Генетика, 2022, T. 58, № 2, стр. 137-147

Поиск DD46E-транспозонов

Для поиска ДНК-транспозонов с каталитическим доменом DD46E был использован tBLASTn со стандартными настройками (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). В качестве матрицы для поиска были взяты аминокислотные последовательности транспозаз Mariner-18_CGi_p (Repbase) и Zvezda-1_ARub/CABPRM03. Полногеномные последовательности ДНК иглокожих были взяты из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) (табл. 1). Для того чтобы выявить полные нуклеотидные последовательности МГЭ, гомологичные транспозазе последовательности с наивысшей идентичностью к матрице были взяты из соответствующих скаффолдов вместе с фланкирующими областями протяженностью 3000 пн. Полноразмерная последовательность каждого выявленного элемента использовалась для подсчета присутствующих в геноме копий. Копии протяженностью менее 10% от длины полноразмерного МГЭ не учитывали при подсчете. Копии протяженностью от 95 до 100% от длины полноразмерного МГЭ считались полноразмерными. Копии протяженностью от 10 до 100% от длины полноразмерного МГЭ подсчитывались как общее количество копий.

Анализ последовательностей

Границы предполагаемых ОРС определяли с помощью ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/) и далее уточняли визуально. Последовательность сигнала ядерной локализации (NLS) выявляли с помощью PSORT (https://www.genscript.com). ДНК-связывающий мотив PAIRED определяли, анализируя вторичную структуру, предсказанную с помощью PSIPRED v4.0 [20]. Мотив GRPR-типа, а также DDE/D-домен идентифицировали визуально.

Филогенетический анализ

Для филогенетического анализа были взяты аминокислотные последовательности транспозаз, относящиеся к разным группам ITm-транспозонов (табл. 2), и последовательности, принадлежащие транспозонам Zvezda (табл. 3). Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей было выполнено с помощью MUSCLE [21] с использованием стандартных настроек. Филогенетический анализ проводили с использованием пакета программ MEGA X [21].

Выявление случаев горизонтального переноса

Для выявления случаев горизонтального переноса у многоклеточных была использована аминокислотная последовательность Zvezda-1_ARub/ CABPRM03. Для поиска использовали программу BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Поскольку никаких соответствий с транспозонами Zvezda найдено не было, то и дальнейший поиск в соответствии с рекомендованным алгоритмом [22] не осуществлялся.

Распространенность транспозона Zvezda у Metazoa

При исследовании разнообразия ITm-транспозонов у Asterias rubens нами был обнаружен МГЭ с необычно длинным каталитическим доменом – DD46E. Для того чтобы выяснить, единичный ли это мутантный вариант или представитель уникальной эволюционной группы ITm-транспозонов, мы изучили распространенность данного МГЭ. ITm-транспозоны с DD46E-доменом (названные нами Zvezda) обнаружились у семи организмов (т.е. у всех, имеющих в NCBI полногеномные последовательности ДНК), принадлежащих к двум классам – морским звездам (Asteroidea) и офиурам (Ophiuroidea) (табл. 3). Эти два таксона объединены в подтип Asterozoa, который отделился от остальных иглокожих примерно 541 млн лет назад (по разным оценкам 458–625 млн лет назад, http://www.timetree.org/) [23]. При исследовании всех Metazoa на предмет гомологии к DD46E-транспозону A. rubens ни у кого, кроме Asterozoa, подобный транспозон обнаружен не был. Для объяснения данного феномена можно предложить две версии – либо ДНК-транспозон Zvezda возник непосредственно в геноме предка Asterozoa, либо встроился в геном предка Asterozoa в результате горизонтального переноса от неизвестного нам организма, который на сегодняшний день либо потерял его в процессе эволюции, либо вымер, либо его полная геномная последовательность ДНК еще не определена. Так или иначе, но ДНК-транспозон Zvezda не получил распространения по древу жизни и присутствует лишь в узкой филогенетической группе, внутри которой распространился, по всей видимости, в результате дивергенции видов. Отсутствие ДНК-транспозона Zvezda у каких-либо групп организмов, кроме Asterozoa, свидетельствует об отсутствии случаев горизонтального переноса.

Анализ числа копий ДНК-транспозона Zvezda у Asterozoa показал значительную неоднородность среди изученных организмов (табл. 3). У двух видов число копий крайне низкое (2–3 копии). Четыре вида имели от 15 до 60 копий. И только один вид – Ophiothrix spiculata – имеет большое число копий – 493, при этом подавляющая часть этих копий сохранила КИП при делетированной центральной части. Согласно модели жизненного цикла, увеличение числа копий происходит на стадии амплификации в жизненном цикле МГЭ [24]. Однако мы не обнаружили в геноме O. spiculata ни одной потенциально функциональной копии элемента Zvezda, следовательно в настоящее время данный транспозон не может находиться на стадии амплификации. Очевидно, транспозон Zvezda был активен у предка Asterozoa, поэтому все Asterozoa в настоящий момент имеют малое число копий, большинство из которых повреждены и нефункциональны вследствие постепенной деградации. Вероятно, O. spiculata имеет на сегодняшний день так много копий по причине еще одного всплеска активности, произошедшего позже. Причиной второй волны активности мог быть рестарт жизненного цикла – одна из копий могла вновь стать активной вследствие случайных мутаций и вызвать “взрыв” перемещений. Также нельзя исключить и возможность кросс-индукции. Транспозаза какого-либо активного МГЭ, проникшего в геном O. spiculata, могла воздействовать и на копии элемента Zvezda, индуцируя их активность. Явление кросс-мобилизации уже было описано ранее [25]. Было обнаружено, что hobo-транспозаза способна взаимодействовать с терминальными последовательностями не только элемента hobo, но и Hermes. Хотя у ITm-транспозонов явление кросс-мобилизации не известно, такую возможность нельзя исключить, тем более что КИП, необходимые для перемещения, присутствуют практически во всех копиях.

Zvezda – новое подсемейство Tc1-подобных транспозонов

Для того чтобы определить эволюционные отношения элементов Zvezda/DD46E и ITm-транспозонов мы провели филогенетический анализ, в который были включены 11 транспозаз Zvezda/ DD46E (с сохранившимся DDE-доменом) и 45 МГЭ, представляющих различные группы ITm-транспозонов (табл. 2). В результате было установлено, что элементы Zvezda/DD46E формируют отдельную ветвь, которая располагается в одной кладе с Tc1-подобными элементами (рис. 1). Таким образом, элементы Zvezda/DD46E являются новым подсемейством Tc1-подобных элементов.

Рис. 1.

Эволюционные взаимоотношения транспозонов Zvezda и ДНК-транспозонов ITm. Филогенетический анализ выполнен в программе MEGA X c помощью метода максимального правдоподобия. Используемая модель WAG + + G + I + F. Бутстрэп 1000.

На филогенетическом дереве видно, что транспозоны Zvezda объединяются в одну монофилетическую группу с высокой бутстрэп-поддержкой. В последние годы семейство Tc1-подобных элементов хорошо изучено и в нем найден ряд семейств, которые имеют домен, отличающийся от классического домена DD34E. Это, например, TLEWI/DD36E, Traveler/DD35E, Incomer/DD36E, Intruder/DD38E, TRT/DD37E [26–30]. Все они имеют не столь существенные отличия в размере домена от классического DD34E, в то время как у ДНК-транспозона Zvezda протяженность последовательности между вторым D и E сотавляет 46 а.о. (DD46E). Филогенетический анализ, в который были включены все известные на данный момент Tc1-подобные элементы, подтвердил принадлежность транспозонов Zvezda к отдельному подсемейству (рис. 2).

Рис. 2.

Эволюционные взаимоотношения транспозонов Zvezda и Tc1-подобных транспозонов. Транспозоны морских звезд отмечены черным кругом, транспозоны офиур – черным квадратом. Филогенетический анализ выполнен в программе MEGA X c помощью метода максимального правдоподобия. Используемая модель LG + G + I. Бутстрэп 1000.

Структурные особенности ДНК-транспозона Zvezda

У большинства видов полноразмерные копии элемента Zvezda были обнаружены в единственном числе (табл. 3). Полноразмерными мы считали копии, обладающие обоими КИП и неповрежденной транспозазой. У A. rubens в геномной сборке CABPRO01 было обнаружено два полноразмерных элемента. У Ophionereis fasciata и Ophiothrix spiculata полноразмерных копий не было обнаружено.

В среднем длина полноразмерных элементов Zvezda колеблется от 1700 до 1800 пн (табл. 3), что характерно для Tc1-подобных элементов. Однако есть случаи, выбивающиеся из общей тенденции. У O. spiculata длина элемента – 3445 пн, у Patiria miniata (AKZP01) – 3742 пн, у Pisaster ochraceus – 3977 пн. В последних двух случаях КИП находятся далеко от гена транспозазы, вследствие этого общая длина элемента сильно увеличена. У O. spiculata внутри гена транспозазы присутствуют вставки, увеличивающие длину элемента, а также один из КИП находится значительно дальше от гена транспозазы, чем обычно (табл. 3).

КИП были найдены у шести видов Asterozoa, СИП – у трех видов (табл. 3). Длина КИП колебалась от 26 до 38 пн. У Patiria miniate (AKZP01) и Pisaster ochraceus КИП были нетипично короткие, 12/12 и 17/17 пн соответственно. При этом они отстояли от гена транспозазы довольно далеко, в связи с чем общая длина элемента у этих видов превышает среднюю. СИП имели длину 46/46, 52/52, а в случае O. spiculata СИП были необычно длинные – 156/159 пн. Оба исследованных вида офиур имеют длинные СИП. У некоторых видов морских звезд также есть СИП, но значительно короче. Возможно, морские звезды потеряли СИП в процессе эволюции.

Длина полноразмерных транспозаз оказалась обычная для этого семейства транспозонов, а именно от 327 до 366 а.о. (табл. 3). Неповрежденные транспозазы имеются у четырех видов. У трех видов транспозазы имеют повреждения – стоп-кодоны и делеции.

Чтобы лучше понять, являются ли транспозазы потенциально функциональными, мы изучили такие их особенности, как PAIRED-домен, AT-крюк, каталитический домен DDE/D и NLS (рис. 3). Во всех транспозазах был обнаружен PAIRED-домен. Однако у МГЭ Zvezda-1_APla/ BDGF01 и Zvezda-1_POch первая альфа-спираль PAI-субдомена отсутствует. Также у Zvezda-1_APla/ BDGF01 третья альфа-спираль RED-домена отсутствует. ARub/CABPRO01 и Zvezda-1_PMin/JADOBP01 вообще не имеют PAI-субдомена.

Рис. 3.

Множественное выравнивание транспозаз элемента Zvezda. Серым цветом выделен PAIRED-домен, состоящий из шести α-спиралей, жирным шрифтом с подчеркиванием выделен GRPR-подобный мотив, белым шрифтом на черном фоне – DDE-домен.

Последовательность NLS не была обнаружена нами ни в одной из транспозаз Zvezda, что вполне закономерно, учитывая работы коллег, в которых показана редкая встречаемость NLS в ITm-транспозонах.

АТ-крюк обнаружен у всех исследованных видов, за исключением Zvezda-1_PMin/JADOBP01. Он расположен на своем месте, между PAI- и RED-субдоменами.

Каталитический домен DD46E был обнаружен во всех транспозазах, но в аминокислотной последовательности транспозазы элемента Zvezda-1_ APla/BDGF01 первый аспартат DDE/D-домена был замещен на аспарагин (N); кроме того, промежуток между вторым D (аспартат) и Е (глутамат) составляет 47 аминокислотных остатков, а не 46, как во всех остальных транспозазах. Кроме того, данный транспозон имеет стоп-кодоны и сдвиги рамки считывания. Так же у Zvezda-1_ PMin/JADOBP01 каталитический домен был изменен (DD42E). Однако в других сборках этих же видов у мобильных элементов Zvezda-1_APla/ BDGH01 и Zvezda-1_PMin/AKZP01 присутствует классический DD46E-домен.

Подытоживая результаты проведенного анализа, потенциально функциональными можно назвать только три элемента – Zvezda-1_PMin/AKZP01, Zvezda-1_PReg и Zvezda-1_ARub/CABPRM03 (рис. 3). Сравнивая полученные данные с имеющимися данными по другим ITm-транспозонам, можно сделать вывод, что только незначительное их количество имеют функциональную транспозазу и обладают транспозиционной активностью [31–34]. Этот факт связывают с тем, что пик активности ITm-транспозонов был в далеком прошлом, а следовательно “жизненный цикл” элементов проходит свою завершающую стадию [24]. По этой причине у большинства ITm-транспозонов последовательности, кодирующие транспозазу, нарушены делециями, стоп-кодонами и сдвигами ОРС. Наличие одиночных полноразмерных/потенциально функциональных копий элемента Zvezda при наличии делетированных копий в геномах морских звезд и офиур может свидетельствовать о древности его происхождения.

Внутровидовое разнообразие

Были исследованы семь видов подтипа Asterozoa, полногеномные последовательности которых на момент исследования были представлены в NCBI (табл. 3). У всех семи видов был обнаружен мобильный элемент с каталитическим доменом DD46E. У Acanthaster planci имелось три сборки, одна из которых (GCA_000950615.1) не имела сходства с матрицей, в качестве которой мы использовали аминокислотную последовательность элемента Mariner-18_CGi, обнаруженного у Crassostrea gigas [19]. У Asterias rubens и Patiria miniatа имелось по две сборки.

Имея в доступе по две сборки видов Acanthaster planci, Patiria miniata и Asterias rubens, мы получили интересную возможность провести небольшое сравнение внутривидового разнообразия, хоть и на столь малом количестве особей. Мы сравнивали общее число транспозонов и их структуру.

Так, у Asterias rubens в двух разных сборках оказались удивительно воспроизводимые результаты – общее число транспозонов в сборке CABPRM03 и сборке CABPRO01 оказалось 3, полноразмерных копий 1 и 2 соответственно, терминальные и субтерминальные повторы оказались в обеих сборках абсолютно идентичными по длине и составили 31 и 46 пн соответственно; общая длина элементов отличалась несущественно – 1777 и 1772 пн, соответственно. Поскольку дата получения обоих образцов указана одна и та же, по всей видимости образцы были взяты в одном и том же месте, из одной популяции (табл. 1). Вероятно, данная популяция довольно гомогенна по количеству и структурным особенностям элемента Zvezda, что свидетельствует о том, что в данный момент этот транспозон не активен. Это подтверждается и малым количеством копий транспозона Zvezda в геноме Asterias rubens.

У Acanthaster planci в обеих сборках оказалось по 32 копии транспозона Zvezda. Образцы были взяты из разных регионов – A. planci (BDGF01) собран в Японии, а A. planci (BDGH01) в Австралии в одном и том же году. Равное число копий можно считать как совпадением, так и признаком однородности популяций. Сравнить строение транспозона Zvezda у A. planci оказалось невозможным, так как в одной из сборок (BDGF01) не было полноразмерных копий транспозона Zvezda (табл. 3). В базе данных присутствует и третья сборка A. planci, но результат поиска транспозона Zvezda в программе BLAST отрицательный, по всей видимости из-за частичной представленности генома (табл. 1).

Сходная ситуация и у Patiria miniatа, также представленной двумя сборками, – в одной из двух сборок ОРС транспозона Zvezda также отсутствовали полноразмерные копии, следовательно структуру транспозонов сравнить нам не удалось. Количество копий Zvezda в этих двух геномах P. miniatа – 59 и 12 (табл. 3). Образцы были взяты с промежутком в 16 лет, местом сбора указана Калифорния. Разное число копий в геномах образцов P. miniatа может быть связано с внутрипопуляционным разнообразием, а также и с тем, что сборка генома Patiria miniatа/JADOBP01 неполная, поскольку общий размер сборки Patiria miniatа/JADOBP01 на 25% меньше, чем у Patiria miniatа/AKZP01.

Изучение МГЭ Zvezda проведено в рамках Государственного задания ФИЦ ИнБЮМ “Функциональные, метаболические и токсикологические аспекты существования гидробионтов и их популяций в биотопах с различным физико-химическим режимом”, номер гос. регистрации 121041400077-1.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.