Генетика, 2022, T. 58, № 4, стр. 479-482

Начиная со времени открытия тяжелой воды (1932 г.) началось изучение влияния больших концентраций ее на биологические объекты. Концентрированная тяжелая вода, в которой все атомы водорода заменены на дейтерий, отличается по своим физическим свойствам от обычной воды, в которой присутствие небольшого количества (0.0149%) тяжелой воды практически не влияет на ее физические свойства. Различаются соединения с обычным и тяжелым водородом и по химическим свойствам. Замена обычного водорода на тяжелый ведет прежде всего к снижению скоростей химических реакций (в 3–10 раз). Естественно, что замена в живом организме значительной части атомов водорода на атомы дейтерия поведет к замедлению многих химических реакций, определяющих сложные биологические процессы в клетках, тканях и в организме в целом. Таким исследованиям посвящена обширная литература [1–5].

Ранее нами были проведены исследования влияния оксида дейтерия (D₂O) на индуцибельные процессы в бактериальной клетке с использованием lux-биосенсоров на основе штамма E. coli K12 MG1655. Биосенсоры содержат гибридную плазмиду, несущую luxCDABE-оперон фотобактерии Photorhabdus luminescens, поставленный под контроль промотора генов recA, сolD и alkA. Биосенсоры люминесцируют в результате активации указанных промоторов в ответ на повреждение ДНК химическими генотоксикантами и мутагенами [6–8]. Было показано, что предварительное культивирование клеток E. сoli в среде с D₂O усиливает активацию SOS-регулона, индуцированную 4-нитрохинолин-1-оксидом, N-нитрозо-N-метилмочевиной (НММ) и митомицином С [7], а также ada-регулона, индуцированную алкилирующими соединениями нитрозометилмочевиной и метилметансульфонатом (ММС) [8]. В этой связи возникает вопрос о механизме влияния D₂O на процессы активации индуцибельных регулонов в клетках E. coli. Возможной причиной в случае SOS-регулона может быть усиление ковалентных связей типа N–H, а также усиление связи генотоксикантов с ДНК в результате изотопного замещения легкого (протий) на тяжелый изотоп (дейтерий). В активации ada-регулона важную роль в качестве регулятора транскрипции играет алкилированный белок Ada. Показано, что метилирование N-домена белка Ada приводит к повышению аффинности к промоторным участкам ada-регулона и превращает его в сильный транскрипционный активатор [9–11]. Замена протия на дейтерий в этих последовательностях ДНК или в самом белке может быть одним из главных факторов стабилизации связи между промотором и алкилированным белком, следовательно, существенным фактором в изотопном эффекте D₂O.

В настоящей работе с целью получения дополнительного доказательства влияния D₂O на транскрипцию ada-регулона проведено исследование экспрессии хромосомных генов alkA и ada, входящих в ada-регулон E. coli, и плазмидного гена luxA, находящегося под контролем промотора гена alkA, с помощью метода ОТ-ПЦР.

Для сравнительного изучения индукции аda-регулона в дейтерированных и в недейтерированных (контрольных) культурах E. coli использовали биосенсор E. coli K12 MG1655 (pAlkA–lux), люминесцирующий в результате активации промотора гена alkA в ответ на алкилирование ДНК [12]. Дейтерирование бактериальной культуры проводили в среде с D₂O (концентрация 7.5%) в течение 90 мин. Затем в контрольную и дейтерированную культуры добавляли ММС в концентрации 0.5 ммоль/л и инкубировали в течение 20 мин. Далее образцы центрифугировали, отбирали супернатант и осадок растворяли в 1 мл реагента для выделения РНК (ExtractRNA, Евроген). После ряда процедур, проведенных в соответствии с рекомендациями производителя реагента ExtractRNA, полученную РНК обрабатывали ДНКазой (Thermo Fisher Sci., США). Очищенные образцы РНК далее использовали для синтеза кДНК с помощью набора QuantiTect Rev. Transcription Kit (Qiagen, США). Брали до 100 нг очищенной от ДНК РНК, добавляли 1 мкл RT-Transferase, 1 мкл Primermix, 4 мкл буфера и доводили до 20 мкл RNA free водой. Смеси образцов инкубировали 17 мин при 42°С, далее – 3 мин при 95°С в амплификаторе QuantStudio 5 Real-Time PCR (Thermo Fisher Sci., США). Полученную кДНК использовали для ОТ-ПЦР с помощью набора SYBR Green PCR mix (Евроген, РФ) и праймеров:

Forward rrsA CAACGAGCGCAACCCTTATC

Revers rrsA AGGGCCATGATGACTTGACG

Forward luxA TGTTCTTCCCACCGCTCATC

Revers luxA CCGTACCAGCACTCCGTTAA

Forward alkA GCACAGCTTTATGGCGAACG

Revers alkA TTTCATCGCCTGCTCCACAT

Forward ada GACGATCAACGCTGGCAATC

Revers ada CGCTGGCATTTGCGTAGAAG

Результаты изучения экспрессии генов ada и alkA E. coli, и гена luxA lux-оперона в составе плазмиды биосенсора и находящегося под контролем промотора гена alkA, индуцированных ММС в клетках дейтерированных и недейтерированных бактерий биосенсора E. coli K12 MG1655 (pAlkA–lux) представлены в табл. 1. В качестве референсного был использован ген rrsA 16S РНК рибосомы, зкспрессирующийся конститутивно. Показатели числа циклов ПЦР в клетках дейтерированных и недейтерированных бактерий отличались – при дейтерировании выход кривой зависимости уровня экспрессии исследуемых генов от числа циклов ПЦР на экспоненту происходил раньше, чем у недейтерированных бактерий. Эта разница в числе циклов (Сt) составила 4, 6 и 9, для генов luxA, alkA и ada соответственно (табл. 1).

Для наглядности первичные данные по всем вариантам экспериментов были подвергнуты анализу с помощью диаграмм “ящик с усами” (BoxPlot). Данный подход анализа данных экспрессии генов был использован в работах [13, 14]. На рис. 1 представлены распределения числовых значений показателя “циклы ПЦР, Сt” для трех исследуемых генов luxA, alkA и ada и одного референсного гена rss в дейтерированных и недейтерированных клетках бактерий E. coli.

Рис. 1.

Распределение показателей эспрессии генов luxA, alkA и ada в клетках дейтерированных и недейтерированных бактерий E. coli, индуцированных ММС.

Диаграмма отображает диапазон данных, находящийся между первым и третьим квартилем, а медиана делит эту коробку на две части (межквартильный диапазон). Усы отображают данные первого квартиля – от второго квартиля до минимального значения, и четвертого квартиля – от третьего до максимального значения. Из рис. 1 видно, что референсный ген rss начинает экспрессироваться на 22–25 циклах, тогда как исследуемые гены – на 30–35 циклах, в случае дейтерированных, и на 35–39 циклах в случае недейтерированных бактерий. Все эти данные указывают на усиливающее действие дейтерия (7.5% D₂O) на экспрессию генов ada-регулона E. coli, индуцированную алкилирующим агентом ММС.

Вопрос изучения молекулярного механизма влияния дейтерия на экспрессию генов является актуальной задачей. В нашем случае в качестве модели изначально были выбраны бактериальные биосенсоры, позволяющие по интенсивности их люминесценции регистрировать экспрессию индуцибельных генов E. сoli.

Ранее усиливающее действие дейтерия на SOS-ответ бактерий E. сoli на ДНК-повреждающее действие химических генотоксикантов (таких как: 4-нитрохинолин-1-оксид, N-нитрозо-N-метилмочевина и митомицин С) мы объясняли возможной повышенной прочностью связи генотоксикант–ДНК в дейтерированных участках взаимодействующих молекул и, соответственно, сдвигом баланса между скоростью накопления повреждений и скоростью восстановления исходной структуры ДНК ферментами репарационной системы [7, 9 ]. Для объяснения влияния дейтерия на активность алкилирующих агентов нитрозометил мочевины и ММС мы опирались на данные о вероятном механизме транскрипции генов ada-регулона E. сoli и роли в этом алкилированного белка Ada в качестве транскрипционного фактора [9–11]. Метилирование алкилирующим агентом N-домена белка Ada приводит к повышению аффинности к промоторным участкам ada-регулона. Следовательно, наличие дейтерированных оснований на промоторных последовательностях ДНК или в самом белке может быть одной из главных причин стабилизации связи между промоторами и алкилированным белком Ada, что может быть существенным фактором, при наблюдаемом нами эффекте дейтерия.

В изотопном эффекте дейтерия при изучении ДНК-повреждающего действия генотоксикантов, по-видимому, немаловажную роль играет не только усиление репарационных процессов, но ингибирование ряда ферментных систем, участвующих в биотрансформации генотоксикантов в клетке. Например было показано, что предварительное дейтерирование бактерий биосенсора E. coli (pRecA–lux) приводит к усилению экспрессии гена recA, индуцированной H₂O₂. Для объяснения выявленного феномена была изучена экспрессия гена каталазы в дейтерированных и недейтерированных культурах биосенсора E. сoli (pKatA–lux). Люминесценция этого биосенсора происходит в результате активации промотора гена katA в ответ на увеличение концентрации Н₂О₂ в клетке. Выявлено, что D₂O снижает уровень экспрессии гена katA, что может привести к накоплению Н₂О₂, и, соответственно, увеличению уровня повреждений ДНК, регистрируемых по увеличению экспрессии гена recA [15].

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№ 19-04-00200/21).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.