1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Генетика
  4. T. 58, № 2, 2022

Генетика, 2022, T. 58, № 2, стр. 148-156

Двухступенчатая активация lux-регулона психрофильных люминесцирующих бактерий Aliivibrio logei

С. В. Баженов 1, *, Е. С. Щеглова 1, В. В. Фомин 1, Г. Б. Завильгельский 2, И. В. Манухов 1, 2, **

1 Московский физико-технический институт
141701 Московская область, Долгопрудный, Россия

2 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра “Курчатовский институт”
117545 Москва, Россия

* E-mail: bazhenov1994@gmail.com
** E-mail: manukhovi@mail.ru

Поступила в редакцию 30.04.2021
После доработки 01.07.2021
Принята к публикации 12.07.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Lux-регулон психрофильных морских люминесцентных бактерий Aliivibrio logei контролируется “quorum sensing”-системой типа LuxI/LuxR. В данной работе определен характер аутоиндуктор-зависимой регуляции промоторов luxI и luxCDABEG-генов как по скорости синтеза аутоиндуктора и интенсивности биолюминесценции клеток A. logei, так и в гетерологичной системе в клетках Escherichia coli с репортерными генами luxCDABE Photorhabdus luminescens, находящимися под контролем исследуемых промоторов. Показано, что существуют различия в аутоиндуктор-зависимой активации оперона luxCDABEG и отдельно расположенного гена luxI A. logei. Экспрессия luxI усиливается в присутствии N-3-оксо-гексаноил-L-гомосерин лактона в концентрациях порядка 10 нМ, а экспрессия генов luxCDABEG усиливается при значительно больших концентрациях – от 1 мкМ и выше. Это определяется как последовательностью сайта посадки регуляторных белков lux-бокс2 и lux-бокс1 в составе соответствующих промоторов, так и свойствами двух белков LuxR1 и LuxR2, различающихся по способности связываться с аутоиндукторами.

Ключевые слова: чувство кворума, люминесценция, аутоиндуктор, регуляция, Aliivibrio logei, luxR.

Люминесценция морских бактерий Aliivibrio fischeri и Aliivibrio logei управляется по механизму “quorum sensing” (QS), позволяющему за счет синтеза специальных сигнальных веществ, аутоиндукторов (АИ) и детекции их с помощью регуляторных белков типа LuxR осуществлять скоординированную регуляцию экспрессии генов с использованием N-3-оксо-гексаноил-L-гомосерин лактона (3OC6-HSL) в качестве АИ [1–5]. У бактерий вида A. fischeri гены luxCDABEG, определяющие светимость клетки, объединены в один оперон с геном luxI, отвечающим за синтез АИ, и регулируются совместно, а регуляторный ген luxR расположен рядом с промотором оперона, но ориентирован в противоположном направлении [6]. Психрофильные бактерии A. logei значительно отличаются от мезофильных бактерий вида A. fischeri по архитектуре lux-оперона: ген luxI и кассета luxCDABEG транскрибируются с отдельных промоторов и регулируются двумя гомологичными генами luxR2 и luxR1, расположенными на хромосоме непосредственно рядом с регулируемыми промоторами [5, 7].

Ранее в гетерологичной системе в клетках Escherichia coli было проведено сравнение регуляции промоторов генов luxI и luxCDABEG A. logei [8]. Исследуемые промоторы клонировались вместе с ближайшими регуляторными генами: PluxI вместе с luxR2 и PluxCDABEG вместе с luxR1. Было показано, что комбинация PluxI с luxR2 обеспечивает большую чувствительность к АИ и большую амплитуду индукции, чем комбинация PluxCDABEG с luxR1. В работе [9] в экспериментах в гетерологичной системе клеток E. coli было показано, что внесение гена luxR2 A. logei в trans-положение увеличивает чувствительность к АИ и амплитуду ответа промотора PluxCDABEG, клонированного в cis-положении с геном luxR1.

