Генетика, 2022, T. 58, № 9, стр. 1094-1098

Рак яичника (РЯ) является второй причиной смертности среди онкогинекологических заболеваний в мире [1]. За 2020 г. в Российской Федерации выявлено 12 444 новых случаев опухолей яичников. Распространенность данного заболевания составила 80.4 случаев на 100 тыс. населения [2]. Современная теория канцерогенеза основывается на том, что помимо внешних факторов, для возникновения опухоли важно наличие генетической предрасположенности [3]. Известно, что патогенез РЯ в ряде случаев, чаще всего при наследственном варианте заболевания, тесно связан с мутациями генов-онкосупрессоров BRCA1 и BRCA2 [4]. Однако мутации в этих генах отвечают за 10–15% случаев РЯ. Установлено, что в поддержании стабильности генома клетки и предотвращении неопластической трансформации участвует система апоптоза и контроля клеточного цикла. Возникновение злокачественных новообразований часто связано с нарушением в ее функционировании. Ключевыми в системе апоптоза и контроля клеточного цикла являются гены TP53, MDM2 и CDKN1A. В литературе описано, что полиморфные маркеры этих генов связаны с повышенным риском развития ряда онкологических заболеваний, в частности, рака шейки матки, рака молочной железы, рака эндометрия, лейкоза [5–8].

В норме, в неповрежденных клетках, продукт гена TP53 – белок p53, нестабилен и присутствует в очень низкой концентрации за счет его связывания с белком mdm2 [9]. При повреждении структуры ДНК фосфорилирование p53 снижает его связывание с mdm2. Затем белок mdm2 деградирует, что позволяет р53 накапливаться, полностью активироваться и индуцировать транскрипцию гена CDKN1A. Продукт гена CDKN1A – белок p21, взаимодействует с комплексом циклина и циклин-зависимых киназ Cyclin-CDK2/CDK1, ингибирует его активность и предотвращает вступление клетки в S-фазу, вызывая тем самым длительную остановку клеточного цикла [10]. Исследование полиморфных маркеров наиболее важных генов контроля клеточного цикла и апоптоза при РЯ позволит лучше понимать патогенез этого заболевания.

Цель работы – изучение связи между статусом полиморфных маркеров генов TP53 (Arg72Pro), MDM2 (T(–410)G) и CDKN1A (Ser31Arg) и риском развития РЯ.

Исследуемые биологические образцы получены из ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава России. Исследование проводилось с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с Федеральным законом “Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации” (от 21.11.2011 № 323-ФЗ).

Критериями включения пациентов в работу были удовлетворительное общее состояние, нормальная функция кроветворения, почек, печени, морфологически подтвержденный диагноз РЯ. Диагноз и гистологическая форма РЯ устанавливались на основании гистологического исследования в НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова. В ходе работы изучена венозная кровь от 70 здоровых женщин-доноров с медианой возраста 48 лет (23–70), опухолевая ткань от 66 больных РЯ (Ia–IV стадия) с медианой возраста 51 год (28–75), у части больных (37 человек) также отобраны образцы крови. Забор образцов крови проводился до начала химиотерапии, образцы опухолевой ткани получены в ходе первичной циторедуктивной операции.

Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из крови и ткани с использованием набора реагентов Diatom DNA Prep 400 (“Лаборатория Изоген”, Россия).

Определение статуса полиморфных маркеров Arg72Pro гена TP53, T(–410)G гена MDM2 и Ser31Arg гена CDKN1A осуществляли методом ПЦР в реальном времени с флуоресцентными аллельспецифичными зондами на термоциклере “CFX96 Touch Real-Time System” (Bio-Rad, США). Аллельную дискриминацию проводили с помощью программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager. Последовательности и температура отжига (Т_отж) использованных в работе праймеров и зондов указаны в табл. 1. Реакции проводили в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8.8, 16.6 мМ сульфат аммония, 0.01%-ный Твин-20, 2 мМ хлорида магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров (“Евроген”, Россия), 250 нМ флуоресцентных зондов (“ДНК-Синтез”, Россия), 1.5 ед. Taq ДНК-полимеразы (“Евроген”). Условия амплификации фрагментов ДНК: 95°С – 20 с; 40 циклов: 95°C – 10 с, Т_отж – 30 с, 72°C – 30 с.

Статистический анализ проводился в программе Statistica 8.0 (StatSoft). При сравнении частот аллелей и генотипов использовался стандартный критерий χ² Пирсона. Полученные результаты проверялись на соблюдение равновесия Харди–Вайнберга для каждого исследуемого полиморфного маркера в программе Arlequin 3.0. Комплексную оценку взаимосвязи между исследуемыми аллелями, генотипами и риском заболевания проводили с помощью программы Calculator for confidence intervals of odds ratio [11], определяя отношение шансов (ОШ) и 95%-ный доверительный интервал (95% ДИ). Различия при значениях p < 0.05 оценивались как значимые.

В ходе работы изучено распределение генотипов полиморфных маркеров Arg72Pro гена TP53, T(–410)G гена MDM2 и Ser31Arg гена CDKN1A у здоровых доноров и больных РЯ. В табл. 2 представлены частоты распределения генотипов маркеров исследуемых генов. Установлено, что распределение частот генотипов полиморфных маркеров среди контрольной группы находится в равновесии Харди–Вайнберга (p > 0.8). При сравнении распределения частот аллелей для крови (n = 37) и ткани (n = 66), полученных от больных РЯ, не обнаружено различий между ними (точный тест Фишера, p = 0.52–0.77). С целью увеличения статистической мощности работы были использованы результаты для образцов ткани.

На основании полученных данных проведен расчет риска развития РЯ. Результаты для каждого из аллелей исследуемых генов представлены в табл. 3. Выявлено отсутствие различий в частоте распределения аллелей маркеров в группах здоровых доноров и больных РЯ и, следовательно, связи с риском развития РЯ для аллелей маркеров (р = 0.29–1.0).

Результаты расчета отношения шансов риска развития РЯ для каждого из генотипов исследуемых генов, вычисленные с использованием кодоминантной модели наследования, представлены в табл. 4. Для маркера Arg72Pro гена TP53 (при использовании кодоминантной модели) носительство генотипа Pro/Pro связано с тенденцией к повышению риска развития РЯ (ОШ = 1.55, 95% ДИ = 0.39–4.36, р = 0.13). В случае доминантной и рецессивной моделей наследования связи с развитием РЯ не выявлено (ОШ = 0.72, 95% ДИ = = 0.37–1.44, р = 0.39 и ОШ = 1.72, 95% ДИ = 0.66–3.31, р = 0.34 соответственно).

При изучении генотипов маркера T(–410)G гена MDM2 с использованием кодоминантной и рецессивной моделей наследования связь с риском РЯ не обнаружена (ОШ = 1.0, 95% ДИ = 0.33–3.02, р = 1.0 и ОШ = 0.97, 95% ДИ = 0.39–2.37, р = 1.0 соответственно) также, как и в случае доминантной модели (ОШ = 0.59; 95% ДИ = 0.3–1.16; р = 0.17).

Ассоциации генотипов маркера Ser31Arg гена CDKN1A с развитием РЯ также обнаружено не было (кодоминантная модель: ОШ = 1.05, 95% ДИ = 0.19–5.75, р = 0.62; доминантная модель: ОШ = 1.44, 95% ДИ = 0.63–3.31, р = 0.41; рецессивная модель: ОШ = 0.62, 95% ДИ = 0.14–2.70, р = 0.72).

Нами выявлено, что носительство аллеля Pro полиморфного маркера Arg72Pro гена TP53 не связано с риском развития РЯ у женщин Московского региона. Подобные результаты получены в мета-анализе A. Zhang с соавт., где при исследовании выборки, состоящей в основном из европейцев (90.1% среди больных РЯ и 89.4% среди контрольной группы), получено, что аллель Pro не связан с повышенным риском развития РЯ (ОШ = 1.06, 95% ДИ = 0.93–1.20) [12]. При рассмотрении генотипов в нашей работе выявлена тенденция к повышению риска развития РЯ для генотипа Pro/Pro в случае кодоминантной модели наследования. Схожие данные получены S. Dholariya с соавт. при анализе распределения генотипов в индийской популяции. Авторами установлено, что носительство генотипа Pro/Pro полиморфного маркера Arg72Pro связано с повышенным риском развития РЯ (ОШ = 4.40, 95% ДИ = 1.40–13.99) [13].

При изучении полиморфного маркера T(‒410)G гена MDM2 связи с риском развития РЯ как для аллелей, так и для генотипов маркера нами не выявлено. При анализе литературы не обнаружено подобных работ, посвященных исследованию связи маркера T(–410)G гена MDM2 с риском развития РЯ. Однако L.B. Gansmo с соавт. показали отсутствие связи с риском развития данного вида опухоли для другого полиморфного маркера del1518 (rs3730485) гена MDM2 [14]. В ходе работы установлено, что носительство минорного аллеля Arg маркера гена CDKN1A не связано с повышением риска развития РЯ. В научной литературе отсутствуют работы по исследованию связи маркера Ser31Arg гена CDKN1A с развитием данного заболевания.

Таким образом, в настоящей работе выявлено, что носительство минорных аллелей генов контроля клеточного цикла TP53, MDM2, CDKN1A не связано с риском развития РЯ у жительниц Московского региона. Понимание патогенеза онкологических заболеваний важно не только с фундаментальной, но и с клинической точки зрения, оно может позволить выявлять новые мишени и возможности для терапии. Связь функционально значимых полиморфных маркеров генов с риском развития определенного вида рака показывает, насколько важен данный ген для патогенеза этого заболевания. В случае отсутствия связи, полученные результаты не менее важны, так как позволяют сфокусировать исследования на более перспективных вариантах.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.