Генетика, 2022, T. 58, № 6, стр. 642-660

Молекулярная мимикрия, направленная на изменение баланса “гормонов роста”

Стратегии колонизации растений патогенами часто направлены на изменение параметров их роста. Особенно ярко это проявляется у фитопатогенов, которые индуцируют новообразования (галлы и опухоли) у растения-хозяина для того, чтобы обеспечить себе источник пищи и среду обитания [22]. Одним из способов достижения этих целей является изменение баланса основных гормонов, регулирующих деление клеток и рост растения, – ИУК и ЦК в организме растения-хозяина. Помимо изменения роста тканей растений повышение уровня ИУК и ЦК может ослабить передачу сигнала салициловой кислоты – основного гормона системного иммунитета растений [23, 24].

В свою очередь, изменение баланса ИУК и ЦК в тканях растения-хозяина может быть достигнуто патогеном разными способами: за счет способности патогена синтезировать и секретировать эти фитогормоны, а также за счет его белков-эффекторов, которые могут изменять транспорт или передачу сигнала ИУК или ЦК.

Гены, кодирующие ферменты биосинтеза ИУК и ЦК, были задолго до их идентификации у растений идентифицированы у амебы Dictyostelium [25], а также в вирулентной плазмиде фитопатогенной бактерии Agrobacterium tumefaciens, которая способна переносить часть этой плазмиды в геном растения-хозяина, что приводит к увеличению содержания ИУК и ЦК в растительных тканях и индукции опухоли [26, 27].

В настоящее время считается, что ИУК и ЦК – эволюционно консервативные молекулы, впервые появившиеся у прокариот, в то время как эукариоты могли получить гены биосинтеза ИУК и ЦК как в процессе эволюции от своих прокариотных предков, так и путем ГПГ [28, 29]. Помимо регуляции роста растений эти ферменты могут использоваться у разных живых организмов и для других целей.

Так, самые распространенные из ферментов биосинтеза ЦК тРНК-изопентенилтрансферазы (tRNA-IPT), которые выявлены у бактерий, растений, грибов и животных, включая человека [30], важны для эффективности и точности трансляции белка рибосомой [31]. Другие ферменты этой группы, изопентенилтрансферазы (IPT), синтезирующие ЦК из свободных аденозинфосфатов, а также ферменты катаболизма ЦК цитокининоксидазы (СКХ), помимо растений и взаимодействующих с ними организмов, были идентифицированы у цианобактерий и других бактерий [32]. Это позволяет предположить, что гены метаболизма ЦК у растений были приобретены путем ГПГ через хлоропласты, которые имеют цианобактериальное происхождение [29].

Считается, что ИУК, продуцируемая бактериями и грибами, является вторичным метаболитом, возникающим в процессе метаболизма триптофана, а также используется в качестве сигнала для регуляции генов у некоторых бактерий [28]. Биоинформатические данные свидетельствуют о том, что некоторые ферменты биосинтеза ИУК могли независимо возникнуть у бактерий, водорослей, грибов и высших растений. Кроме того, филогенетический анализ семейств генов, кодирующих ферменты триптофанаминотрансферазы (ТАА) и флавинмонооксигеназы (YUC), задействованные в основном пути производства ИУК у растений, показал, что они могли быть приобретены предками наземных растений от бактерий путем ГПГ [33].

На сегодняшний день гены биосинтеза ИУК и/или ЦК обнаружены у множества видов бактерий и грибов, включая патогенные, симбиотические и свободноживущие виды, а также у нематод, паразитирующих на растениях [5, 6].

Для фитопатогенов разных групп была продемонстрирована важная роль генов биосинтеза ИУК и ЦК во взаимодействии с растением-хозяином. Так, у спорыньи ржи (Claviceps purpurea) в биосинтезе ЦК задействованы как ферменты tRNA-IPT, имеющиеся у всех групп живых организмов, так и уникальный для грибов гибридный фермент IPT-LOG, который катализирует обе последовательные реакции биосинтеза ЦК de novo [34]. Мутанты по любому из генов, кодирующих эти два фермента, способны к заражению ржи, но не образуют плодовых тел, тогда как штаммы с нокаутом обоих генов tRNA-IPT и IPT-LOG неспособны к заражению растений, вероятно, из-за неспособности ослабить иммунитет хозяина или обеспечить эффективное снабжение внедряющихся в растение гиф питательными веществами [34].

Помимо биосинтеза ИУК и ЦК некоторые фитопатогены способны также влиять на транспорт или передачу сигнала этих гормонов за счет определенных белков-эффекторов.

Примеры таких эффекторов изучены у паразитических нематод. Один из них, белок 19C07 свекловичной цистовой нематоды Heterodera schachtii, будучи впрыснут в ткани растения-хозяина через ротовой аппарат (стилет) нематоды в составе секрета ее пищеводных желез, может связываться на поверхности растительных клеток с белком LAX3, функцией которого является транспорт ИУК в клетку [16]. По всей видимости это обеспечивает приток ИУК в клетки, которые образуют так называемый сайт кормления нематоды, способствуя их разрастанию, делению и последующему слиянию в синцитий.

Другой эффектор H. schachtii, белок 10А07, в клетках арабидопсиса взаимодействует с регулятором ответа на ИУК – белком IAA16 [17]. Белок IAA16 относится к семейству белков AUX/IAA, которые являются репрессорами транскрипции ИУК-регулируемых генов, образуя гетеродимеры с ИУК-регулируемыми ТФ ARF [35], – таким образом, связывание 10A07 с IAA16 может привести к снятию репрессии ответа на ИУК. Действительно, растения, сверхэкспрессирующие ген 10A07, демонстрируют повышенную экспрессию ARF6-8 и ARF19 и более восприимчивы к H. schachtii, чем контрольные растения [17]. Более того, белок 10А07, как оказалось, использует растительную регуляторную систему для доставки в ядро: в цитоплазме клеток арабидопсиса он взаимодействует с протеинкиназой, получившей название IPK (interacting plant kinase), которая фосфорилирует 10А07 по консервативным остаткам серина, опосредуя его доставку в ядро. Гены IPK и IAA16 активно экспрессируются в синцитиях, индуцированных H. schachtii [17].

Способностью к взаимодействию с белками AUX/IAA обладают и некоторые бактериальные эффекторы. Например, эффектор AvrRpt2 биотрофной фитопатогенной бактерии Pseudomonas syringae позитивно регулирует передачу сигнала ИУК, стимулируя протеасомную деградацию AUX/IAA [36].

Молекулярная мимикрия, направленная на изменение баланса “гормонов иммунитета”

Салициловая кислота (СК) и жасмоновая кислота (ЖК) с ее производными (вместе называемые жасмонатами) считаются основными гормонами, регулирующими системный иммунитет растений. В регуляции защиты растений от патогенов СК и ЖК могут действовать в одном направлении или быть антагонистами; в целом считается, что СК играет центральную роль в защите от биотрофных патогенов, тогда как ЖК подавляет некротрофные микроорганизмы и предотвращает поедание растений насекомыми [37].

Известно, что некоторые фитопатогены могут снижать выработку СК в организме растения-хозяина, секретируя в качестве белков-эффекторов ферменты хоризматмутазы. Эти ферменты относятся к шикиматному пути, который является одним из древнейших эволюционно консервативных метаболических путей. Хоризматмутазы катализируют превращение хоризмата в префенат, предшественник синтеза тирозина и фенилаланина, и предотвращают образование изохоризмата – предшественника СК.

Первые из обнаруженных примеров секреции хоризматмутаз фитопатогенами были выявлены у паразитических цистовых и галловых нематод [38]. В дальнейшем оказалось, что гены, кодирующие хоризматмутазы, имеются у большого количества видов фитопаразитических нематод, как способных, так и неспособных к индукции галлов на корнях [39–42]. В то же время гены хоризматмутаз отсутствуют у свободноживущей нематоды Caenorhabditis elegans и нематод, паразитирующих на животных, что свидетельствует об их важной роли именно для фитопаразитов [43]. Во многих случаях было получено подтверждение важной роли хоризматмутаз в способности нематод к заражению растений. Так, у галловой нематоды Meloidogyne incognita была подробно изучена роль одного из трех ее генов хоризматмутаз, MiCM3, во взаимодействии с растениями Nicotiana benthamiana. Конститутивная экспрессия MiCM3 у растений подавляла рост корней и повышала восприимчивость к инфекции M. incognita. Кроме того, экспрессия MiCM3 вызвала у растений снижение уровней СК и мРНК гена, кодирующего защитный белок PR1. С помощью конфокальной микроскопии было показано, что белок MiCM3 локализуется в цитоплазме и ядре трансфицированных клеток листьев N. benthamiana, но не в пластидах, где проходят первые этапы биосинтеза СК из хоризмата [42].

Помимо снижения уровня СК экспрессия “нематодных” хоризматмутаз может влиять также на уровень ИУК, поскольку основная масса ИУК в растении синтезируется из триптофана, предшественником которого также является хоризмат. Например, сверхэкспрессия гена хоризматмутазы MjCM-1 галловой нематоды Meloidogyne javanica у сои вызывала подавление формирования боковых корней, и этот эффект компенсировался синтетическими ауксинами [39].

В дальнейшем секреция хоризматмутаз была обнаружена у многих других фитопатогенов. В частности, хоризматмутаза играет важную роль в вирулентности биотрофного патогенного гриба Ustilago maydis, возбудителя пузырчатой головни – широко распространенного заболевания кукурузы, характеризующегося развитием опухолей у пораженных растений. Репертуар эффекторов U. maydis включает в себя множество белков, гены которых экспрессируются исключительно на стадии биотрофии, в том числе ген Cmu1, кодирующий хоризматмутазу. Было показано, что Cmu1 секретируется в месте контакта заражающих гиф с растительными клетками, попадая в их цитоплазму, а также может распространяться в соседние клетки и ткани, изменяя метаболический статус этих клеток посредством метаболического прайминга [44].