В настоящей работе была исследована регуляция luxI и luxCDABE промоторов в клетках A. logei и проведено сравнение результатов с данными, полученными в гетерологичных системах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и плазмиды

В работе использовались штаммы A. logei K18-44 и A. logei KCh1 дикого типа [3, 10] и E. coli MG1655 [11], трансформированный гибридными плазмидами. Для исследования регуляции отдельных промоторов использовались гибридные плазмиды на основе вектора pDEW201 [12], в котором перед генами luxCDABE Photorhabdus luminescens встраивались исследуемые промоторы (см. табл. 1).

Таблица 1.

Плазмиды, использованные в работе

Плазмида Описание Ссылка на источник
pIVA Вектор pDEW201, в котором luxR1 A. logei под контролем PluxR1 A. logei, luxCDABE P. luminescens под контролем PluxCDABEG A. logei, Apr [8]
pSV16 pDEW201, в котором luxR2 A. logei под контролем PluxR2 A. logei, luxCDABE P. luminescens под контролем PluxI A. logei, Apr [13]
pIV3 Вектор pACYC184, в котором luxR1 A. logei под контролем собственного промотора, встроенный в BamHI сайт, Cmr [8]
pIV2 pACYC184, в котором luxR2 A. logei под контролем собственного промотора, встроенный в BamHI сайт, Cmr [8]
pD-lb1 pDEW201, в котором luxCDABE P. luminescens под контролем PluxCDABEG A. logei с нативной последовательностью lux-бокс1: CTCTGTAAAGTTATACAGGT Настоящая работа
pD-lb2 pDEW201, в котором luxCDABE P. luminescens под контролем PluxCDABEG A. logei с заменой последовательности lux-бокс1 на lux-бокс2: TCCTGTAATATTGTACAGGT Настоящая работа
pVFR1 pDEW201, в котором luxR A. fischeri под контролем собственного промотора, luxCDABE P. luminescens под контролем PluxICDABEG A. fischeri, Apr [14]
pSVRAF pACYC184, в котором luxR A. fischeri под контролем собственного промотора, встроенный в BamHI сайт, Cmr [15]

Условия культивирования

Клетки A. logei выращивались при температуре 12–16°C в жидкой среде SWT (морская соль 15 г/л, триптон 5 г/л, др. экстракт 2.5 г/л, глицерин 3 г/л) с постоянным перемешиванием (150 об./мин) или на чашках с агаризованной (15 г/л) SWT. Клетки E. coli выращивали в среде LB при температуре 37°C.

Конструирование гибридных плазмид

Для получения pD-lb2 фрагмент хромосомальной ДНК A. logei KCh1 был амплифицирован с использованием праймеров 5'-GATTTCCTGTAATATTGTACAGGTTTACCTAAATAATTACCCTGCTA-3' и 5'-GACACCGCCGATGATAATTGGA-3', клонирован в pTZ57R/T векторе, а затем перенесен по сайтам рестрикции EcoRI/BamHI в вектор pDEW201. В последовательности праймера подчеркиванием выделена последовательность lux-бокс. Для получения pD-lb1 фрагмент хромосомальной ДНК A. logei KCh1 был амплифицирован с использованием праймеров 5'-GGATCCGATACTCTGTAAAGTTATACAGGTTTACCTA-3' и 5'-GACACCGCCGATGATAATTGGA-3', клонирован в pAL2-T векторе, а затем перенесен по BamHI в вектор pDEW201 с отбором клонов по ориентации вставки так, чтобы гены luxCDABE P. luminescens были под контролем встроенного промотора A. logei.

Реактивы

Сборка гибридных плазмид проводилась с использованием ДНК-полимеразы Taq (Евроген, Россия), эндонуклеаз рестрикции EcoRI и BamHI (Promega, США), фосфатазы и лигазы T4 (Thermo Scientific, США). Аутоиндуктор 3OC6-HSL приобретен у SigmaAldrich (США). Для приготовления SWT использовали морскую соль производства RedSea (Гватемала). Триптон, дрожжевой экстракт, агар-агар и хлорид натрия были приобретены у компании “Диа-М” (Россия), глицерин – AppliChem (США).

Измерение биолюминесценции клеток

Биолюминесценцию клеток измеряли с использованием планшетного люминометра Synergy HT (Biotek, США) и высокочувствительного кюветного люминометра “Биотокс-7ВМ” (БиоФизТех, Россия) при комнатной температуре.

В экспериментах с биосенсорными клетками E. coli культуру клеток выращивали до OD 0.1–0.2, затем разделяли на аликвоты по 180 мкл, к клеткам добавляли контрольный раствор, раствор аутоиндуктора или исследуемые аутоиндуктор-содержащие среды в различных разведениях (по 20 мкл), после чего проводили периодические измерения светимости. В экспериментах с клетками A. logei суспензию клеток по 200 мкл переносили в кювету непосредственно перед измерением.

Определение концентрации АИ в образцах надосадочной культуры клеток A. logei

Определение концентрации АИ в растворе проводили с использованием цельноклеточного lux-биосенсора E. coli MG1655 pVFR1 pSVRAF (за счет повышенного содержания регуляторного гена luxR A. fischeri достигается повышенная чувствительность к АИ [16]), люминесценция которого возрастает в дозозависимой манере после добавления АИ в концентрациях от 0.03 до 100 нМ. Калибровку проводили по 3OC6-HSL – основному АИ в QS типа LuxR/LuxI в бактериях рода Aliivibrio [4, 17].

Определение скорости синтеза АИ в зависимости от концентрации АИ в среде

Прирост концентрации АИ определяли следующим образом: 1 – измерение [АИ]t1; 2 – инкубация определенный промежуток времени; 3 – измерение концентрации АИ ([АИ]t2); 4 – расчет прироста концентрации АИ по формуле

(1)
$\Delta \left[ {{\text{АИ}}} \right] = {{\left[ {{\text{АИ}}} \right]}_{{t2}}} - {{\left[ {{\text{АИ}}} \right]}_{{t1}}},$
где t1 и t2 – время забора проб для измерения концентрации АИ.

Скорость синтеза АИ в зависимости от концентрации АИ в среде определяли следующим образом: 1 – измерение [АИ]t1; 2 – экзогенное добавление АИ от 1 нМ до 10 мкМ ([АИ]ex), инкубация 4 ч; 3 – измерение концентрации АИ [АИ]t2; 4 – расчет прироста концентрации АИ по формуле

(2)
$\Delta [{\text{АИ}}] = {{[{\text{АИ}}]}_{{t2}}} - {{[{\text{АИ}}]}_{{{\text{ex}}}}} - {{{\text{[АИ}}]}_{{t1}}}.$

При определении удельной скорости синтеза АИ значение ∆[АИ] делили на площадь под графиком зависимости оптической плотности культуры клеток A. logei от времени:

(3)
$\left( {\frac{d}{{dt}}{{{[{\text{АИ}}]}}_{{{\text{уд}}}}}} \right) = {{\Delta [{\text{АИ}}]} \mathord{\left/ {\vphantom {{\Delta [{\text{АИ}}]} {\int\limits_{t1}^{t2} {{\text{OD}}\left( t \right)dt} ,}}} \right. \kern-0em} {\int\limits_{t1}^{t2} {{\text{OD}}\left( t \right)dt} ,}}$
где OD(t) – функция зависимости оптической плотности культуры клеток A. logei от времени.

Статистическая обработка результатов

Все эксперименты с культурами клеток A. logei и E. coli проводились в трех повторах. Погрешность при измерении люминесценции и скорости синтеза АИ вычислялась по формуле стандартного отклонения на основе трех повторов, ее значение на графиках отражено планками ошибок.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Люминесценция и синтез АИ клетками A. logei

Для изучения работы QS-системы типа LuxI/LuxR в клетках бактерий A. logei, в частности регуляции генов luxCDABEG и luxI, проводилось культивирование клеток A. logei K18-44 в жидкой среде с регулярным измерением оптической плотности, люминесценции и концентрации АИ в среде (рис. 1,а). На основе полученных данных были рассчитаны удельная светимость и удельная скорость синтеза АИ в расчете на единицу оптической плотности культуры клеток (рис. 1,б).

