Генетика, 2022, T. 58, № 5, стр. 600-610

Полиморфные варианты гена нейтрофильного цитозольного фактора 2: ассоциации с предрасположенностью к сахарному диабету 2-го типа и кардиоваскулярной автономной нейропатии

Ю. Э. Азарова^1, *, Е. Ю. Клёсова¹, И. И. Коломоец¹, А. В. Полоников¹

¹ Курский государственный медицинский университет
305041 Курск, Россия

Поступила в редакцию 24.11.2021
После доработки 08.12.2021
Принята к публикации 14.12.2021

EDN: DDFHRM
DOI: 10.31857/S0016675822050034

Аннотация

В исследование было включено 3206 неродственных индивидов славянского происхождения (1579 пациентов с СД2, в том числе 535 человек с кардиоваскулярной автономной нейропатией, и 1627 здоровых добровольцев). Генотипирование SNPs выполнено на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassARRAY Analyzer 4. Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью программы SNPStats. Установлена ассоциация генотипа rs17849502-G/TNCF2 с повышенным риском развития СД2 (OR = 1.42, 95% CI = 1.08–1.87, P = 0.043). При стратифицированном по индексу массы тела (ИМТ) анализе частот генотипов NCF2 обнаружено, что генотип rs17849502-G/T значимо чаще встречался только у пациентов с избыточной массой тела и ожирением (OR = 1.34, 95% CI = 1.01–1.77, P = 0.012). Кроме того, выявлены ассоциации генотипов rs789180-А/Т (OR = 1.46, 95% CI = 1.11–1.92, P = 0.015) и rs10911363-G/T (OR = 0.77, 95% CI = 0.61–0.97, P = 0.046) с кардиоваскулярной автономной нейропатией при СД2, не зависящие от пола, возраста и ИМТ пациентов. Анализ влияния полиморфизма NCF2 на биохимические показатели плазмы крови показал, что носители гаплотипа H5 rs796860A-rs789180T-rs17849502G-rs2274064C-rs10911363G-rs147415774C-rs2274065A-rs3754515C имели на 4.81% более высокое содержание гликированного гемоглобина (95% CI = 2.63–6.98, P < 0.0001) по сравнению с носителями референсного гаплотипа H1 rs796860A-rs789180А-rs17849502G-rs2274064Т-rs10911363G-rs147415774C-rs2274065A-rs3754515C. Таким образом, нами впервые выявлены ассоциации rs17849502 гена NCF2 c развитием СД2, а также ассоциации rs789180 и rs10911363 с кардиоваскулярной автономной нейропатией. Полученные данные свидетельствуют о значимом вкладе полиморфизма гена NCF2 в патогенез СД2 и создают научный задел для дальнейших исследований по изучению генетико-биохимических нарушений системы редокс-гомеостаза при сахарном диабете 2-го типа.

Ключевые слова: сахарный диабет 2-го типа, диабетическая дистальная нейропатия, кардиоваскулярная автономная нейропатия, нейтрофильный цитозольный фактор 2, НАДФН-оксидаза, однонуклеотидный полиморфизм.

По данным Международной федерации диабета за 2019 г. один из 11 взрослых в возрасте от 20 до 79 лет страдает сахарным диабетом, что в планетарном масштабе составляет 463 млн человек. В Российской Федерации 8.2 млн больных, причем более 90% из них страдают сахарным диабетом 2-го типа (СД2) [1].

В ряде отечественных и зарубежных исследований показано, что окислительный стресс служит движущей силой развития как самого СД2, так и его микрососудистых и макрососудистых осложнений, включая диабетическую нейропатию, одна из форм которой – кардиоваскулярная автономная нейропатия (КАН). Последняя является одним из прямых осложнений СД2 и обнаруживается у 11.7% пациентов с впервые выявленным диабетом [2]. Поражение сердечно-сосудистой системы при КАН связано с ухудшением качества жизни, ранней инвалидизацией и пятикратным увеличением смертности в этой категории больных [3].

Последние исследования в области редокс-биологии доказали существование так называемого порочного круга генерации активных форм кислорода (АФК), в котором избыточное образование супероксид-аниона ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ и перекиси водорода Н₂О₂ НАДФН-оксидазой (NOX) приводит к нарушению функционирования митохондрий и увеличению продукции ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ в цепи переноса электронов [4]. Следует отметить, что целый ряд белков-мишеней инсулинового сигналинга и его регуляторов (AKT, FOXO, PTEN, PT1B, JNK, GAB1) являются редокс-чувствительными. Увеличение продукции АФК в условиях дефицита антиоксидантов приводит к изменению редокс-статуса упомянутых белков и инсулинорезистентности периферических тканей [5], а также к торможению пролиферации бета-клеток поджелудочной железы с последующим запуском их апоптоза и дедифференцировки, что лежит в основе прогрессирующей потери функционирующей массы бета-клеток и снижения секреции инсулина [6].