У бактерий, в том числе фитопатогенных, также были выявлены гены хоризматмутаз. Так, бактерия Xanthomonas oryzae pv. oryzae, возбудитель бактериального ожога риса (rice leaf blight disease), содержит ген хоризматмутазы СМ, который экспрессируется при заражении растений [45]. Как ни странно, нокаут этого гена резко повышает вирулентность X. oryzae. Аналогичные данные о гипервирулентности мутанта с потерей функции гена хоризматмутазы были получены для близкородственной бактерии X. arboricola pv. juglandis, вызывающей заболевание грецкого ореха [46]. Эти данные позволяют предположить роль хоризматмутаз как супрессоров вирулентности ксантомонад: они могут участвовать в подавлении гиперинфицирования, которое может привести к преждевременной гибели растения-хозяина [45].

Широкое распространение секретируемых хоризматмутаз и их роль в вирулентности фитопатогенных нематод, грибов и бактерий свидетельствуют о том, что этот эволюционно древний путь может быть в числе высоко консервативных, общих для разных патогенов инструментов манипуляции с метаболизмом растения-хозяина. В то же время филогенетический анализ показал, что по крайней мере некоторые из генов секретируемых хоризматмутаз фитопаразитических нематод с высокой вероятностью могли быть приобретены в результате ГПГ от почвенных бактерий Burkholderia [47].

Помимо хоризматмутаз некоторые фитопатогены могут секретировать также другие ферменты шикиматного пути, снижающие уровень СК в растении, например изохоризматазы. Так, изохоризматазы, секретируемые оомицетами Phytophthora sojae и Verticillium dahlia, повышают вирулентность этих патогенов, снижая уровень СК в тканях растений-хозяев [48].

В основе другого известного пути подавления СК-опосредованного иммунитета растений лежит активация передачи сигнала ЖК и жасмонатов, поскольку в системном иммунитете антагонизм СК и ЖК играет важную роль, по крайней мере, на начальных этапах его развития [37].

Этот путь используется патогенными биотрофными бактериями P. syringae [49]. Во-первых, P. syringae в качестве фитотоксина (вторичного метаболита, негативно влияющего на жизнедеятельность растительных клеток) секретирует коронатин, структурный и функциональный аналог производного ЖК жасмонил-1-изолейцина. Коронатин, как и жасмонаты, в растительной клетке может взаимодействовать с рецептором ЖК – белком CORONATINE INSENSITIVE 1 (COI1) и активировать нижележащий сигнальный каскад, приводя к репрессии СК-зависимого защитного ответа растений [8]. Коронатин продуцируется разными патоварами P. syringae, и способность к его синтезу определяет ее вирулентность по отношению к разным видам растений, а также коррелирует с проявлением симптомов, вызываемых P. syringae – диффузными хлорозами [49].

Кроме того, белок-эффектор HopZ1a той же P. syringae напрямую взаимодействует с белками JAZ (Jasmonate ZIM-domain), репрессорами транскрипции ЖК-регулируемых генов [7]. Известно, что убиквитин-зависимая протеасомная деградация белков JAZ запускается при связывании ЖК с рецептором COI1, который является субъединицей убиквитин-лигазного комплекса [50]. Эффектор HopZ1а активирует этот процесс: при взаимодействии с HopZ1a имеет место ацетилирование белков JAZ за счет предполагаемой ацетилтрансферазной активности этого бактериального эффектора, что способствует деградации взаимодействующих с HopZ1 JAZ и активирует передачу сигнала ЖК. Более того, HopZ1a может частично устранить дефект вирулентности у мутанта P. syringae, неспособного к синтезу коронатина [7]. Эффектор HopZ1a на сегодняшний день нельзя считать примером молекулярной мимикрии, так как никакого его аналога у растений выявлено не было. Тем не менее кооперация двух эффекторов P. syringae, нацеленных на активацию сигналинга ЖК, свидетельствует о чрезвычайной важности этого пути для вирулентности этого бактериального фитопатогена [8].

Молекулярная мимикрия, направленная на дестабилизацию клеточной стенки растения

Стенка растительной клетки – первое препятствие, с которым сталкиваются фитопатогены в ходе заражения растений. В связи с этим патогены используют ферменты дестабилизации клеточных стенок как для своего роста и продвижения в тканях растения-хозяина, так и для получения доступа к питанию через разрушение растительных клеток. У разнообразных фитопатогенных организмов – бактерий, грибов, простейших, паразитических нематод был выявлен целый ряд ферментов, разрушающих клеточную стенку растений, включая целлюлазы, ксиланазы, пектатлиазы, полигалактуроназы, а также экспансин-подобные белки, сходные с таковыми у растений.

Более того, наличие ферментов этой группы присуще не только фитопатогенам. Например, целлюлазы как индуцибельные ферменты, синтезируемые различными микроорганизмами, включая бактерии и грибы, во время их роста на целлюлозных материалах, нашли широкое применение в промышленности [51]. Экспансины – небольшие белки без каталитической активности, которые ослабляют связь между целлюлозными фибриллами в стенках растительных клеток, также выявлены у многих бактерий и грибов, которые взаимодействуют с растениями в патогенных и мутуалистических сообществах, а также у микробов, питающихся растительными останками [52].

Наличие активности белков, вызывающих дестабилизацию и/или гидролиз клеточной стенки растений, важно для вирулентности многих фитопатогенных микроорганизмов. Например, у Clavibacter michiganensis, актиномицета, вызывающего кольцевую бактериальную гниль картофеля и томатов, основные гены вирулентности сосредоточены на плазмидах, потеря которых превращает этого биотрофного патогена в эндофита. К потере вирулентности C. michiganensis ведет также потеря функции локализованного на одной из вирулентных плазмид гена CelA, кодирующего целлюлазу с экспансин-подобным доменом [53]. Целлюлазы и экспансин-подобные белки играют важную роль в вирулентности Fusarium graminearum – грибного патогена, вызывающего фузариоз колоса пшеницы: их активность необходима для продвижения патогена в тканях растения и коррелирует с интенсивностью вызываемых симптомов [54].

Ферменты дестабилизации клеточных стенок играют важную роль в жизненном цикле различных видов нематод, паразитирующих на растениях [3]. Первые из ферментов этой группы, выявленные у животных, – целлюлазы цистовых нематод Globodera rostochiensis и Heterodera glycines – были идентифицированы еще в 1998 г. [55], в дальнейшем у каждого из изученных видов фитопаразитических нематод были выявлены целые группы этих ферментов [56]. Такие ферменты секретируются в клетки растений через прокалывающий их стилет в составе секрета пищеводных желез фитопаразитических нематод и играют роль как в продвижении нематоды по растительным тканям, так и в формировании синцитиев в сайтах кормления цистовых и галловых нематод [3]. Например, РНК-интерференция гена целлюлозосинтазы G. rostochiensis снижает эффективность проникновения нематод в корень, а также количество синцитиев и их размеры [57].

Помимо “своих” нематоды могут использовать и растительные белки, влияющие на стабильность клеточной стенки: для этого у ряда нематод тоже есть соотвествующие эффекторы. Так, пектинметилэстераза арабидопсиса PME3 взаимодействует с целлюлозосвязывающим белком HgCBP, который секретируется H. schachtii на ранних этапах развития синцития. Трансгенные растения, сверхэкспрессирующие ген PME3, были более восприимчивы к инфекции H. schachtii, в то время как нокаут-мутант показал противоположный эффект, что указывает на важность PME3 для паразитизма нематод. При этом сверхэкспрессия HgCBP у арабидопсиса резко повышает активность фермента PME3 in planta [58].

В то же время нематоды, не паразитирующие на растениях, обычно не нуждаются в ферментах дестабилизации клеточной стенки, и соответствующие гены не были идентифицированы в их геномах [10, 11]. Считается, что гены ферментов дестабилизации клеточной стенки появились у фитопаразитических нематод в результате ГПГ. Действительно, белковые последовательности этих ферментов демонстрируют высокий уровень сходства с соответствующими бактериальными белками: например, ближайшие “родственники” полигалактуроназ GH28 видов Meloidogyne обнаружены у Ralstonia solanacearum – патогенной почвенной бактерии, которая заражает те же растения-хозяева, что и Meloidogyne. В то же время пектатлиазы Meloidogyne PL3 кластерируются с соответствующими ферментами C. michiganensis [10, 12].

В свою очередь, несмотря на наличие у бактерий и грибов “своих” генов целлюлаз, полигалактуроназ, пектатлиаз и т.д., их экспансин-подобные белки были, возможно, приобретены с помощью ГПГ от растений, а в дальнейшем могли передаваться через ГПГ между микроорганизмами. Об этом свидетельствует нерегулярное таксономическое распределение генов, кодирующих экспансины, у микроорганизмов [52].

Молекулярная мимикрия, направленная на имитацию пептидных фитогормонов

Пептидные фитогормоны – обширная группа регуляторов роста растений белковой или пептидной природы. В настоящее время у растений идентифицировано более двадцати классов пептидных фитогормонов с очень разнообразными функциями в развитии: от контроля деления клеток и органогенеза до регуляции ответов на факторы окружающей среды и защиты от патогенов [59]. Изучение пептидных фитогормонов – очень быстро развивающаяся область биологии растений, при этом постоянно идет идентификация не только новых компонентов их сигнальных путей, но и выявление новых групп пептидных регуляторов роста, в том числе – за пределами растительного царства [4].

Большинство классов пептидных фитогормонов кодируются большими генными семействами у каждого вида высших растений. Пептидные фитогормоны синтезируются в виде белков-предшественников, которые обычно включают в себя N-концевой сигнальный домен, направляющий пептид по секреторному пути, вариабельную область и функционально значимый C-концевой домен, который отщепляется от белка-предшественника во время протеолитического процессинга и претерпевает модификации некоторых консервативных аминокислотных остатков [60]. Зрелые пептидные фитогормоны, последовательности которых соответствуют C-концевым доменам белков-предшественников с внесенными пост-трансляционными модификациями, секретируются в апопласт, где взаимодействуют на поверхности растительных клеток со своими рецепторами – как правило, ими являются серин-треониновые протеинкиназы с внеклеточным доменом, содержащим лейцин-богатые повторы (LRR-RLK, Leucine-Rich Repeats Receptor Like Kinase) [61, 62].

В настоящее время вне растительного царства гены, кодирующие пептидные фитогормоны, были выявлены у ряда бактерий и грибов (как правило, фитопатогенных, но также у некоторых симбиотических и других ассоциированных с растениями организмов, таких как грибы арбускуллярной микоризы и ризосферные бактерии), а также у паразитических нематод. Некоторые из “нерастительных” пептидных фитогормонов подробно изучены, например у паразитических нематод [18], другие же были выявлены совсем недавно, и их роль во взаимодействии патогенов с растениями не выяснена [63].

Скорее всего способность синтезировать эффекторы, имитирующие пептидные фитогормоны, развивалась независимо у разных групп организмов, взаимодействующих с растениями. Важный вопрос – как появились гены пептидных фитогормонов у растительных паразитов и симбионтов: произошло ли это в результате длительной совместной эволюции паразита/симбионта и хозяина или в результате ГПГ. С одной стороны, гипотеза конвергентной эволюции кажется более логичной, чем ГПГ, поскольку отсутствуют доказательства, необходимые для принятия гипотезы ГПГ (например, филогенетическое несоответствие между происхождением видов и деревьями генов). С другой стороны, относительно короткие последовательности генов, кодирующих пептидные фитогормоны, обладают ограниченным филогенетическим сигналом, что затрудняет получение данных о происхождении таких пептидов [9].

В случае “нерастительных” пептидных фитогормонов конвергентная эволюция, скорее всего, имела место для наиболее изученного случая пептидно-фитогормональной мимикрии у бактерий, а именно PSY1-подобных пептидов RaxX видов Xanthomonas (см. ниже).

В то же время для пептидных фитогормонов паразитических нематод гипотеза ГПГ также представляется весьма вероятной, учитывая, что такие необходимые факторы паразитизма как гены белков-дестабилизаторов клеточной стенки были приобретены нематодами от бактерий и грибов [11]. Совсем недавно гены, кодирующие пептидные фитогормоны тех же семейств, что играют роль в паразитизме у нематод, были выявлены у некоторых видов бактерий и грибов, взаимодействующих с растениями, что также может быть косвенным подтверждением гипотезы ГПГ [63].

Пептидные фитогормоны нематод: регуляторы деления клеток

К настоящему времени пептидные фитогормоны идентифицированы у нескольких групп фитопаразитических нематод, а именно цистовых (представители родов Globodera и Heterodera) и галловых (род Meloidogyne), образующих галлы на корнях растений-хозяев, а также у близких к цистовым почковидных нематод (род Rotylenchulus), неспособных к галлообразованию, но также индуцирующих синцитиальные сайты кормления. У паразитических нематод обнаружены пептидные фитогормоны семейств CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION-RELATED (CLE), C‑TERMINALLY ENCODED PEPTIDES (CEP) и INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION (IDA) [18].

Пептиды CLE – первые из идентифицированных и наиболее хорошо изученные пептидные гормоны растений – играют важную роль в таких процессах как контроль активности меристем, эмбриогенез, ответ на абиотические факторы среды (содержание нитратов, доступность воды) и растительно-микробные взаимодействия (развитие азотфиксирующих клубеньков при взаимодействии с ризобиями) [59, 64]. Пептиды СЕР – регуляторы роста стебля и корня, а также развития боковых корней и клубеньков и ответа на абиотический стресс, в особенности – на дефицит азота [59, 65]. Пептиды IDA опосредованно регулируют дестабилизацию клеточной стенки при таких процессах как формирование отделительного слоя опадающих листьев, цветков и плодов, рост примордия бокового корня через слои клеток эндодермы и коры, а также взаимодействие с патогенами [59, 66].

При этом у галловых нематод имеются гены, кодирующие пептиды всех трех семейств (а также близкие к ним пептиды МАР, см. ниже), у цистовых – только гены CLE, а у почковидных – CLE и СЕР. Более того, последовательности и доменная структура соответствующих пептидов различаются у разных групп нематод, особенно у цистовых и галловых. Как и пептидные гормоны растений, предшественники пептидных фитогормонов нематод помимо функционального С-концевого домена (CLE-, CEP- или IDA-домена, соответственно) содержат N-концевой сигнальный домен, который предположительно направляет их к упаковке в секреторные гранулы в клетках пищеводных желез [18]. Также предшественники пептидных фитогормонов всех цистовых и почковидных нематод, но не галловых нематод, включают в себя центральный вариабельный домен [18, 67, 68]. Некоторые виды нематод (как и некоторые виды растений) имеют мультидоменные предшественники пептидных фитогормонов, содержащие от двух до девяти функциональных С‑концевых доменов: например, все CLE картофельной цистовой нематоды Globodera rostochiensis [69], CLE-подобные белки MAP (Meloidogyne Avirulense Proteins) галловых нематод [70] и СЕР почковидных нематод рода Rotylenchulus [71].

Как и прочие эффекторы фитопаразитических нематод, предшественники пептидных фитогормонов секретируются в клетки корня растения-хозяина в составе секрета пищеводных желез [20, 72, 73]. В клетках растений они подвергаются процессингу, в результате которого получаются зрелые пептиды. В частности, на примере мультидоменных CLE G. rostochiensis было показано, что для протеолитического процессинга и гликозилирования предшественников пептидных фитогормонов нематод используются соответствующие ферменты растения-хозяина [69].

Зрелые пептиды, полученные в результате процессинга “нематодных” предшественников пептидных фитогормонов в растительной клетке, способны взаимодействовать с рецепторами соответствующих пептидных гормонов растения и активировать нижележащие сигнальные пути. Например, было показано, что на поверхности клеток арабидопсиса пептиды CLE свекловичной нематоды H. schachtii (HsCLE) могут связываться с рецепторами растительных CLE: CLAVATA1 (CLV1), CLAVATA2/CORYNE (CLV2/CRN) BARELY ANY MERISTEM 1 и 2 (BAM1, BAM2), RECEPTOR PROTEIN KINASE 2 (RPK2) и TDIF RECEP-TOR (TDR) [74–78], тогда как пептиды GrCLE золотистой картофельной нематоды G. rostochiensis способны связываться с рецептором StCLV2 картофеля [79]. Гены, кодирующие рецепторы CLV1, CLV2-CRN и RPK2, экспрессируются в синцитиях, индуцированных H. schachtii в корнях арабидопсиса [76], а РНК-интерференция генов, кодирующих эти же рецепторы у сои, повышает устойчивость растений к соевой нематоде Heterodera glycines [80].

Связывание с растительными рецепторами HAESA (HAE) и HAESA-LIKE 2 (HSL2) предполагается также для IDA пептидов галловых нематод MiIDL1 и MiIDL2 (M. incognita IDA-Like): мутанты арабидопсиса с потерей функции этих рецепторов не способны к ростовому ответу на MiIDL и “растительные” IDA [81].

Помимо рецепторов пептидных гормонов растений некоторые из “нематодных” пептидных фитогормонов могут взаимодействовать c другими белками в растительных клетках. Так, пептид CLЕ M. incognita, он же белок-эффектор 16D10, в клетках растений напрямую взаимодействует с ядерными белками SCL6/HAM3 и SCL2 (SCARECROW-LIKE6 и 2) из семейства ТФ GRAS [82]. Известно, что SCL6/HAM3 принимает участие в спецификации апикальной меристемы корня [83], однако механизм и значение взаимодействия 16D10 с ТФ SCL остаются неясным.

Пептидные фитогормоны паразитических нематод в экспериментах по экзогенной обработке и сверхэкспрессии соответствующих генов вызывали у растений ростовые ответы, сходные с теми, которые вызываются аналогичными семействами пептидных фитогормонов растительного происхождения. Например, экзогенная обработка растений арабидопсиса разными группами пептидов CLE нематод (имеющих сходство с разными группами пептидов CLE растений) вызывает массивную пролиферацию клеток в корнях, что позволяет предположить, что обе группы пептидов CLE нематод могут способствовать пролиферации клеток во время формирования сайта кормления [75]. Сверхэкспрессия гена 16D10 M. incognita вызывает ускоренный рост корней у арабидопсиса [82]. Сверхэкспрессия генов H. schachtii HsCLE1 и HsCLE2 восстанавливает нормальный фенотип у мутанта clv3 [78], а сверхэкспрессия гена MiIDL1 M. incognita – у мутанта ida [81]. Напротив, пептиды CEP нематод, по-видимому, ограничивают размер сайтов кормления, так как обработка корней арабидопсиса пептидом RrCEP1 из Rotylenchulus reniformis вызывает уменьшение размера синцитиев при заражении нематодами [71].

Очевидно, что ростовые реакции, вызываемые пептидными фитогормонами нематодного происхождения, вносят вклад в способность нематод заражать корни растений. Так, активация экспрессии генов, кодирующих пептидные фитогормоны, на паразитарных стадиях развития нематод [20, 69, 71–73, 84, 85] наряду с тем фактом, что трансгенные растения, экспрессирующие двухцепочечную РНК, комплементарную CLE нематод, устойчивы к нематодному заражению [85], указывают на важную роль этих пептидов в паразитизме. Об этом же свидетельствует тот факт, что РНК-интерференция гена 16D10 M. incognita у картофеля повышает устойчивость растений к пяти видам Meloidogyne [82].

Пептидные фитогормоны бактерий: сигнал для иммунитета растений (и не только)

Наиболее изученным примером бактериальных эффекторов, имитирующих пептидные фитогормоны, является пептид RaxX, продуцируемый бактерией Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Этот белок является гомологом белков PLANT PEPTIDES CONTAINING SULFATED TYROSINE (PSY) растений [86, 87].

В геноме арабидопсиса имеются два гена, кодирующие пептиды-предшественники PSY: наиболее высокий уровень их экспрессии имеет место в апикальной меристеме побега и зоне элонгации корня. Рецептор PSY1 – рецепторная киназа PSY1R (PSY1 RECEPTOR) – при связывании лиганда образует гетеродимер с корецептором SERK1 (SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE1). Мишенью ее действия является мембранная H⁺-АТФаза 2: фосфорилируя и активируя ее, киназа PSY1R способствует закислению межклеточного пространства и повышению лабильности клеточной стенки, что способствует росту клеток растяжением [88].

Изучение бактериального эффектора RaxX началось с открытия гена Xa21 риса, который кодирует рецепторную киназу семейства LRR-RLK и придает устойчивость растения к X. oryzae pv. оryzae [89]. Поиск генов X. oryzae, необходимых для активации Xa21 (генов Rax, от Required for Activation of Xa21), привел к идентификации гена RaxX. В дальнейшем гены RaxX были обнаружены у многих видов Xanthomonas. Высокая консервативность последовательностей генов RaxX у разных видов свидетельствует об их важной биологической функции [86, 87].

Продукт другого Xa21-активирующего гена X. oryzae, кодирующего бифункциональную протеазу/переносчик RaxB, необходим для протеолитического процессинга и созревания пептида RaxX. Кроме того, для функционирования RaxX важно его сульфатирование по консервативному остатку тирозина тирозинсульфотрансферазой RaxST. Таким образом, Xanthomonas самостоятельно обеспечивает созревание пептида RaxX в бактериальной клетке и секретирует его в виде протеолитически процессированного и сульфатированного зрелого пептида [90]. Это отличается от ситуации с фитопатогенными грибами и нематодами, которые секретируют только предшественники пептидных фитогормонов и используют ферменты растения-хозяина для их созревания [79, 91].

Пептид RaxX из различных видов Xanthomonas, как и пептид AtPSY1 арабидопсиса, стимулирует рост корней. В то же время пептид AtPSY1, в отличие от RaxX, не может активировать Xa21-опосредованный иммунитет у растений риса [86]. Наконец, было показано, что пептиды RaxX и AtPSY взаимодействуют с разными рецепторами: RaxX, но не AtPSY1, напрямую и с высокой аффинностью связывается с LRR-RLK Xa21 риса [90].

На сегодняшний день Xanthomonas – единственный известный фитопатоген, который секретирует готовый пептидный фитогормон. Кроме того, уникальной является ситуация со специфичностью рецептора этого пептида: только RaxX взаимодействует с рецептором Xa21 риса, который, следовательно, является не рецептором растительного гормона, а специализированным рецептором для бактериального эффектора. В связи с этим предполагается, что система RaxX–Xa21, судя по всему, представляет собой частный случай иммунитета растения, запускаемого эффектором (Effector-Triggered Imunity, ETI). Эта система включает в себя бактериальные эффекторы и связывающие их высокоспецифичные поверхностные или внутриклеточные LRR-содержащие иммунные рецепторы растения, которые возникли в результате длительной коэволюции патогенов и их хозяев [92]. Пептид RaxX используется бактерией для облегчения заражения растений, однако иммунная система растений “обманула” Xanthomonas, поскольку захват эффектора RaxX рецептором Xa21, ставшим частью системы ETI, останавливает распространение бактерии [86, 87].

Недавно у фитопатогенных бактерий были выявлены также пептидные фитогормоны семейств СЕР и RAPID ALKALINIZATION FACTOR (RALF), но биологические функции этих пептидов пока не выяснены. Так, девять видов актинобактерий, большинство из которых являются патогенными для растений, например Streptomyces acidiscabies, возбудитель парши картофеля, продуцируют белки, содержащие С-концевой домен RALF. Уникальной особенностью бактериальных белков RALF является домен, гомологичный субъединице S1 коклюшного токсина, который отсутствует в RALF растений и грибов и может свидетельствовать о различиях функций бактериальных и прочих RALF белков [93]. Бактериальный гомолог CEP был обнаружен у Ralstonia syzygii subsp. syzygii – патогена, вызывающего болезнь Суматры у гвоздичных деревьев в Индонезии [63].

Пептидные фитогормоны грибов: неясные функции

Фитопатогенные грибы растений могут манипулировать развитием и иммунным ответом растений-хозяев с помощью сложных и разнообразных механизмов, включая выработку ИУК и ЦК [5, 6], а также секрецию белковых эффекторов – гомологов пептидных гормонов растений (см. ниже).

На сегодняшний день у фитопатогенных грибов выявлены эффекторы, имитирующие пептидные фитогормоны семейств RAPID ALKALINIZATION FACTOR (RALF), фитосульфокины (PSK) и IDA: пептиды RALF и PSK широко распространены в царстве грибов и были идентифицированы более чем у 20 фитопатогенных видов аскомицетов и базидиомицетов [63, 91, 93], в то время как пептиды IDA были обнаружены только у двух видов грибов [63].

Ген, кодирующий близкий гомолог растительных пептидов RALF, был впервые идентифицирован у Fusarium oxysporum – распространенного фитопатогенного гриба с широким кругом хозяев, гифы которого распространяются по сосудистой системе растений, вызывая дефицит воды и увядание – фузариозный вилт [94].

Пептиды RALF у растений впервые были обнаружены как факторы, повышающие рН среды при их добавлении в культуру клеток табака: конечной мишенью их действия, по-видимому, является H⁺-АТФаза 2, активность которой негативно регулируют RALF. Благодаря такому действию пептиды RALF являются негативными регуляторами ИУК: обработка растений пептидами RALF вызывает снижение скорости удлинения корней. Кроме того, пептиды RALF известны как регуляторы повышения уровня активных форм кислорода (ROS, Reactive Oxygen Species) при биотическом и абиотическом стрессе [95].

Белок-предшественник RALF, кодируемый геном F. oxysporum (F-RALF), как и соответствующие белки растений, содержит консервативный домен RALF, соответствующий зрелому пептиду, и N-концевой сигнальный домен, необходимый для секреции. В дальнейшем гены RALF были идентифицированы в геномах 26 видов биотрофных и некротрофных фитопатогенных грибов: некоторые из этих видов грибов имеют по нескольку RALF-подобных генов. Все виды грибов, которые обладают генами RALF, являются патогенами растений, что указывает на роль RALF в патогенезе грибов. По всей видимости, RALF F. oxysporum взаимодействует с растительным рецептором пептидов RALF – протеинкиназой FERONIA: мутант арабидопсиса с потерей функции этого рецептора не проявляет ингибирования роста в ответ на заражение F. oxysporum [91, 93].

Интересно, что у близкого вида фитопатогенных грибов, Fusarium graminearum, пептид RALF, по-видимому, не важен для вирулентности: мутантные штаммы с потерей функции своего единственного гена FgRALF проявляют нормальную способность к заражению растений [96]. Таким образом, консервативная роль пептидов RALF в патогенезе грибов остается под вопросом.

Также среди грибов довольно широко распространены гомологи пептидов PSK, которые были идентифицированы у пяти видов базидиомицетов (виды рода Tilletia) и 19 видов аскомицетов (но не у F. oxysporum и близких к нему видов) [63]. Фитосульфокины (PSK) растений, в отличие от пептидов RALF, являются активаторами роста и деления клеток, играя роль в контроле активности меристем, росте пыльцевой трубки и реакции на патогенез [97]. Все грибы, содержащие гомологи генов PSK, также являются фитопатогенными, что позволяет предположить роль “грибных” фитосульфокинов во взаимодействии с растением-хозяином. Тем не менее роль генов PSK фитопатогенных грибов в настоящее время не была изучена в связи с совсем недавним их открытием [63].

Совершенно не изучены также функции пептидов IDA, выявленных у двух видов фитопатогенных грибов – базидиомицета Melampsora larici-populina и аскомицета Colletotrichum fructicola [63].

Другие примеры молекулярной мимикрии у фитопатогенов

Помимо вышеописанных примеров молекулярной мимикрии, у разных групп фитопатогенов описано довольно много частных случаев эффекторов, которые имитируют определенные белки растений-хозяев и способствуют повышению эффективности заражения, осуществляя определенные функции в клетке растений. Поскольку таких примеров множество, мы остановимся только на нескольких наиболее интересных эффекторах, обнаруженных у фитопаразитических нематод.

Нематоды рода Heterodera в числе прочих эффекторов секретируют в ткани корня растений аннексин-подобные белки, которые демонстрируют функциональное сходство с аннексинами растений [98, 99]. Аннексины – консервативные для эукариот белки, которые связывают ионы кальция и фосфолипиды и участвуют во множестве клеточных процессов, в том числе – в ответе на абиотический стресс и патогенез у растений. Предполагается, что аннексины нематод могут играть роль в подавлении иммунной реакции растений: так, экспрессия гена, кодирующего секретируемый аннексин H. avenae, вызывает подавление местной иммунной реакции сверхчувствительности (Hypersensitivity response, HR) на различные бактериальные индукторы, такие как флагеллин. Нокаут этого же гена у нематоды резко снижает ее способность к заражению растений [99].

Другой пример – нематодные эффекторы, вызывающие убиквитинирование белков растения-хозяина. У цистовых (но не у галловых) нематод были выявлены эффекторы из семейства белков удлинения цепей убиквитина (Ubiquitin Extension Protein, UEP). Было показано, что белки из этого семейства HsUBI1 H. schachtii и GrUBCEP12 G. rostochiensis могут быть важны для развития успешного паразитизма на растениях, так как их РНК-интерференция снижала восприимчивость растений к нематодам [100]. Мишени этих белков в растительных клетках неизвестны.

Наконец, некоторые эффекторные белки, секретируемые фитопатогенными нематодами, могут регулировать экспрессию генов растения-хозяина, выступая в качестве транскрипционных факторов. Так, эффектор M. incognita 7H08 имеет домены ядерной локализации и после секреции доставляется в ядро растительной клетки. Более того, было показано, что этот белок может активировать транскрипцию репортерных генов как в дрожжевой системе, так и in planta [101].