Рис. 1.

Изменение люминесценции и скорости синтеза АИ в процессе культивирования клеток A. logei K18-44 и влияние концентрации АИ на эти процессы. а – график зависимости оптической плотности, концентрации АИ и люминесценции культуры клеток A. logei K18-44 от времени культивирования. На графике добавлены линии тренда, характеризующие показатель экспоненты для каждой из измеряемых величин; б – график изменения удельной светимости и синтеза АИ в расчете на 1 OD в зависимости от концентрации АИ в среде.

В ранних фазах роста культуры клетки делятся с постоянной скоростью, и зависимость оптической плотности культуры приближенно описывается следующей формулой:

(4)
${\text{OD(}}t{\text{)}} = {\text{O}}{{{\text{D}}}_{0}}{{e}^{{at}}},$
где OD0 – это оптическая плотность культуры в начале эксперимента, параметр a определяет темпы роста и зависит от множества факторов эксперимента, таких как штамм, температура, среда, скорость перемешивания и т.п., а t – это переменная времени. Если пренебречь деградацией АИ и считать, что каждая клетка синтезирует его с одинаковой скоростью в определенном интервале времени, то скорость синтеза АИ культурой клеток в целом будет зависеть от времени также экспоненциально:
$\frac{{d[{\text{АИ}}]}}{{dt}} = C{\text{OD(}}t{\text{) = }}C{\text{O}}{{{\text{D}}}_{0}}{{e}^{{at}}},$
где C – это скорость синтеза АИ в расчете на единицу OD в единицу времени. Для получения зависимости концентрации АИ от времени необходимо проинтегрировать уравнение (5):
(6)
$[{\text{АИ}}] = {{[{\text{АИ}}]}_{0}} + \frac{1}{a}C{\text{O}}{{{\text{D}}}_{0}}{{e}^{{at}}},$
где [АИ]0 – это концентрация АИ в начале эксперимента. Из формул (4) и (6) явным образом следует, что при постоянстве скорости синтеза АИ каждой отдельной клеткой кривые концентрации АИ и оптической плотности культуры должны приближаться экспонентами с одинаковыми показателями a. Как видно из графика на рис. 1,a, эти кривые аппроксимируются экспонентами со значительно отличающимися показателями, причем показатель экспоненты кривой накопления АИ в среде выше. Кривые люминесценции и оптической плотности на графике (рис. 1,a) практически параллельны, что означает одинаковую светимость каждой отдельной клетки, до отметки 12.5 ч инкубации. После 12.5 ч наблюдается резкое возрастание люминесценции в расчете на клетку. Вышеописанный резкий рост удельной светимости культуры происходит в позднелогарифмической фазе роста культуры, когда концентрация АИ достигает значений порядка 1 мкМ.

Удельная скорость прироста концентрации АИ в расчете на клетку (∆[АИ]уд) начинает резко возрастать при концентрации АИ выше 10 нМ (рис. 1,б). Это свидетельствует об активации экспрессии гена luxI и росте скорости синтеза АИ в расчете на одну клетку при концентрациях АИ 10 нМ и выше.

Таким образом, мы наблюдаем двухэтапную активацию QS-системы A. logei, где при низких концентрациях активируется промотор гена АИ-синтетазы luxI и лишь при высоких концентрациях АИ активируется экспрессия генов люминесценции luxCDABEG.

Люминесценция и синтез АИ клетками A. logei при экзогенном добавлении АИ

Рост люминесценции A. logei в зависимости от АИ был проверен с помощью добавления к культуре с неактивированной QS-системой химически синтезированного АИ в различных концентрациях. Была взята культура A. logei K18-44, выращенная до OD = 0.5, отмыта от АИ стерильной средой SWT и затем разделена на аликвоты, к которым добавлялись различные концентрации экзогенного АИ от 10 нМ до 1 мМ. После инкубации в течение четырех часов измерялась люминесценция образцов (рис. 2).