Нейтрофильный цитозольный фактор 2 является связанной с мембраной субъединицей НАДФН-оксидазы, необходимой для активации фермента, и кодируется геном NCF2 [7]. В литературе описано участие цитохрома CYBA, белка-компонента мультиферментного комплекса НАДФН-оксидазы и ее изоформ NOX2 и NOX4 в патогенезе СД2 [8–11], тогда как данные о роли NCF2 в развитии СД2 и его осложнений отсутствуют. В этой связи целью настоящего исследования стало изучение ассоциаций восьми однонуклеотидных полиморфных вариантов гена NCF2 rs796860 (A>C), rs789180 (A>T), rs17849502 (G>T), rs2274064 (T>C), rs10911363 (G>T), rs147415774 (C>T), rs2274065 (A>C) и rs3754515 (C>A) с предрасположенностью к СД2, а также с риском развития кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с СД2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Протокол исследования одобрен Региональным этическим комитетом при Курском государственном медицинском университете (выписка из протокола № 10 от 12.12.2016 г.). В исследование было включено 1579 пациентов с СД2 (591 мужчина и 988 женщин, средний возраст 61.3 ± 10.4 года), получавших стационарное лечение на базе эндокринологического отделения Курской городской клинической больницы скорой медицинской помощи в период с декабря 2016 по октябрь 2019 г. У 535 больных СД2 по результатам прикроватных тестов (оценка частоты сердечных сокращений (ЧСС) в покое, вариации ЧСС, реакции ЧСС и артериального давления в ответ на ортостатическую пробу, реакции диастолического АД в ответ на изометрическую нагрузку и пробы Вальсальвы [12]) была диагностирована кардиоваскулярная автономная нейропатия. 1627 условно здоровых добровольцев (601 мужчина и 1026 женщин, средний возраст 60.8 ± 6.4 года) составили группу контроля. Исследуемые группы были сопоставимы как по полу, так и по возрасту. Клинико-лабораторные показатели участников исследования представлены в табл. 1. Критерии включения в группу больных: наличие верифицированного врачом диагноза болезни, подтвержденного клинически и лабораторно-инструментально, возраст старше 35 лет, наличие письменного информированного согласия на участие в исследовании. Критерии исключения больных из основной выборки: выраженная степень декомпенсации СД2 или кома, заболевания экзокринной части поджелудочной железы, опухоли поджелудочной железы, муковисцидоз, гемохроматоз, фиброкалькулезная панкреатопатия, эндокринопатии, генетические синдромы, сочетающиеся с СД (полный перечень приведен ранее [13, 14]), а также возраст младше 35 лет и отсутствие письменного информированного согласия на участие в проекте. Критерии включения лиц в группу контроля: возраст старше 35 лет, нормальные значения гликемии согласно ВОЗ, 1999–2013, отсутствие тяжелых хронических заболеваний, наличие письменного информированного согласия. Критерии исключения из группы контроля: возраст младше 35 лет, гипергликемии в анамнезе, наличие тяжелых хронических заболеваний, отсутствие письменного информированного согласия.

Таблица 1.

Клинико-лабораторные показатели участников исследования

Параметры сравнения	Контроль, n = 1627	Больные СД2, n = 1579	Р*
Возраст, ср, ± ст. от.	60.8 ± 6.4	61.3 ± 10.4	0.34
Мужчины, n (%)	601 (36.9)	591 (37.4)	0.77
Женщины, n (%)	1026 (63.1)	988 (62.6)	0.77
Индекс массы тела (кг/м²), ср. ± ст. от.	27.22 ± 3.55	31.94 ± 6.65	0.001
Курящие, n (%)	504 (31.0)	411 (26.0)	0.004
Стаж диабета, Me [Q1; Q3]	–	9.0 [3.0; 15.0]	–
Кардиоваскулярная автономная нейропатия	535	–	–
Наследственная отягощенность, n (%)	33 (2.0)	611 (38.7)	<0.0001
HbA1C (%), Me [Q1; Q3]	4.58 [4.11; 4.87]	9.02 [7.70; 10.80]	<0.0001
Глюкоза крови натощак, Me [Q1; Q3]	4.71 [4.39; 4.84]	12.20 [9.70; 15.20 ]	<0.0001
Общий холестерин (ммоль/л), Me [Q1; Q3]	3.06 [2.86; 3.12]	5.10 [4.27; 6.09]	<0.0001
ЛПН (ммоль/л), Me [Q1; Q3]	1.74 [1.60; 1.79]	3.03 [2.40; 4.05]	<0.0001
ЛВП (ммоль/л), Me [Q1; Q3]	1.47 [1.36. 1.62 ]	0.85 [0.74; 1.07]	<0.0001
ТАГ (ммоль/л), Me [Q1; Q3]	1.15 [0.98; 1.23]	2.20 [1.55; 3.00]	<0.0001

Примечание. HbA1C – гликированный гемоглобин; ЛНП – липопротеины низкой плотности; ЛВП – липопротеины высокой плотности; ТАГ – триацилглицеролы; * полужирным шрифтом выделены статистически значимые Р.

Для проведения генетических исследований у всех пациентов с СД2 и здоровых лиц на основе письменного информированного согласия проводили забор 5 мл венозной крови натощак в вакуумные пробирки Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта. Геномную ДНК выделяли колоночным методом с помощью набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) на автоматической станции для экстракции белков и нуклеиновых кислот QiaCube (Qiagen), а также методом фенольно-хлороформной экстракции. Для молекулярно-генетического анализа было отобрано восемь однонуклеотидных вариантов гена NCF2 с выраженным регуляторным потенциалом, а именно rs796860 (A>C), rs789180 (A>T), rs17849502 (G>T), rs2274064 (T>C), rs10911363 (G>T), rs147415774 (C>T), rs2274065 (A>C) и rs3754515 (C>A). Генотипирование SNPs гена NCF2 проводили с использованием технологии iPLEX на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassARRAY Analyzer 4 (Agena Bioscience). Дизайн мультиплекса SNPs и подбор праймеров для ПЦР и iPLEX реакций осуществляли с помощью онлайн программы MassARRAY Assay Design Suite (https://agenacx.com). Праймеры были синтезированы компанией Evrogen (Москва). Содержание перекиси водорода Н₂О₂ и окисленного глутатиона GSSG в плазме крови участников исследования определяли флуориметрическим и колориметрическим методом с помощью наборов OxiSelect ROS/RNS Assay kit (Cell Biolabs) и OxiSelect GSH/GSSG Assay kit (Cell Biolabs) соответственно, на микропланшетном ридере Varioscan Flash (Thermo Fisher Scientific). Концентрации глюкозы, гликированного гемоглобина, триглицеридов, общего холестерина и его подфракций (липопротеинов низкой и высокой плотности) оценивали с помощью биохимических наборов фирмы Диакон-ДС на полуавтоматическом биохимическом анализаторе Ral-15.

Влияние полиморфных вариантов генов на биохимические показатели анализировалось методом линейного регрессионного анализа с поправкой на пол, возраст и индекс массы тела. Статистическую обработку полученных данных проводили методом логистической регрессии с поправками на возраст и индекс массы тела, с помощью онлайн программы SNPStats (https://www.snpstats.net/). Ассоциация считалась значимой при Р < 0.05. Для анализа соответствия распределения частот генотипов равновесию Харди–Вайнберга и сравнения частот аллелей и генотипов между группами применяли точный тест Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Распределение частот генотипов в исследуемой популяции соответствовало равновесию Харди–Вайнберга (P > 0.05). Согласно данным проекта “1000 Genomes”, депонированным в Ensembl (https://www.ensembl.org/), частоты минорных аллелей пяти вариантов – rs796860-C, rs789180-T, rs17849502-T, rs2274064-C и rs10911363-T были сопоставимы с таковыми в европейской популяции. Минорный аллель rs147415774-Т NCF2 характеризовался крайне низкой частотой у жителей Центральной России (0.0016) и не встречался у представителей других популяций. Достаточно выраженные межпопуляционные различия (P < 0.0001) в частоте альтернативного аллеля установлены и в отношении полиморфного варианта rs2274065 NCF2: частота аллеля С у жителей Центральной России была ниже, чем у представителей европейской, американской, африканской и восточно-азиатской популяций, однако была сопоставима с частотой аллеля rs2274065-С в южно-азиатской популяции. Частота аллеля rs3754515-A NCF2 значимо отличалась от всех исследованных в проекте “1000 Genomes” популяций.

В табл. 2 представлены результаты анализа гаметического неравновесия по сцеплению SNPs гена NCF2. Локус rs796860 находился в отрицательном LD с rs789180 (D' = 0.9949, D = –0.0133, P < 2 × 10^–16), rs17849502 (D' = 0.8445, D = –0.0044, P < 1.58 × 10^–7), rs2274064 (D' = 0.9787, D = –0.0531, P < 2 × 10^–16) и с rs10911363 (D' = 0.9759, D = –0.0336, P < 2 × 10^–16). Кроме того, SNPs rs17849502 (D' = = 0.9912, D = –0.0052, P = 8.52 × 10^–10) и rs10911363 (D' = 0.8191, D = –0.0283, P < 2 × 10^–16) находились в отрицательном неравновесии по сцеплению с rs789180. Также rs147415774 был в отрицательном LD с rs3754515 (D' = 0.9210, D = –0.0005, P = 0.02). SNP rs2274064 был сцеплен с rs789180 (D' = 0.9878, D = 0.0606, P < 2 × 10^–16), rs17849502 (D' = 0.9888, D = 0.0238, P < 2 × 10^–16) и rs10911363 (D' = 0.9500, D = 0.1501, P < 2 × 10^–16). Последние два SNPs были также сцеплены между собой (D' = 0.9664, D = = 0.0308, P < 2 × 10^–16).

Таблица 2.

Неравновесие по сцеплению между полиморфными вариантами гена NCF2

SNPID	rs789180	rs17849502	rs2274064	rs10911363	rs147415774	rs2274065	rs3754515
rs796860	–0.0133	–0.0044	–0.0531	–0.0336	0.0001	–0.0029	–0.0263
rs796860	0.9949	0.8445	0.9787	0.9759	0.048	0.5478	0.6065
rs789180		–0.0052	0.0606	–0.0283	0.0001	0.0197	–0.0051
rs789180		0.9912	0.9878	0.8191	0.7432	0.4924	0.1165
rs17849502			0.0238	0.0308	0	–0.0009	–0.0034
rs17849502			0.9888	0.9664	0.0108	0.4165	0.198
rs2274064				0.1501	0.0006	0.0105	–0.0618
rs2274064				0.95	0.7008	0.4383	0.3481
rs10911363					0.0009	–0.0075	–0.0743
rs10911363					0.792	0.5556	0.6601
rs147415774						0	–0.0005
rs147415774						0.343	0.921
rs2274065							0.027
rs2274065							0.957

Примечание. Показатели неравновесия по сцеплению между SNPs: верхние ячейки – D (заливка серым), нижние – D'. Представлены только статистически значимые показатели неравновесия по сцеплению (P < 6.7 × 10^–6).

В табл. 3 представлены результаты анализа ассоциаций изучаемых SNPs гена NCF2 с предрасположенностью к СД2. Как видно из табл. 3, генотип rs17849502-T/T NCF2 (OR = 1.42, 95% CI = 1.08–1.87, P = 0.043) ассоциировался с повышенным риском развития СД2. При анализе частот гаплотипов NCF2 (табл. 4) у больных и здоровых участников исследования, статистически значимых ассоциаций какого-либо из 13 гаплотипов NCF2 с предрасположенностью к СД2 выявлено не было (Р > 0.05). Тем не менее анализ эффектов изучаемых SNPs на биохимические показатели плазмы крови пациентов с СД2 установил, что носители гаплотипа H5 rs796860A-rs789180T-rs17849502G-rs2274064C-rs10911363G-rs147415774C-rs2274065A- rs3754515C имели на 4.81% более высокое содержание гликированного гемоглобина (95% CI = 2.63–6.98, P < < 0.0001) по сравнению с носителями референсного гаплотипа H1 rs796860A-rs789180А-rs17849502G-rs2274064Т-rs10911363G-rs147415774C-rs2274065A-rs3754515C (табл. 5).

Таблица 3.

Анализ ассоциации аллелей и генотипов полиморфных вариантов гена NCF2 с риском развития СД2

SNP гена NCF2	Генотип, аллель	n (%)		_adjР¹	_adjOR (95% CI)²
SNP гена NCF2	Генотип, аллель	здоровые (n=1627)	больные (n=1579)	_adjР¹	_adjOR (95% CI)²
rs796860 A>C	A/A	1266 (77.8)	1245 (78.8)	0.42	1.00
	C/A	340 (20.9)	310 (19.6)		0.90 (0.76–1.08)
	C/C	21 (1.3)	24 (1.5)		1.21 (0.66–2.22)
	C	0.117	0.113	0.61	0.46 (0.82–1.12)
rs789180 A>T	A/A	1256 (77.2)	1251 (79.2)	0.42	1.00
	A/T	347 (21.3)	308 (19.5)		0.89 (0.74–1.06)
	T/T	24 (1.5)	20 (1.3)		0.99 (0.53–1.87)
	T	0.121	0.110	0.16	0.90 (0.77–1.04)
rs17849502 G>T	G/G	1500 (92.2)	1424 (90.2)	0.043	1.00
	G/T	121 (7.4)	152 (9.6)		1.42 (1.08–1.87)
	T/T	6 (0.4)	3 (0.2)		0.72 (0.17–2.95)
	T	0.041	0.050	0.078	1.24 (0.98–1.56)
rs2274064 T>C	T/T	449 (27.6)	451 (28.6)	0.23	1.00
	C/T	798 (49)	794 (50.3)		1.01 (0.85–1.19)
	C/C	380 (23.4)	334 (21.1)		0.86 (0.71–1.06)
	C	0.479	0.463	0.20	0.94 (0.85–1.04)
rs10911363 G>T	G/G	810 (49.8)	781 (49.5)	0.32	1.00
	G/T	654 (40.2)	661 (41.9)		1.03 (0.88–1.19)
	T/T	163 (10)	137 (8.7)		0.84 (0.65–1.09)
	T	0.301	0.296	0.66	0.98 (0.88–1.09)
rs147415774 С>T	C/C	1621 (99.6)	1575 (99.8)	0.57	1.00
	C/T	6 (0.4)	4 (0.2)		0.69 (0.19–2.50)
	T/T	0.0	0.0		–
	T	0.002	0.001	0.56	0.69 (0.19–2.44)
rs2274065 A>С	A/A	1483 (91.2)	1440 (91.2)	0.64	1.00
	C/A	142 (8.7)	135 (8.6)		1.01 (0.78–1.30)
	C/C	2 (0.1)	4 (0.2)		2.25 (0.40–12.56)
	С	0.045	0.045	0.94	1.01 (0.80–1.28)
rs3754515 С>A	C/C	652 (40.1)	597 (37.8)	0.44	1.00
	C/A	741 (45.5)	759 (48.1)		1.11 (0.95–1.29)
	A/A	234 (14.4)	223 (14.1)		1.04 (0.84–1.30)
	A	0.372	0.382	0.41	1.04 (0.94–1.15)

¹ Уровень значимости ассоциации с риском развития СД2 с коррекцией по полу, возрасту и ИМТ. ² Отношения шансов и 95%-ные доверительные интервалы ассоциаций SNPs с риском развития СД2 с коррекцией по полу, возрасту и ИМТ.

Таблица 4.

Распределение и анализ ассоциаций гаплотипов NCF2 c риском развития СД2

H	rs796860	rs789180	rs17849502	rs2274064	rs10911363	rs147415774	rs2274065	rs3754515	Контроль	Больные СД2	OR (95% CI)¹	P	OR (95% CI)²	P
H1	A	A	G	T	G	C	A	A	0.2253	0.2377	1.00	—	1.00	—
H2	A	A	G	C	T	C	A	C	0.2209	0.212	0.91 (0.79–1.06)	0.23	0.90 (0.77–1.04)	0.16
H3	A	A	G	T	G	C	A	C	0.1613	0.1691	0.99 (0.83–1.18)	0.91	1.02 (0.85–1.21)	0.86
H4	C	A	G	T	G	C	A	C	0.0985	0.0942	0.92 (0.75–1.11)	0.37	0.92 (0.75–1.12)	0.42
H5	A	T	G	C	G	C	A	C	0.078	0.0695	0.85 (0.68–1.05)	0.14	0.86 (0.69–1.08)	0.19
H6	A	A	G	C	G	C	A	A	0.0404	0.0411	0.97 (0.72–1.30)	0.84	0.99 (0.73–1.34)	0.94
H7	A	A	T	C	T	C	A	C	0.0285	0.0352	1.20 (0.87–1.66)	0.27	1.28 (0.92–1.78)	0.14
H8	A	T	G	C	G	C	C	A	0.0263	0.0242	0.87 (0.62–1.22)	0.43	0.88 (0.63–1.25)	0.48
H9	A	A	G	C	G	C	A	C	0.0265	0.0228	0.83 (0.57–1.21)	0.33	0.88 (0.60–1.28)	0.50
H10	A	A	G	C	T	C	A	A	0.0187	0.0174	0.88 (0.54–1.43)	0.60	0.96 (0.58–1.57)	0.86
H11	C	A	G	T	G	C	A	A	0.0177	0.013	0.77 (0.46–1.30)	0.34	0.73 (0.43–1.25)	0.25
H12	A	T	G	C	G	C	A	A	0.0098	0.0137	1.29 (0.69–2.43)	0.43	1.37 (0.72–2.61)	0.34
H13	A	A	T	C	T	C	A	A	0.0119	0.0114	0.91 (0.51–1.60)	0.73	0.82 (0.46–1.46)	0.49
Редкие	*	*	*	*	*	*	*	*	0.0091	0.0101	0.98 (0.72–1.34)	0.92	1.03 (0.75–1.42)	0.84
Общий P												0.83	0.67

Примечание. Отношения шансов и 95%-ные доверительные интервалы: ¹ без поправок на ковариаты, ² с поправкой на пол, возраст и ИМТ; H – гаплотип. Подчеркиванием обозначены минорные аллели.

Таблица 5.

Ассоциации гаплотипов гена NCF2 с уровнем гликированного гемоглобина у больных СД2

H	rs796860	rs789180	rs17849502	rs2274064	rs10911363	rs147415774	rs2274065	rs3754515	Частота гаплотипа	Diff (95% CI)¹	P
H1	A	A	G	T	G	C	A	A	0.2366	0.00	—
H2	A	A	G	C	T	C	A	C	0.2145	0.1 (–1.35–1.56)	0.89
H3	A	A	G	T	G	C	A	C	0.1699	0.22 (–1.37–1.8)	0.79
H4	C	A	G	T	G	C	A	C	0.0936	–0.04 (–1.91–1.82)	0.96
H5	A	T	G	C	G	C	A	C	0.0704	4.81 (2.63–6.98)	<0.0001
H6	A	A	G	C	G	C	A	A	0.0383	0.03 (–2.73–2.79)	0.99
H7	A	A	T	C	T	C	A	C	0.0345	–0.41 (–3.29–2.46)	0.78
Н8	A	A	G	C	G	C	A	C	0.0249	–0.17 (–3.45–3.1)	0.92
Н9	A	T	G	C	G	C	C	A	0.024	0.14 (–3.1–3.38)	0.93
H10	A	A	G	C	T	C	A	A	0.0173	0.11 (–3.82–4.05)	0.96
H11	A	T	G	C	G	C	A	A	0.0124	–0.55 (–5.12–4.02)	0.81
H12	C	A	G	T	G	C	A	A	0.0122	0.1 (–4.38–4.58)	0.97
H13	A	A	T	C	T	C	A	A	0.0109	0.35 (–4.51–5.21)	0.89
Редкие	*	*	*	*	*	*	*	*	0.0406	–0.19 (–3.08–2.71)	0.90

¹ Значение разности уровня HbA1с (%) при данном гаплотипе по сравнению с референсным гаплотипом Н1; Н – гаплотип. Подчеркиванием обозначены минорные аллели.

Принимая во внимание, что ожирение является ведущим фактором риска СД2, нами далее был проведен стратифицированный по индексу массы тела (ИМТ) анализ частот генотипов NCF2, результаты которого приведены в табл. 6. Обнаружено, что генотип rs17849502-G/T значимо чаще встречался только у пациентов с избыточной массой тела и ожирением (OR = 1.34, 95% CI = 1.01–1.77, P = = 0.012), тогда как у лиц с нормальной массой тела рисковый эффект носительства rs17849502-G/T не наблюдался (P > 0.05).

Таблица 6.

Стратифицированный по ИМТ анализ ассоциаций генотипов полиморфных вариантов гена NCF2 с риском развития СД2

SNP гена NCF2	Генотип	Контроль, n (%)	СД2, n (%)	OR (95% CI)	P	Контроль, n (%)	СД2, n (%)	OR (95% CI)	P
ИМТ < 25 кг/м²						ИМТ ≥ 25 кг/м²
rs796860 A>C	A/A	244 (79.2)	153 (75.7)	1.00	0.14	999 (77.4)	1087 (79.3)	1.00	0.24
	C/A	60 (19.5)	49 (24.3)	1.21 (0.78–1.88)		274 (21.2)	259 (18.9)	0.87 (0.71–1.05)
	C/C	4 (1.3)	0 (0)	0.00 (0.00–NA)		17 (1.3)	24 (1.8)	1.27 (0.67–2.40)
rs789180 A>T	A/A	220 (76.7)	163 (80.3)	1.00	0.56	995 (77.3)	1071 (79)	1.00	0.45
	A/T	61 (21.2)	37 (18.2)	0.81 (0.51–1.29)		275 (21.4)	267 (19.7)	0.88 (0.73–1.07)
	T/T	6 (2.1)	3 (1.5)	0.63 (0.15–2.64)		17 (1.3)	17 (1.2)	1.00 (0.51–1.99)
rs17849502 G>T	G/G	286 (92.9)	179 (90.9)	1.00	0.20	1192 (92)	1186 (90.1)	1.00	0.012
	G/T	22 (7.1)	16 (8.1)	1.14 (0.57–2.29)		97 (7.5)	129 (9.8)	1.34 (1.01–1.77)
	T/T	0 (0)	2 (1)	NA (0.00–NA)		6 (0.5)	1 (0.1)	0.15 (0.02–1.26)
rs2274064 T>C	T/T	75 (25.1)	60 (30)	1.00	0.18	364 (28.1)	385 (28.3)	1.00	0.46
	C/T	154 (51.5)	105 (52.5)	0.89 (0.57–1.37)		627 (48.5)	679 (50)	1.03 (0.86–1.23)
	C/C	70 (23.4)	35 (17.5)	0.61 (0.35–1.05)		302 (23.4)	295 (21.7)	0.91 (0.73–1.13)
rs10911363 G>T	G/G	148 (48.4)	106 (52.5)	1.00	0.53	647 (50.1)	671 (49)	1.00	0.19
	G/T	134 (43.8)	77 (38.1)	0.81 (0.55–1.20)		508 (39.4)	579 (42.3)	1.08 (0.92–1.27)
	T/T	24 (7.8)	19 (9.4)	1.04 (0.53–2.03)		136 (10.5)	118 (8.6)	0.84 (0.64–1.10)
rs147415774 C>T	C/C	309 (100)	202 (99.5)	1.00	0.18	1290 (99.5)	1370 (99.8)	1.00	0.27
	C/T	0 (0)	1 (0.5)	NA (0.00–NA)		6 (0.5)	3 (0.2)	0.46 (0.11–1.88)
	T/T	0	0	–		0	0	–
rs2274065 A>C	A/A	264 (89.2)	185 (92)	1.00	0.35	1186 (91.6)	1235 (91.1)	1.00	0.61
	C/A	32 (10.8)	16 (8)	0.74 (0.39–1.40)		107 (8.3)	117 (8.6)	1.06 (0.81–1.40)
	C/C	0	0	–		2 (0.2)	4 (0.3)	2.15 (0.39–11.82)
rs3754515 C>A	C/C	121 (39.9)	80 (39.4)	1.00	0.93	521 (40.1)	514 (37.5)	1.00	0.29
	C/A	145 (47.9)	96 (47.3)	1.07 (0.72–1.59)		584 (45)	660 (48.2)	1.14 (0.97–1.35)
	A/A	37 (12.2)	27 (13.3)	1.10 (0.61–1.98)		194 (14.9)	195 (14.2)	1.05 (0.83–1.32)

Примечание. p – уровень значимости ассоциации с риском развития СД2 с коррекцией по полу, возрасту и ИМТ. OR (95% CI) – отношения шансов и 95%-ные доверительные интервалы ассоциаций SNPs с риском развития СД2 с коррекцией по полу, возрасту и ИМТ.

Нами были выявлены ассоциации генотипов rs789180-А/Т (OR = 1.46, 95% CI = 1.11–1.92, P = = 0.015) и rs10911363-G/T (OR = 0.77; 95% CI = = 0.61–0.97, P = 0.046) с кардиоваскулярной автономной нейропатией при СД2, не зависящие от пола, возраста и ИМТ пациентов (табл. 7).

Таблица 7.

Ассоциации полиморфных вариантов изучаемых гена NCF2 с кардиоваскулярной автономной нейропатией (КАН) у больных СД2

SNP гена NCF2	Генотип	Больные СД2 без КАН, n (%)	Больные СД2 с КАН, n (%)	OR (95% CI)	Р
rs796860 A>C	A/A	708 (80.7)	412 (77)	1.00	0.33
	A/C	158 (18)	110 (20.6)	1.14 (0.86–1.52)
	C/C	11 (1.2)	13 (2.4)	1.68 (0.73–3.88)
rs789180 A>T	A/A	704 (81.2)	402 (75.7)	1.00	0.015
	A/T	149 (17.2)	125 (23.5)	1.46 (1.11–1.92)
	T/T	14 (1.6)	4 (0.8)	0.57 (0.18–1.80)
rs17849502 G>T	G/G	763 (90)	461 (90.8)	1.00	0.86
	G/T	84 (9.9)	46 (9.1)	0.94 (0.64–1.39)
	T/T	1 (0.1)	1 (0.2)	1.93 (0.12–31.72)
rs2274064 T>C	T/T	239 (27.5)	161 (30.3)	1.00	0.46
	T/C	445 (51.2)	251 (47.3)	0.85 (0.66–1.11)
	C/C	185 (21.3)	119 (22.4)	0.96 (0.70–1.31)
rs10911363 G>T	G/G	407 (46.6)	285 (53.3)	1.00	0.046
	G/T	379 (43.4)	208 (38.9)	0.77 (0.61–0.97)
	T/T	88 (10.1)	42 (7.8)	0.71 (0.47–1.07)
rs147415774 C>T	C/C	877 (99.8)	534 (99.6)	1.00	0.92
	C/T	2 (0.2)	2 (0.4)	1.11 (0.15–8.22)
	T/T	0	0	–
rs2274065 A>C	A/A	802 (92.1)	470 (89.5)	1.00	0.27
	A/C	67 (7.7)	53 (10.1)	1.36 (0.92–2.01)
	C/C	2 (0.2)	2 (0.4)	1.73 (0.24–12.53)
rs3754515 C>A	C/C	343 (39.1)	197 (36.9)	1.00	0.40
	C/A	419 (47.8)	255 (47.8)	1.05 (0.83–1.34)
	A/A	115 (13.1)	82 (15.4)	1.27 (0.90–1.78)

Примечание. OR (95% CI) – отношения шансов и 95%-ные доверительные интервалы с поправкой на пол, возраст и ИМТ. P – уровень значимости ассоциации с поправками на пол, возраст и ИМТ.

ОБСУЖДЕНИЕ

Цитозольный фактор нейтрофилов 2 (NCF2, p67^phox) представляет собой регуляторный белок из 526 аминокислот с молекулярной массой 67 кДа, формирующий вместе с NCF1, NCF4 и малой ГТФ-азой RAC1/RAC2 цитозольный комплекс НАДФН-оксидазы. Именно NCF2 отвечает за трансфер электронов с НАДФН на флавиновый центр цитохрома b и необходим для запуска каталитической активности последнего [15, 16]. Результатом катализа является превращение молекулярного кислорода в супероксид-анион, который в свою очередь является родоначальником перекиси водорода, гидроксильного радикала, пероксинитрита и гипохлорит-аниона. В фагоцитах перечисленные АФК оказывают бактерицидный эффект, а в клетках нефагоцитарного ряда служат важными сигнальными молекулами, регулирующими процессы роста, деления, апоптоза [17], организации цитоскелета, внутриклеточного транспорта, в том числе гранул инсулина в бета-клетках поджелудочной железы [18–20].

Мутации в гене NCF2 связаны с развитием хронической гранулематозной болезни [21, 22] – первичного иммунодефицита, характеризующегося неспособностью фагоцитов генерировать супероксид. Полиморфный вариант rs17849502 по данным полногеномных исследований ассоциирован с развитием целиакии [23], ревматоидного артрита [24, 25], вариант rs17849501 – c развитием системной красной волчанки [26], SNP rs35012521 – с развитием эпилептической энцефалопатии [база данных Clinvar, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ RCV001258235/]. Данные о связи SNPs NCF2 с предрасположенностью к СД2 и его осложнениям в литературе отсутствуют. Выполненное нами исследование впервые выявило взаимосвязь полиморфизма rs17849502 в интроне гена NCF2 с повышенным риском развития СД2 у больных с избыточной массой тела и ожирением, тем самым демонстрируя потенциальную вовлеченность гена цитозольного фактора нейтрофилов 2 в патогенез диабета. Нам также удалось установить влияние гаплотипа rs796860A-rs789180T-rs17849502G-rs2274064C-rs10911363G-rs147415774C-rs2274065A-rs3754515C на уровень гликированного гемоглобина у больных СД2: носительство данного гаплотипа NCF2 было сопряжено со значимо более высоким содержанием HbA_1с.

Согласно экспериментальным данным GTEx портала (https://gtexportal.org/), присутствие минорных аллелей rs17849502-Т (Р = 2.1 × 10^–12) и rs789180-Т (Р = 3.2 × 10^–10) повышает аффинность факторов сплайсинга к синтезированной пре-мРНК и увеличивает число сплайсинговых изоформ NCF2 в крови. Кроме того, аллель rs789180-Т повышает экспрессию в крови гена SMG7-AS1 (Р = 2.3 × 10^–5), ассоциированного с пороком развития межпредсердной перегородки (https://malacards.org/). Более эффективный процессинг мРНК NCF2 может способствовать повышению содержания этого белка и активации НАДФН-оксидазы. Гиперактивность NCF2 и NOX имеет особое значение для островков поджелудочной железы, в которой смещение редокс-баланса в прооксидантную сторону приводит к нарушению глюкозостимулированной секреции инсулина, доказательством чего является экспериментальная работа Morgan и коллег, показавших, что применение селективного ингибитора НАДФН-оксидазы подавляет секрецию инсулина бета-клетками [27]. Регуляторное влияние NOX на индуцированную пальмитатом секрецию инсулина продемонстрировано и на островках Лангерганса крыс [20]. Увеличение активности НАДФН-оксидазы и генерации АФК также описано в исследовании на крысах с сочетанием ожирения и диабета [28]. Наконец, в недавней работе Baig и соавт. [29] отмечен рост постпрандиальной экспрессии НАДФН-оксидазы в нейтрофилах, моноцитах, миоцитах и адипоцитах здоровых индивидов, имеющих больных СД2 родственников первой степени родства по сравнению с лицами с неотягощенным семейным анамнезом. Генетические факторы, взаимодействуя со средой, детерминируют и развитие осложнений СД2, в частности КАН [30]. На сегодняшний день проведен ряд работ по транскриптомному анализу больных с диабетической нейропатией, в которых установлены группы генов, связанных с ее развитием и вовлеченных в становление окислительного стресса, воспаления и дисфункции митохондрий [31–36]. Однако участие гена NCF2 в формировании предрасположенности к КАН показано только в нашем исследовании: носительство генотипов rs789180-А/Т и rs10911363-G/T значимо ассоциировано с развитием этого осложнения СД2.

Таким образом, в проведенном исследовании впервые выявлены ассоциации rs17849502 гена NCF2 c развитием СД2, а также ассоциации rs789180 и rs10911363 с кардиоваскулярной автономной нейропатией. Полученные данные свидетельствуют о значимом вкладе полиморфизма гена NCF2 в патогенез СД2 и создают научный задел для дальнейших исследований по изучению генетико-биохимических нарушений системы редокс-гомеостаза при сахарном диабете 2-го типа.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 20-15-00227).

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

Saeedi P., Petersohn I., Salpea P. et al. Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: Results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas // Diabetes Res. and Clin. Practice. 2019. V. 157. P. 107843. https://doi.org/10.1016/j.diabres.2019.107843
Ziegler D., Voss A., Rathmann W. et al. Increased prevalence of cardiac autonomic dysfunction at different degrees of glucose intolerance in the general population: the KORA S4 // Diabetologia. 2015. V. 58. № 5. P. 1118–1128. https://doi.org/10.1007/s00125-015-3534-7
Мошхоева Л.С., Баринов А.Н. Оптимизация метода диагностики кардиальной автономной невропатии при сахарном диабете 2-го типа // Медицинский совет. 2021. № 10. С. 178–183. https://doi.org/10.21518/2079-701X-2021-10-178-183
Urner S., Ho F., Jha J.C. et al. NADPH oxidase inhibition: preclinical and clinical studies in diabetic complications // Antioxidants and Redox Signaling. 2020. V. 33. № 6. P. 415–434. https://doi.org/10.1089/ars.2020.8047
Onyango A.N. Cellular stresses and stress responses in the pathogenesis of insulin resistance // Oxid. Med. Cell Longev. 2018. P. 4321714. https://doi.org/10.1155/2018/4321714
Sies H., Jones D.P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2020. V. 21. P. 363–383. https://doi.org/10.1038/s41580-020-0230-3
Taylor J.P., Hubert M.T. The role of NADPH oxidases in infectious and inflammatory diseases // Redox Biol. 2021. P. 102159. https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.102159
Schreiber R., Ferreira-Sae M.C., Tucunduva A.C. et al. CYBA C242T polymorphism is associated with obesity and diabetes mellitus in Brazilian hypertensive patients // Diabetic Med. 2012. V. 29. № 7. P. e55–e61. https://doi.org/10.1111/j.1464-5491.2012.03594.x
Osmenda G., Matusik P.T., Sliwa T. et al. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase p22phox subunit polymorphisms, systemic oxidative stress, endothelial dysfunction, and atherosclerosis in type 2 diabetes mellitus // Polish Archiv. Intern. Med. 2021. V. 131. № 5. P. 447–454. https://doi.org/10.20452/pamw.15937
Yuan H.,Zhang X., Huang X. et al. NADPH oxidase 2-derived reactive oxygen species mediate FFAs-induced dysfunction and apoptosis of beta-cells via JNK, p38 MAPK and p53 pathways // PLoS One. 2010. V. 5. P. e15726. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015726
Ma Y., Li W., Yin Y. et al. AST IV inhibits H(2)O(2)-induced human umbilical vein endothelial cell apoptosis by suppressing Nox4 expression through the TGF-beta1/Smad2 pathway // Int. J. Mol. Med. 2015. V. 35. P. 1667–1674. https://doi.org/10.3892/ijmm.2015.2188
Дедов И.И., Шестакова М.В., Майоров А.Ю. и др. Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом. Вып. 9 / Под ред. Дедова И.И., Шестаковой М.В., Майорова А.Ю. // Сахарный диабет. Т. 22. № 1S1. С. 1–144. https://doi.org/10.14341/DM221S1
Азарова Ю.Э., Клёсова Е.Ю., Сакали С.Ю. и др. Вклад полиморфизма rs11927381 гена IGF2BP2 в патогенез сахарного диабета 2 типа // Науч. результаты биомед. исследований. 2020. Т. 6. № 1. С. 9–19. https://doi.org/10.18413/2658-6533-2020-6-1-0-2
Азарова Ю.Э., Клёсова Е.Ю., Самгина Т.А. и др. Роль полиморфных вариантов гена CYBA в патогенезе сахарного диабета 2 типа // Мед. генетика. 2019. Т. 18. № 8. С. 37–48. https://doi.org/10.25557/2073-7998.2019.08.37-48
Vignais P.V. The superoxide-generating NADPH oxidase: structural aspects and activation mechanism // CMLS. 2002. V. 59. № 9. P. 1428–1459. https://doi.org/10.1007/s00018-002-8520-9
Sahoo S., Meijles D.N., Pagano P.J. NADPH oxidases: Key modulators in aging and age-related cardiovascular diseases? // Clin. Sci. 2016. V. 130. № 5. P. 317–335. https://doi.org/10.1042/CS20150087
Manea A. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species: Involvement in vascular physiology and pathology // Cell and Tissue Res. 2010. V. 342. № 3. P. 325–339. https://doi.org/10.1007/s00441-010-1060-y
Oliveira H.R., Verlengia R., Carvalho C.R. et al. Pancreatic beta cells express phagocyte-like NADPH oxidase // Diabetes. 2003. V. 52. № 6. P. 1457–1463. https://doi.org/10.2337/diabetes.52.6.1457
Uchizono Y., Takeya R., Iwase M. et al. Expression of isoforms of NADPH oxidase components in rat pancreatic islets // Life Sci. 2006. V. 80. № 2. P. 133–139. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2006.08.031
Graciano M.F., Santos L.R., Curi R. et al. NAD(P)H oxidase participates in the palmitate-induced superoxide production and insulin secretion by rat pancreatic islets // J Cell Physiol. 2011. V. 226. № 4. P. 1110–1117. https://doi.org/10.1002/jcp.22432
de Mendez I., Garrett M.C., Adams A.G. et al. Role of p67-phox SH3 domains in assembly of the NADPH oxidase system // J. Biol. Chemistry. 1994. V. 269. № 23. P. 16326–16332. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(17)34011-5
Leusen J.H., Fluiter K., Hilarius P.M. et al. Interactions between the cytosolic components p47phox and p67phox of the human neutrophil NADPH oxidase that are not required for activation in the cell-free system // J. Biol. Chemistry. 1995. V. 270. № 19. P. 11216–11221. https://doi.org/10.1074/jbc.270.19.11216
Ricaño-Ponce I., Gutierrez-Achury J., Costa A.F. et al. Immunochip meta-analysis in European and Argentinian populations identifies two novel genetic loci associated with celiac disease // Eur. J. Human Genet. 2020. V. 28. № 3. P. 313–323. https://doi.org/10.1038/s41431-019-0520-4
Gutierrez-Achury J., Zorro M.M., Ricaño-Ponce I. et al. Functional implications of disease-specific variants in loci jointly associated with coeliac disease and rheumatoid arthritis // Human Mol. Genet. 2016. V. 25. № 1. P. 180–190. https://doi.org/10.1093/hmg/ddv455
Acosta-Herrera M., Kerick M., González-Serna D. et al. Genome-wide meta-analysis reveals shared new loci in systemic seropositive rheumatic diseases // Annals Rheumatic Diseases. 2019. V. 78. № 3. P. 311–319. https://doi.org/10.1136/annrheumdis-2018-214127
Morris D.L., Sheng Y., Zhang Y. et al. Genome-wide association meta-analysis in Chinese and European individuals identifies ten new loci associated with systemic lupus erythematosus // Nat. Genet. 2016. V. 48. № 8. P. 940–946. https://doi.org/10.1038/ng.3603
Morgan D., Rebelato E., Abdulkader F. et al. Association of NAD(P)H oxidase with glucose-induced insulin secretion by pancreatic beta-cells // Endocrinology. 2009. V. 150. № 5. P. 2197–2201. https://doi.org/10.1210/en.2008-1149
Syed I., Kyathanahalli C.N., Kowluru A. Phagocyte-like NADPH oxidase generates ROS in INS 832/13 cells and rat islets: role of protein prenylation // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2011. V. 300. № 3. P. R756–R762. https://doi.org/10.1152/ajpregu.00786.2010
Baig S., Shabeer M., Rizi E.P. et al. Heredity of type 2 diabetes confers increased susceptibility to oxidative stress and inflammation // BMJ Open Diabetes Res. and Care. 2020. V. 8. № 1. P. e000945. https://doi.org/10.1136/bmjdrc-2019-000945
Papanas N., Ziegler D. Risk factors and comorbidities in diabetic neuropathy: an update // Rev. Diabet. Stud. 2015. V. 12. № 1–2. P. 48–62. https://doi.org/10.1900/RDS.2015.12.48
Pande M., Hur J., Hong Y. et al. Transcriptional profiling of diabetic neuropathy in the BKS db/db mouse: A model of type 2 diabetes // Diabetes. 2011. V. 60. № 7. P. 1981–1989. https://doi.org/10.2337/db10-1541
Ma J., Pan P., Anyika M. et al. Modulating molecular chaperones improves mitochondrial bioenergetics and decreases the inflammatory transcriptome in diabetic sensory neurons // ACS Chem. Neurosci. 2015. V. 6. № 9. P. 1637–1648. https://doi.org/10.1021/acschemneuro.5b00165
Hur J., Dauch J.R., Hinder L.M. et al. The metabolic syndrome and microvascular complications in a murine model of type 2 diabetes // Diabetes. 2015. V. 64. № 9. P. 3294–3304. https://doi.org/10.2337/db15-0133
Sas K.M., Kayampilly P., Byun J. et al. Tissue-specific metabolic reprogramming drives nutrient flux in diabetic complications // JCI Insight. 2016. V. 1. № 15. P. e86976. https://doi.org/10.1172/jci.insight.86976
Hinder L.M., Park M., Rumora A.E. et al. Comparative RNA-Seq transcriptome analyses reveal distinct metabolic pathways in diabetic nerve and kidney disease // J. Cell Mol. Med. 2017. V. 21. № 9. P. 2140–2152. https://doi.org/10.1111/jcmm.13136
Guo K., Eid S.A., Elzinga S.E. et al. Genome-wide profiling of DNA methylation and gene expression identifies candidate genes for human diabetic neuropathy // Clin. Epigenet. 2020. V. 12. № 1. P. 1–16. https://doi.org/10.1186/s13148-020-00913-6

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Генетика

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал