Генетика, 2023, T. 59, № 2, стр. 157-169

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы образцы тканей от 43 эворонских полевок, отловленных в трех популяциях: Эвороно-Чукчагирская низменность (n = 12), Верхнебуреинская впадина (n = 17) и Верхнезейская равнина (n = 14) (табл. 1). Часть из этих полевок ранее были кариотипированы [15, 16]. Образцы хранятся в УНУ “Биоресурсная коллекция ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН” (г. Владивосток). Также в анализ включены пять нуклеотидных последовательностей контрольного региона мтДНК эворонской полевки из Эвороно-Чукчагирской низменности, полученных нами ранее [8] и помещенных в GenBank (NCBI) под номерами HM135858–HM135862.

Выделение ДНК осуществляли методом солевой экстракции [21] из фиксированных в спирте тканей мышц. Подробная методика по приготовлению реакционной смеси, схема ПЦР-реакции для получения фрагмента и подготовки проб к секвенированию были описаны ранее [22]. Нуклеотидную последовательность прочитывали на автоматическом секвенаторе ABI Prizm 3130 на базе центра коллективного пользования “Биотехнология и генетическая инженерия” ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН (г. Владивосток). Редактирование и выравнивание полученных последовательностей проводили с использованием программы BioEdit 7.0.9.0 [23]. Построение филогенетических деревьев выполнено в программе MEGA X [24] методом максимального правдоподобия (Maximum Likelihood), достоверность кластеризации оценивали с помощью бутстрэп-анализа (1000 повторностей). Анализ максимального правдоподобия проводили с использованием эволюционной модели Тамура–Нея93 (TN93) [28] со значением эволюционной нейтральности сайтов (+I) равного 0.87 и максимальным логарифмом правдоподобия – 1970.162. Выбор эволюционной модели ML-анализа определяли по результатам модель-теста в программе MEGA X [24], по которым для модели TN93+I были получены минимальные значения байесового информационного критерия (BIC = 5001.735). Сети гаплотипов построены при помощи программы Network 10.0.0.0 с использованием метода “median joining” [25]. Показатели генетического разнообразия и дифференциации популяций рассчитаны с помощью DnaSP 6.00 [26]. Расчет статистик нейтральности (Tajima’s D и Fu’s Fs), анализ демографической и пространственной экспансии проводили в программе Arlequin 3.5 [27].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для всех 43 новых образцов эворонской полевки из трех популяций были получены последовательности контрольного региона мтДНК длиной 952 пн, все они внесены в GenBank (NCBI) под номерами OM966944–OM966984. Уровень изменчивости митохондриальных фрагментов контрольного региона эворонской полевки (число нуклеотидных замен) был достаточно высоким, число нуклеотидных различий между отдельными гаплотипами варьировало от 0 до 28 (0.0 до 2.9%) (табл. 2) и в среднем было равно 14.42. Частоты нуклеотидов составляли A = 29.17%, T = 32.72%, C = 25.55% и G = 12.56%. Все нуклеотидные последовательности вида (48 экз.) содержали 76 вариабельных сайтов (включая пять делеций), среди которых 48 были парсимониально информативны. Частота транзиций составила 0.0659, а трансверсий – 0.0095. В целом для вида обнаружено 38 гаплотипов, из них пять были описаны ранее [8]. Из обнаруженных гаплотипов один был встречен у шести особей, один – у трех, три – у двух, остальные 33 гаплотипа (86.84%) были уникальными (встречены только у одной особи). Гаплотипическое разнообразие для вида в целом было – 0.97 ± 0.014, а нуклеотидное – 0.0153 ± 0.0005.

В выборке эворонской полевки из Эвороно-Чукчагирской низменности нуклеотидные последовательности содержали 43 вариабельных сайта, среди которых 16 были парсимониально информативны (табл. 3). Для этой выборки характерны самые высокие показатели как гаплотипического (100%), так и нуклеотидного (1.1%) разнообразия, обнаруженные в пределах данного вида. Все отловленные в этой низменности особи имели уникальные гаплотипы, различающиеся 1–21 нуклеотидной заменой. Среднее число попарных нуклеотидных различий между гаплотипами внутри выборки составило 10.26.

Генетическое разнообразие выборки из Верхнезейской равнины было ниже, чем для Эвороно-Чукчагирской низменности. Гаплотипическое разнообразие составило здесь 97.8%, а нуклеотидное – 0.86% (табл. 3). В выборке было обнаружено 12 гаплотипов, только два из которых были встречены у двух особей. В целом нуклеотидные последовательности этой выборки имели минимальное число вариабельных (24) и парсимониально информативных (16) сайтов. Минимальное среднее число попарных нуклеотидных различий равно 8.41, при этом число нуклеотидных различий между отдельными гаплотипами варьировало от 1 до 14.

Самые низкие значения гаплотипического (86%) и нуклеотидного (0.68%) разнообразия были отмечены в выборке Верхнебуреинской впадины (табл. 3). Так же для этой выборки характерно минимальное число парсимониально информативных (10) сайтов. При этом общее число вариабельных сайтов было 25. Всего для выборки Верхнебуреинской впадины обнаружено 9 гаплотипов на 17 особей. Треть этих гаплотипов была обнаружена больше чем у одной особи. Отдельные гаплотипы отличались друг от друга 1–19 нуклеотидной заменой, при этом среднее число попарных нуклеотидных различий между гаплотипами внутри выборки было не намного выше, чем в выборке Верхнезейской равнины, и составило 8.68.

Значения D Tajima для всех популяций эворонской полевки были незначимыми, но только для Верхнебуреинской впадины и Эвороно-Чукчагирской низменности они были отрицательными. Результаты теста Фу (Fu’s Fs) на селективную нейтральность для всех популяций были не только отрицательными, но и высоко достоверно отличались от нуля, что может указывать на рост численности в прошлом (табл. 3).

Распределение попарных нуклеотидных различий между гаплотипами особей во всех популяциях было полимодальным (рис. 1). При этом максимальная частота для сравнений внутри популяций Эвороно-Чукчагирской низменности и Верхнезейской равнины располагается в области 9–10 (значения парных различий), а внутри популяции Верхнебуреинской впадины – в области 16–18.

Рис. 1.

Частота (ось ординат) попарных нуклеотидных различий (ось абсцисс) в трех популяциях эворонской полевки. Наблюдаемая частота обозначена сплошной линией, ожидаемое распределение – пунктирной линией.

Невысокие значения условного времени τ, а также низкие и статистически недостоверные значения суммы отклонений SSD свидетельствуют в пользу гипотезы роста численности с последующей пространственной экспансией для всех исследуемых популяций в недавнем прошлом приблизительно в одно и то же время (табл. 3).

ML-анализ нуклеотидных последовательностей позволил построить дендрограмму и объединить последовательности в группы, характеризующие близкие гаплотипы эворонской полевки (рис. 2,а). На дендрограмме можно выделить клады, которые соответствуют трем популяциям: Эвороно-Чукчагирской низменности (Evoron), Верхнебуреинской впадины (Urgal) и Верхнезейской равнины (Argi). Исключением является гаплотип одной особи из популяции Urgal (106-19U). Этот гаплотип на дендрограмме имеет базальное расположение в единой для гаплотипов популяции Urgal и Argi кладе. С целью проведения более точной кластеризации гаплотипов эворонской полевки была построена медианная сеть (рис. 1). В целом сеть подтверждает данные, полученные при ML-анализе, показывая разделение всех гаплотипов на три группы согласно их географической приуроченности. Общих гаплотипов для двух и более популяций не обнаружено. Добавление в гаплотипическую сеть в качестве внешней группы гаплотипов характерных для полевки Максимовича позволило выявить, что гаплотип 106-19 имеет базальное расположение не только внутри единой клады “Urgal” и “Argi”, но и для вида в целом. Следует сказать, что ранее при проведении кариологического анализа у данной особи (№ 4554) была обнаружена неидентифицированная перестройка [16].

Рис. 2.

ML-дендрограмма (а) и филогенетическая сеть гаплотипов мтДНК (б) эворонской полевки из трех популяций. Размеры кружков пропорциональны количеству образцов с данным гаплотипом. Образцы обозначены в соответствии с табл. 1. Цифры на ветвях сети соответствуют числу нуклеотидных замен больше 2.

Средний коэффициент генной дифференциации (G_ST) для выборок всех популяций составил 0.0635, что указывает на то, что только 6.35% генетической изменчивости приходится на вариацию между популяциями (табл. 4). Значение Nm (потока генов) при этом составило 3.69, что указывает на высокий уровень потока генов и низкую или среднюю генетическую дифференциацию между популяциями. Стандартный тест на гомогенность при попарном сравнении выборок из разных популяций выявил достоверный (p < 0.05) уровень подразделенности только внутри пар Urgal–Argi (χ² = 31.00, P = 0.040) и Urgal–Evoron (χ² = 34.00, P = 0.049) (табл. 4). При этом значение коэффициента G_ST для этих пар выборок было одинаковым и составило 0.048 и 0.052 соответственно. А значение Nm при этом не превышало 4.94. Стандартный тест на гомогенность при попарном сравнении выборок из популяций Эвороно-Чукчагирской низменности (Evoron) и Верхнезейской равнины (Argi) не выявил достоверный уровень подразделенности (χ² = 31.00, P = 0.154). При этом только 2.34% генетической изменчивости приходится на вариацию между популяциями, а поток генов был в два раза выше (Nm = 10.41). При этом следует отметить, что популяция Верхнезейской равнины географически удалена от популяций Эвороно-Чукчагирской низменности больше чем популяции Верхнебуреинской впадины (табл. 4).

В результате анализа контрольного региона митохондриальной ДНК для эворонской полевки было показано высокое генетическое разнообразие для вида (гаплотипическое разнообразие равно 97%, нуклеотидное – 1.53%), несмотря на его небольшой ареал. В целом эти показатели оказались значительно выше, чем аналогичные для муйской полевки (92 и 1.2%) [29], и сопоставимы с генетическим разнообразием для таких широкоареальных видов рода как полевка Максимовича (99 и 1.41%) [22] и дальневосточная полевка (94 и 1.63%) [30]. Полученные нами данные свидетельствуют о низком уровне генетической дифференциации трех популяций. Самый большой поток генов обнаружен между популяциями полевок Эвороно-Чукчагирской низменности и Верхнезейской равнины, которые относятся к двум разным хромосомным расам – “эворон” и “арги” соответственно. Проведенный нами анализ показал, что географически удаленные популяции имеют больше сходства (табл. 4). Две популяции эворонской полевки, относящиеся к одной хромосомной расе “арги”, на филогенетических реконструкциях – сестринские. Наибольшим генетическим разнообразием отличались полевки, отловленные в Эвороно-Чукчагирской низменности, относящиеся к хромосомной расе “эворон”. Самые низкие показатели генетического разнообразия выявлены для особей из Верхнебуреинской впадины, относящиеся к хромосомной расе “арги”, при этом именно в этой популяции обнаружен гаплотип 106-19, который имеет базальное расположение на филогенетических реконструкциях и может считаться наиболее древним для вида.

Согласно данным хромосомного анализа можно считать, что в популяции Эвороно-Чукчагирской низменности сохранились наиболее древние варианты кариотипа (с наибольшим числом акроцентрических пар хромосом – 26 и 2n = 41), поскольку анцестральный для этого вида кариотип имел 2n = 42 [16]. Кроме того, учитывая, что показатели генетического разнообразия выше в центральных популяциях вида, можно было бы считать популяцию Эвороно-Чукчагирской низменности исходной для вида. Однако обнаружение наиболее древнего гаплотипа (106-19) в популяции Верхнебуреинской впадины ставит это предположение под сомнение и нуждается в дальнейшем детальном исследовании.

Работа выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ 15-04-03871, в рамках Государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема № 121031500274-4 “Эволюционные аспекты формирования наземной биоты востока Азии”).

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.