Рис. 2.

Зависимость люминесценции культур клеток A. logei K18-44 от концентрации экзогенного АИ. Измерение проводилось через 4 ч после добавления АИ.

Как видим из данных, приведенных на рис. 2, рост люминесценции начинается только при высоких концентрациях экзогенно внесенного АИ – от 1 мкМ и выше.

Изменение интенсивности синтеза АИ клетками A. logei в зависимости от концентрации АИ было определено с помощью добавления к культуре с неактивированной QS-системой химически синтезированного АИ в различных концентрациях. Была взята культура A. logei K18-44, выращенная до OD = 0.2, отмыта от АИ стерильной средой SWT и затем разделена на аликвоты. Измерения АИ в пробе после отмывки и концентрирования показали, что к началу эксперимента аликвоты содержали не более 1 нМ АИ. К аликвотам добавлялись различные концентрации экзогенного АИ от 1 нМ до 10 мкМ. После инкубации в течение четырех часов измерялась концентрация АИ в образцах (рис. 3).

Рис. 3.

Зависимость прироста концентрации АИ за четыре часа в культуре клеток A. logei от концентрации АИ в начале временного интервала.

Как можно видеть по графику на рис. 3, синтез АИ клетками A. logei значительно зависит от его концентрации в среде – при концентрациях выше 10 нМ АИ в среде активируется промотор PluxI и увеличивается экспрессия гена аутоиндуктор-синтетазы luxI. При этом в неактивированном состоянии клетки A. logei синтезируют АИ со скоростью порядка 10 нМ/(OD × час).

Определение АИ-зависимой регуляции PluxI и PluxCDABEG A. logei в гетерологичной системе E. coli

Для подтверждения различия АИ-зависимой регуляции генов luxCDABEG и luxI клеток A. logei был проведен сравнительный анализ их регуляции в гетерологичной системе клеток E. coli (рис. 4). Были использованы клетки E. coli MG1655, трансформированные плазмидой pSV16, в которой имеется ген luxR2, а гены luxCDABE P. luminescens поставлены под контроль PluxI, или плазмидой pIVA с luxR1 геном и luxCDABE P. luminescens под контролем PluxCDABEG (табл. 1). Активность промоторов оценивалась по люминесценции соответствующих культур клеток E. coli, измеренной через 2 ч после экзогенного добавления 3OC6-HSL.

Рис. 4.

Сопоставление результатов исследования АИ-зависимой регуляции промоторов PluxI и PluxCDABEG A. logei по скорости синтеза АИ и люминесценции клеток A. logei и по люминесценции биосенсорных клеток E. coli MG1655 pSV16 (промотор PluxI) и E. coli MG1655 pIVA (промотор PluxCDABEG).

Результаты определения характера АИ-зависимой активации промоторов PluxI и PluxCDABEG A. logei в клетках A. logei и E. coli хорошо согласуются. Очевидны различия исследуемых промоторов по амплитуде активации и по пороговым концентрациям АИ. PluxI, а следовательно и синтез АИ в A. logei активируются при концентрациях АИ от 10 нМ. PluxCDABEG A. logei как в клетках A. logei, так и в гетерологичной системе E. coli активируется при концентрациях АИ от 1 мкМ.

Роль последовательностей lux-боксов в последовательной активации промоторов PluxI и PluxCDABEG

Промоторы PluxI и PluxCDABEG различаются по последовательности связывания LuxR-белков с ДНК (lux-бокс2 и lux-бокс1 соответственно). Было проведено сравнение последовательностей lux-боксов промоторных областей luxR–luxI A. fischeri, luxR1–luxС и luxR2–luxI A. logei (рис. 5).

Рис. 5.

Сравнение последовательностей lux-боксов промоторных областей luxR-luxI A. fischeri (AF), luxR1-luxС и luxR2-luxI A. logei (AL). Выделение нуклеотидов: синим – нуклеотиды критичные для связывания LuxR согласно [18]; зеленым – расположенные симметрично в lux-боксе; полужирным шрифтом – консервативные позиции.

Большинство нуклеотидов в lux-бокс-последовательности являются консервативными и совпадают даже в геномах бактерий разных видов (A. fischeri, A. logei и A. salmonicida). Среди консервативных позиций есть описанные в [18] – CTG- -CAG‑, ключевые для связывания LuxR с сайтом посадки. Также сразу видна разница в степени симметричности разных lux-боксов: наиболее симметричный в промоторе PluxI A. fischeri, менее симметричный в промоторе PluxI A. logei и наименее симметричный в промоторе PluxCDABEG A. logei.

Чтобы исследовать роль последовательности lux-боксов в наблюдаемых различиях в регуляции промоторов PluxI и PluxCDABEG, были сконструированы плазмиды pD-lb1 и pD-lb2, в которых гены luxCDABE P. luminescens находятся под контролем промотора PluxCDABEG A. logei с разными lux‑бокс-последовательностями – lux-бокс1 и lux-бокс2 соответственно (рис. 5). Плазмиды pD-lb1 и pD-lb2 не содержат гены luxR1 или luxR2 в отличие от pSV16 и pIVA, эти гены вносились в клетки на отдельных плазмидах pIV3 и pIV2 (табл. 1) соответственно. Такой подход позволил сравнить специфичность каждого из LuxR-белков к каждому из сайтов связывания и изучить влияние замены lux-бокса на регуляцию промотора при прочих равных условиях. Клетки E. coli MG1655 трансформировали различными комбинациями плазмид pD-lb1/pD-lb2 и pIV3/pIV2, после чего исследовали зависимость люминесценции полученных клеток от концентрации АИ в среде (рис. 6).

Рис. 6.

Зависимость люминесценции клеток E. coli MG1655, несущих гены luxCDABEG P. luminescens под контролем PluxCDABE A. logei с нативным lux-боксом и lux-боксом из PluxI A. logei в комбинации с геном luxR1 A. logei или luxR2 A. logei, от концентрации АИ в среде.

Индукция промотора, содержащего нативный lux-бокс промотора PluxCDABEG (lb1), происходит при бо́льших концентрациях АИ и имеет меньшую амплитуду по сравнению с таковыми для промотора, содержащего lux-бокс промотора PluxI (lb2). Эта закономерность наблюдается в случае с обоими регуляторными генами luxR1 и luxR2, откуда следует, что природная последовательность lux-бокса из PluxCDABEG A. logei обладает значительно меньшим сродством к обоим гомологам: LuxR1 и LuxR2.

В этом же эксперименте впервые однозначно было показано, что сам ген luxR2 обеспечивает значительно бо́льшую чувствительность клетки к АИ, чем ген luxR1. Этот эффект наблюдается для обеих последовательностей lux-бокса в промоторной области (сравнение кривых с закрашенными символами и кривых с пустыми символами, рис. 6). LuxR2 активирует обе версии промотора при концентрациях АИ 1 и 10 нМ в зависимости от последовательности сайта связывания, а LuxR1 – при концентрациях 1 и 10 мкМ соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на то что бактерии A. logei были обнаружены и описаны более 40 лет назад [19], а структура их lux-оперона известна с 2011 г. [13], двухэтапная активация lux-оперона бактерий A. logei с последовательной активацией экспрессии генов luxI и luxCDABEG (рис. 1,б) была впервые показана в настоящей работе. Эти результаты проливают свет на значение отличий в структуре lux-оперонов A. fischeri и A. logei.

Промоторы гена luxI у бактерий A. logei и A. fischeri обладают очень схожими характеристиками по амплитуде индукции и пороговым концентрациям АИ, необходимым для их индукции (порядка 10 нМ), что было показано в гетерологичной системе клеток E. coli [13]. Но в клетках A. fischeri этот промотор регулирует одновременно два процесса – синтез АИ и люминесценцию [20], а у A. logei только синтез АИ. При этом активация промотора генов luxCDABEG A. logei происходит лишь при высоких концентрациях АИ (порядка 1–10 мкМ, рис. 2). Концентрация АИ 10–20 мкМ в среде является предельной, более высокой концентрации АИ не удавалось достичь при культивировании клеток A. logei в жидкой среде SWT при температурах от 4 до 20°C (наши неопубликованные данные), это согласуется с результатами для A. salmonicida [4].

Различия в регуляции промоторов генов luxI и luxCDABEG были описаны в гетерологичной системе клеток E. coli с использованием биосенсорных плазмид [21] и в клетках A. logei по скорости синтеза АИ и люминесценции при различных концентрациях АИ (настоящая работа), а полученные результаты с высокой точностью согласуются друг с другом (рис. 4).

Таким образом, наблюдаются два этапа активации lux-оперона: при концентрациях АИ от 10 нМ усиливается его синтез, а при достижении концентрации 1–10 мкМ начинает расти светимость клеток. У психрофильных бактерий стадия роста при промежуточных концентрациях АИ может быть растянута до нескольких суток, в то время как для мезофильных бактерий рост культуры и активация QS-системы происходят быстро, например при 28°С lux-оперон A. fischeri полностью активируется в течение часа или даже быстрее [14]. Полученные результаты позволяют высказать гипотезу: двухстадийный механизм регуляции QS-системы позволяет психрофильным бактериям экономить ресурсы и не использовать восстановленные эквиваленты для люминесценции клеток в процессе накопления АИ до тех пор, пока плотность популяции не достигнет значений, обеспечивающих видимость биолюминесценции невооруженным глазом.

Исследования, проводимые С.В. Баженовым, включающие разработку идеи, постановку основных экспериментов, обработку результатов и написание манускрипта, выполнены при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-34-90020.

Работа И.В. Манухова, включающая разработку идеи, плана экспериментов и интерпретацию результатов, финансировалась в рамках проекта FSMG-2020-0003, соглашение № 075-00337-20-03, заказчик Министерство науки и высшего образования РФ.

Работа В.В. Фомина, включающая эксперименты с различными lux-боксами, финансировалась в рамках соглашения № 075-15-2019-1672 от 31.10.2019 г., заказчик Министерство науки и высшего образования РФ.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. Quorum sensing in bacteria: The LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators // J. Bacteriol. 1994. V. 176. № 2. P. 269–275. https://doi.org/10.1128/jb.176.2.269-275.1994

  2. Eberhard A., Burlingame A.L., Eberhard C. et al. Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferase // Biochemistry. 1981. V. 20. № 9. P. 2444–2449. https://doi.org/10.1021/bi00512a013

  3. Khrulnova S.A., Manukhov I.V., Zarubina A.P., Zavilgelsky G.B. Aliivibrio logei KCh1 (Kamchatka Isolate): Biochemical and bioluminescence characteristics and cloning of the lux operon // Microbiology. 2010. V. 79. № 3. P. 349–355. https://doi.org/10.1134/S0026261710030112

  4. Hansen H., Purohit A.A., Leiros H.K.S. et al. The autoinducer synthases LuxI and AinS are responsible for temperature-dependent AHL production in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida // BMC Microbiol. 2015. V. 15. № 1. P. 1–13. https://doi.org/10.1186/s12866-015-0402-z

  5. Manukhov I.V., Khrul’nova S.A., Baranova A., Zavilgelsky G.B. Comparative analysis of the lux operons in Aliivibrio logei KCh1 (a Kamchatka Isolate) and Aliivibrio salmonicida // J. Bacteriol. 2011. V. 193. № 15. P. 3998–4001. https://doi.org/10.1128/JB.05320-11

  6. Devine J.H., Shadel G.S., Baldwint T.O. et al. Identification of the operator of the lux regulon from the Vibrio fischeri strain ATCC7744 (bioluminescence/regulation/autoinduction/repression/activator) // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 5688–5692.

  7. Fidopiastis P.M., Sørum H., Ruby E.G. Cryptic luminescence in the cold-water fish pathogen Vibrio salmonicida // Arch. Microbiol. 1999. V. 171. № 3. P. 205–209. https://doi.org/10.1007/s002030050700

  8. Khrulnova S.A., Baranova A., Bazhenov S.V. et al. Lux-operon of the marine psychrophilic bacterium Aliivibrio logei: A comparative analysis of the LuxR1/LuxR2 regulatory activity in Escherichia coli cells // Microbiology. 2016. V. 162. № 4. P. 717–724. https://doi.org/10.1099/mic.0.000253

  9. Konopleva M.N., Khrulnova S.A., Baranova A. et al. A combination of luxR1 and luxR2 genes activates Pr-promoters of psychrophilic Aliivibrio logei lux-operon independently of chaperonin GroEL/ES and protease Lon at high concentrations of autoinducer // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2016. V. 473. № 4. P. 1158–1162. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2016.04.032

  10. Bazhenov S.V., Khrulnova S.A., Konopleva M.N., Manukhov I.V. Seasonal changes in luminescent intestinal microflora of the fish inhabiting the Bering and Okhotsk seas // FEMS Microbiol. Lett. 2019. V. 366. № 4. https://doi.org/10.1093/femsle/fnz040

  11. Guyer M.S., Reed R.R., Steitz J.A., Low K.B. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1981. V. 45. Pt 1. P. 135–140. https://doi.org/10.1101/sqb.1981.045.01.022

  12. Van Dyk T.K., Rosson R.A. Photorhabdus luminescens luxCDABE promoter probe vectors // Methods Mol. Biol. 1998. V. 102. P. 85–95. https://doi.org/10.1385/0-89603-520-4:85

  13. Хрульнова С.А., Манухов И.В., Завильгельский Г.Б. “Quorum sensing” регуляция экспрессии lux-генов иструктура lux-оперона у морских бактерий Aliivibrio logei // Генетика. 2011. Т. 47. № 12. С. 1596–1603.

  14. Манухов И.В., Котова В.Ю., Завильгельский Г.Б. Внутриклеточные факторы регуляции экспрессии lux-оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 525–531.

  15. Melkina O.E., Goryanin I.I., Bazhenov S.V. et al. Comparative analysis of Aliivibrio logei luxR1 and luxR2 genes regulation in Escherichia coli cells // Arch. Microbiol. 2019. V. 201. № 10. P. 1415–1425. https://doi.org/10.1007/s00203-019-01691-3

  16. Bazhenov S., Novoyatlova U., Scheglova E. et al. Influence of the luxR regulatory gene dosage and expression level on the sensitivity of the whole-cell biosensor to Acyl-Homoserine Lactone // Biosensors. 2021. V. 11. № 6. P. 166. https://doi.org/10.3390/bios11060166

  17. Colton D.M., Stabb E.V., Hagen S.J. Modeling analysis of signal sensitivity and specificity by Vibrio fischeri LuxR variants // PLoS One. 2015. V. 10. № 5. P. 1–21. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126474

  18. Antunes L.C.M., Ferreira R.B.R., Lostroh C.P., Greenberg E.P. A mutational analysis defines Vibrio fischeri LuxR binding sites // J. Bacteriol. 2008. V. 190. № 13. P. 4392–4397. https://doi.org/10.1128/JB.01443-07

  19. Bang S.S., Baumann P., Nealson K.H. Phenotypic characterization of Photobacterium logei (sp. nov.), a species related to P. fischeri // Curr. Microbiol. 1978. V. 1. № 5. P. 285–288. https://doi.org/10.1007/BF02601683

  20. Engebrecht J.A., Silverman M. Identification of genes and gene products necessary for bacterial bioluminescence // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. № 13. P. 4154–4158. https://doi.org/10.1073/pnas.81.13.4154

  21. Манухов И.В. Структура lux-оперона и механизмы регуляции типа “quorum sensing” у морских бактерий: Дис. … д-ра биол. наук. 2011. 151 с.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Генетика

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал