзонной структурой, как и их гомологичные копии df и dsh; в каждом из них сохранены ключевые домены PF03171 (2OG-Fe(II) oxygenase superfamily) и PF14226 (non-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal). С помощью разработанных праймеров было осуществлено секвенирование последовательностей данных генов в геномах образцов Азербайджан местный и Sweet Treat, однако каких-либо изменений в кодирующих частях генов выявлено не было. Вероятно, данные гены также не являются причиной проявления кустового фенотипа растений.

На следующем этапе был проведен анализ относительного уровня экспрессии данных генов в сравнении с dw-1, df и dsh в стеблях и листьях следующих образцов: Charleston Gray 133 (плетистый), Родник (плетистый), Азербайджан местный (короткоплетистый) и Святослав (кустовой) (табл. 1, серый фон).

Было установлено, что экспрессия dw-1, df, dsh и df2 значимо выше в стеблях растений, чем в листьях (рис. 6). Активность генов dw-1 и df оказалась значимо ниже в стеблях образцов Азербайджан местный (короткоплетистый) и Святослав (кустовой) по сравнению с плетистыми сортами Charleston Gray 133 и Родник. Ген dsh экспрессировался слабее всего в кустовом сорте Святослав. Также его экспрессия была значимо ниже в сорте Родник. Экспрессия генов df2 и dsh2 находится на низком уровне во всех проанализированных образцах, экспрессия в стеблях у разных форм не различается (рис. 6). Таким образом, гены df2 и dsh2, вероятно, являются функционально активными, однако мы предполагаем, что они не вносят вклад в изменчивость по такому признаку, как длина стебля.

Рис. 6.

Относительный уровень экспрессии генов dw-1, df, dsh и их копий df2 и dsh2 в стеблях и листьях образцов арбуза коллекции ВИР. Планки погрешности отражают стандартную ошибку. Статистическая значимость определялась T-тестом. Различия статистически значимы между образцами: * при p ≤ 0.05, ** при p ≤ 0.01, *** при p ≤ 0.001.