Генетика, 2023, T. 59, № 2, стр. 184-195

Кариологический анализ

Изучены кариотипы восьми самок, трех самцов Myoxocephalus quadricornis. Хромосомные препараты приготовлены из суспензии клеток переднего отдела почки рыб методом воздушного высушивания [19]. Для первичного анализа кариотипа хромосомы окрашивали 4%-ным раствором красителя Гимза (Giemsa). После просмотра под микроскопом и съемки лучших метафазных пластинок препараты отмывали в 70%-ном этиловом спирте. Затем для выявления активных ЯО на тех же препаратах проводили Ag-окрашивание [20].

Использовали общепринятую в цитогенетических исследованиях классификацию хромосом [21]. Равноплечие метацентрические (М) и неравноплечие субметацентрические (СМ) хромосомы относили к двуплечим, субтелоцентрические (СТ) с очень коротким вторым плечом и акроцентрические (А) с невидимым вторым плечом – к одноплечим хромосомам.

Для сравнительного анализа привлечены данные о кариотипах шести видов рода Myoxocephalus и Megalocottus platycephalus (северной Megalocottus platycephalus platycephalus (Pallas, 1814) и южной M. p. taeniopterus (Kner, 1868) дальневосточных широколобок) [22–25]. Хромосомные наборы Megalocottus p. platycephalus и M. p. taeniopterus сходны (2n = 42, NF = 44 + 2). В кариотипах изученных видов пара хромосом с изменчивой морфологией обозначена как субмета-субтелоцентрик (СМ-СТ) [16].

Молекулярно-генетический анализ

Проведен анализ изменчивости нуклеотидных последовательностей генов COI, цитохрома b и 16S рРНК мтДНК Myoxocephalus quadricornis и видов трибы Myoxocephalini. Четыре вида семейства Cottidae из подсемейств Myoxocephalinae (Microcottus sellaris (Gilbert, 1895), Porocottus minutus (Pallas, 1814), Argyrocottus zanderi (Herzenstein, 1892)) и Pseudoblenniinae (Alcichthys elongatus Steindachner, 1881) использованы как внешняя группа. Геномная ДНК выделена из мышечной ткани по стандартной методике, включающей лизис ткани 1% SDS в присутствии протеиназы К (0.2 мг/мл) и депротеинизацию фенолом [26]. Условия амплификации и секвенирования ДНК, последовательности олигонуклеотидных праймеров использованы из предшествующей работы: COI – F-33 и R-1421; цитохром b – L14795 и H15844; 16S рРНК – L2510 и H3080 [27]. Секвенирование ДНК выполнено на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) в лаборатории генетики Института биологических проблем Севера ДВО РАН, Магадан, Россия.

Попарные генетические дистанции рассчитаны для объединенных последовательностей генов COI, цитохрома b, 16S рРНК мтДНК в программе MEGA Х методом максимального правдоподобия (ML) с учетом гетерогенности скорости нуклеотидных замен (гамма-распределение G). Оптимальные модели нуклеотидных замен выбраны с использованием информационного критерия BIC (Bayesian Information Criterion) в программе M-EGA Х. Филогенетический анализ выполнен методом байесовского анализа в программе MrBayes v3.2.1 [28]. Для контроля динамики байесовского анализа использована программа Tracer v1.7 [29]. Установки для анализа МСМС были следующие: четыре цепи, 1 000 000 генераций и отбор деревьев через каждые 100 генераций. Значения вероятности достигли плато в течение 12 000–15 000 генераций. Значения логарифмической вероятности увеличились с менее чем –6976.890 до примерно ‒3843.392 в первых 5000 генераций, затем примерно до –3787.602 после 500 000 генераций. Из 10 001 дерева первые 1001 с нестабильными параметрами моделей нуклеотидных замен были отброшены, а остальные использовались для получения консенсусных деревьев и апостериорных вероятностей их ветвления. Узлы ветвления с оценками вероятности ≥95% приняты как достоверные [30].

Кариологический анализ

Описание кариотипа Myoxocephalus quadricornis составлено по результатам анализа 300 рутинно окрашенных метафазных пластинок. Кариотип состоит из 32 хромосом (2n), число хромосомных плеч (NF) – 44 (рис. 1 ). Двуплечие хромосомы представлены парой крупных метацентриков (пара 1). Следующие три пары метацентриков (пары 2, 3, 4) – среднего размера. Метацентрики пятой пары среди двуплечих хромосом (пары 1–6) имеют самые мелкие размеры. Субметацентрики вида (пара 6) соответствуют по размерам его крупным метацентрикам (пара 1). Ряд одноплечих хромосом состоит из пары крупных субтелоцентриков (пара 7), короткие плечи которых, независимо от степени их спирализации, всегда хорошо выражены. Размеры этих субтелоцентриков сходны с размерами крупных метацентриков и субметацентриков (пары 1, 6) вида. У остальных девяти пар субтелоцентриков (пары 8–16), в разных метафазных пластинках, короткие плечи могут быть выражены в разной степени, но достаточной для того чтобы выделить их в отдельный, плавно уменьшающийся по размерам ряд. Пять пар метацентриков, пара крупных субметацентриков и пара крупных субтелоцентриков хорошо идентифицируются во всех исследованных метафазных пластинках и рассматриваются нами как маркерные в кариотипе M. quadricornis. Изменчивость по числу хромосом не обнаружена, различий по 2n и NF между кариотипами самцов и самок не выявлено.

Установлены общие признаки кариотипов M. quadricornis и изученных видов трибы Myoxocephalini. Четырехрогий керчак имеет одинаковое число хромосомных плеч (44) с M. jaok (Cuvier, 1829) и M. scorpius (Linnaeus, 1758) (рис. 1; рис. 2 ,а, б). У M. quadricornis так же, как у Megalocottus p. taeniopterus, при рутинном окрашивании наблюдается вариабельность размера короткого плеча одного из гомологов пары субтелоцентриков (рис. 1: пара 9; рис. 3 ,а: пара 5). В кариотипах видов можно выделить сходные по морфологии и размерам маркерные хромосомы.

Рис. 1.

Метафазная пластинка и кариограмма M. quadricornis – 2n = 32, NF = 44. Цифры (здесь и на рис. 2, 3) – порядковые номера пар хромосом в кариограмме. Хромосома изменчивой морфологии подчеркнута. Масштабная линейка: 10 мм.

Крупные метацентрики (рис. 1: пара 1) M. quadricornis соответствуют крупным метацентрикам M. jaok (рис. 2,а: пара 1); вторая и третья пары метацентриков четырехрогого керчака (рис. 1) – второй паре метацентриков у M. jaok (рис. 2,а); метацентрики 4-й пары (рис. 1) вида – метацентрикам M. jaok (рис. 2,а: пара 3), M. scorpius (рис. 2,б: пара 1), M. stelleri Tilesius, 1811 (рис. 2,в: пара 1) и M. polyacanthocephalus (Pallas, 1814) (рис. 2,г: пара 1). Мелкие метацентрики M. quadricornis (рис. 1: пара 5) сходны с таковыми у M. jaok (рис. 2,а: пара 8), M. polyacanthocephalus (рис. 2,г: пара 2), M. ochotensis Schmidt, 1929 (рис. 2,е: пара 1) и Megalocottus platycephalus (рис. 3,а: пара 1). Субметацентрики рогатки (рис. 1: пара 6) соответствуют по размеру субметацентрикам M. jaok (рис. 2,а: пары 9, 10), M. scorpius (рис. 2,б: пара 2) и M. stelleri (рис. 2,в: пара 2).

Рис. 2.

Слева: кариограмма Myoxocephalus jaok – 2n = 24, NF = 44 (a) и фрагменты кариограмм M. scorpius – 2n = 36, NF = 44 (б, по: Васильев, 1985, с изменениями), M. stelleri – 2n = 40, NF = 44 + 2 (в), M. polyacanthocephalus – 2n = 40, NF = 44 + 2 (г), M. brandtii – 2n = 44, NF = 46 + 2 (д), M. ochotensis – 2n = 42, NF = 44 + 2 (е) и M. stelleri – 2n = 44, NF = = 44 + 2 (ж); справа: ЯО-хромосомы видов (по: Морева, Борисенко, 2017). Прочерк – СТ и А хромосомы среднего и мелкого размера пропущены. Масштабная линейка: 10 мм.

Рис. 3.

Кариограмма – 2n = 42, NF = 44 + 2 (а) и фрагменты кариограмм с ЯО-хромосомами с одинарными и двойными блоками ЯО у M. platycephalus taeniopterus (б); с одинарными, двойными и тройными блоками ЯО у Megalocottus p. platycephalus (в) (по: Морева, Борисенко, 2015, с изменениями). ЯО-хромосомы подчеркнуты. Масштабная линейка: 10 мм.

С помощью Ag-окрашивания проанализированы 210 метафазных пластинок вида. Активные ЯО локализованы в теломерных районах коротких плеч гомологичных субтелоцентриков средних размеров (рис. 4 ). В метафазных пластинках наблюдалась изменчивость в виде разного числа (одна или две) ядрышкообразующих хромосом (ЯО-хромосом) и по числу окрашиваемых блоков ЯО в хромосоме (рис. 4). В 45% метафазных пластинок окрашивались одинарные, в 40% – двойные и в 15% – тройные блоки ЯО. Число окрашиваемых ядрышек в интерфазных ядрах – одно или два.

Рис. 4.

Справа: метафазные пластинки M. quadricornis – рутинное окрашивание, слева: те же метафазные пластинки – Ag-окрашивание. ЯО-хромосомы с одинарными (а), двойными (б) и тройными (в) блоками ЯО указаны стрелками. Масштабная линейка: 10 мм.

Молекулярно-генетический анализ

Нуклеотидные последовательности участков генов COI, цитохрома b и 16S рРНК размещены в GenBank/NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), их регистрационные номера указаны в табл. 1. Обнаружены следующие показатели генетической изменчивости видов трибы Myoxocephalini. Для гена COI (1008 пар нуклеотидов, пн) идентифицировано 154 нуклеотидные замены и 149 полиморфных сайтов, 94 (9.3%) из которых филогенетически информативные. Из 336 кодируемых аминокислотных остатков вариабельных нет. Для гена цитохрома b (747 пн) идентифицировано 142 нуклеотидные замены и 131 полиморфный сайт, 90 (12.1%) из которых филогенетически информативные. Из 249 кодируемых аминокислотных остатков пять вариабельных. Для гена 16S рРНК (600 пн) идентифицировано 15 нуклеотидных замен и 12 полиморфных сайтов, 11 (1.8%) из которых филогенетически информативные.

Показатели генетической изменчивости M. quadricornis следующие. Для гена COI идентифицировано 11 нуклеотидных замен и 11 полиморфных сайтов, шесть (0.6%) из которых филогенетически информативные. Для гена цитохрома b идентифицировано 16 нуклеотидных замен и 16 полиморфных сайтов, 10 (1.4%) из которых филогенетически информативные; из 249 кодируемых аминокислотных остатков четыре вариабельных. Для гена 16S рРНК идентифицировано три нуклеотидные замены и три полиморфных сайта, два (0.3%) из которых филогенетически информативные. У рогатки обнаружено восемь гаплотипов.

Во всех исследованных генах обнаружены мутации, маркирующие вид M. quadricornis и отличающие его от видов рода Myoxocephalus: 40, 30 и 4 замены нуклеотидов для генов COI, цитохрома b и 16S рРНК. В соответствии с данными табл. 2 значения ML-дистанций между мтДНК M. quadricornis и внешней группы варьируют от 7.06% (M. quadricornis/Microcottus sellaris) до 12.7% (M. quadricornis/Alcichthys elongatus). Между M. quadricornis и видами рода Myoxocephalus минимальное значение составило 6.93% (с M. stelleri, M. polyacanthocephalus и M. ochotensis), максимальное – 7.54% (с M. brandtii). Генетические дистанции между M. quadricornis и Megalocottus platycephalus варьируют от 2.75 до 2.88%. Среднее значение ML-дистанций в пределах M. quadricornis составило 0.45%.

По данным об объединенных последовательностях мтДНК реконструировано байесовское филогенетическое дерево (рис. 5 ). В основании находятся ДНК видов внешней группы, исключая Microcottus sellaris. Триба Myoxocephalini разделяется на кластер видов Myoxocephalus и кластер M. quadricornis вместе с Megalocottus platycephalus. К последнему кластеру присоединяется Microcottus sellaris. Оценки апостериорной вероятности (РР ≥ 0.95) подтверждают достоверность ассоциаций типов ДНК.

Дифференциация бычков по основным признакам кариотипов

На основе проведенных исследований установлено, что M. quadricornis по 2n отличается от всех изученных видов Myoxocephalus (рис. 2) и Megalocottus platycephalus (рис. 3,a). Обнаруженное отличие может являться следствием разного числа робертсоновских транслокаций, произошедших в процессе эволюции хромосомных наборов бычков. Изучение рыб подсемейства Myoxocephalinae показало, что робертсоновские транслокации – это основной механизм эволюционного изменения кариотипов не только видов трибы Myoxocephalini, но и представителей триб Microcottini Neelov и Enophryini Taranetz [22, 35].

В кариотипах бычков рода Myoxocephalus (кроме M. jaok, M. scorpius) и Megalocottus platycephalus есть пара мелких субмета-субтелоцентриков (рис 2,в, г: пара 3,д, е: пара 2,ж: пара 1; рис. 3,а: пара 2). В разных клетках бычков в зависимости от длины коротких плеч они могут выглядеть как двуплечие или как одноплечие хромосомы, поэтому в NF указаны два дополнительных хромосомных плеча: 46 + 2 и 44 + 2 [16]. M. jaok резко отличается от всех видов рода Myoxocephalus. Его кариотип преимущественно представлен двуплечими хромосомами (рис. 2,а). При этом уровень дифференциации мтДНК M. jaok и остальных видов соответствует межвидовым различиям в этом роде [16]. У M. scorpius выделить субмета-субтелоцентрики не представляется возможным из-за сильной спирализации хромосом в представленной автором кариограмме [22]. У M. quadricornis эта пара хромосом отсутствует. Большинство хромосом в метафазных пластинках вида хорошо идентифицируется. Исключением является один из гомологов пары субтелоцентриков (рис. 1: пара 9). В исследованных метафазных пластинках (55%) M. quadricornis эта хромосома имеет второе плечо бóльшего размера, чем у субтелоцентриков.

В отличие от большинства видов рода Myoxocephalus и Megalocottus platycephalus (рис. 2,б: пары 5, 6,в, г: пары 4, 5, д, е: пары 3, 4, ж: пары 2, 3; рис. 3,а: пары 3, 4), M. quadricornis имеет только одну пару крупных субтелоцентриков (рис. 1: пара 7). Возможно, причиной отсутствия у него второй пары маркерных хромосом этой морфологии является вовлечение их в робертсоновскую транслокацию. Размеры маркерных субтелоцентриков рогатки крупнее размеров маркерных субтелоцентриков видов рода Myoxocephalus и Megalocottus platycephalus. В отличие от четырехрогого керчака у M. stelleri, M. polyacanthocephalus, M. brandtii и Megalocottus platycephalus можно выделить еще одну пару крупных одноплечих хромосом (рис. 2,в, г: пара 6, д: пара 12,ж: пара 4; рис. 3,а: пара 18) маркерную для этих видов. У M. quadricornis остальные субтелоцентрические хромосомы – среднего и мелкого размера. В хромосомном наборе M. quadricornis отсутствуют акроцентрики, имеющиеся в кариотипах всех изученных видов Myoxocephalus и Megalocottus.

Дифференциация кариотипов бычков по числу и локализации активных ЯО

В кариотипах большинства исследованных видов рода Myoxocephalus активные ЯО расположены в двух и более парах хромосом (рис. 2,в, д, е, ж). В отличие от них у M. quadricornis ЯО имеются лишь в одной паре субтелоцентриков. ЯО в субтелоцентриках средних размеров, как один из вариантов локализации, встречается в кариотипах M. ochotensis и M. stelleri (при 2n = 44). Однако ЯО-хромосомы M. stelleri (рис. 2,ж: пара 8) мельче, чем у M. quadricornis. Четырехрогий керчак и M. ochotensis различаются по локализации ЯО (рис. 2,е: пара 5; рис. 4). У M. jaok и у M. polyacanthocephalus так же, как и у M. quadricornis, ЯО расположены в одной паре хромосом, но у всех трех видов морфология ЯО-хромосом различна (рис. 2,a: пара 9,г: пара 2; рис. 4).

Несмотря на сходство хромосомных наборов Megalocottus platycephalus platycephalus и M. p. taeniopterus, они хорошо дифференцируются по числу и локализации активных ЯО (рис. 3). M. quadricornis отличается от Megalocottus p. taeniopterus по числу ЯО (рис. 3,б: пары 5, 18). Размеры ЯО-хромосом четырехрогого керчака (рис. 1: пара 9) и субтелоцентрических ЯО-хромосом Megalocottus p. taeniopterus (рис. 3,а: пара 5) сходны. У Megalocottus p. platycephalus так же, как и у M. quadricornis, ЯО локализованы в одной паре хромосом. Однако у северной дальневосточной широколобки ЯО окрашиваются в крупных субтелоцентриках (рис. 3,в: пара 3). У четырехрогого керчака, северной и южной дальневосточных широколобок наблюдается изменчивость морфологии ЯО-хромосом. У M. quadricornis и Megalocottus p. platycephalus ЯО выявляются в виде одинарных, двойных и тройных хорошо различимых блоков; у Megalocottus p. taeniopterus – в виде одинарных и двойных блоков. В зависимости от числа блоков ЯО длина коротких плеч заметно изменяется, а хромосомы могут выглядеть (как при рутинном, так и при Ag-окрашивании) у Megalocottus p. taeniopterus как субтело-, субметацентрики (рис. 3,б), у Megalocottus p. platycephalus и M. quadricornis как субтело-, субмета- или даже метацентрики, (рис. 3,в; рис. 4). Идентификация данных пар хромосом у бычков возможна только после Ag-окрашивания.

Генетическая дифференциация Myoxocephalus quadricornis

Единое мнение о статусе вида M. quadricornis отсутствует. Его относят к роду Triglopsis [1, 36, 37], рассматривают в составе рода Myoxocephalus [2, 3], объединяют с M. thompsonii в комплекс видов или разделяют на подвиды M. quadricornis quadricornis и M. q. thompsonii [9, 38, 39].

Сравнительный кариологический анализ показал, что, несмотря на наличие общих признаков, M. quadricornis значительно отличается от видов рода Myoxocephalus по числу и морфологии хромосом, от большинства видов этого рода по числу хромосомных плеч. Самые значительные различия между ними заключаются в числе и локализации активных ЯО. Полученные данные полностью согласуются с результатами молекулярно-генетического исследования этих рыб. В предшествующей работе был проведен молекулярно-генетический анализ рода Myoxocephalus, в котором использовано два экземпляра четырехрогого керчака из восточной части Арктики – Восточно-Сибирского моря [16]. В настоящей работе расширение выборки до девяти экземпляров и привлечение M. quadricornis из западной части Арктики (Белое море) подтвердило ранее полученные данные о значительных генетических отличиях M. quadricornis от остальных видов рода Myoxocephalus.

Значения ML-дистанций между видами рода Myoxocephalus варьируют в широких пределах – от 1.53 до 7.54% (табл. 2). Большой вклад в столь высокий уровень генетической дифференциации внутри рода вносят отличия мтДНК M. quadricornis, величина которых составляет в среднем 7.13%. Такая оценка соответствует различиям между видами близкородственных родов подсемейства Myoxocephalinae, но никак не различиям между видами одного рода. Например, ML-дистанции между Microcottus sellaris и M. quadricornis, которые принадлежат к близким родам, составляют 7.06–7.37%. Напротив, дистанции между M. scorpius и остальными видами рода Myoxocephalus, исключая M. quadricornis, составляют 3.36–3.97%, что в среднем в 2 раза ниже дистанций между видами разных родов.

На филогенетическом дереве (рис. 5) кластер мтДНК M. quadricornis располагается отдельно от кластера видов рода Myoxocephalus. Он образует общую группу с видами из других родов подсемейства Myoxocephalinae. При этом M. quadricornis наиболее близок с Megalocottus platycephalus. Генетические дистанции между ними соответствуют различиям между видами одного рода (среднее значение 2.8%). Достоверность положения M. quadricornis, обособленного от рода Myoxocephalus и ассоциированного с видами других родов, подтверждается высокими оценками вероятности. Большее сходство четырехрогого керчака с Megalocottus platycephalus, чем с видами рода Myoxocephalus, обнаружено в результате сравнительного кариологического анализа. Их общие признаки: пара мелких метацентриков; одиночные ЯО-хромосомы сходной морфологии (c Megalocottus p. platycephalus); локализация у M. quadricornis и Megalocottus p. taeniopterus ЯО в субтелоцентриках сходных размеров; изменчивость числа блоков ЯО.

Рис. 5.

Байесовское дерево видов трибы Myoxocephalini по данным об объединенных последовательностях генов COI, цитохрома b и 16S рРНК митохондриального генома. Числа в основаниях кластеров – оценки апостериорной вероятности. Ваучерные номера показаны в скобках.

Сравнительный анализ полученных молекулярно-генетических данных и результатов аналогичных исследований показывает определенное сходство положения M. quadricornis. В работе Kontula, Väinöla (2003) комплекс M. quadricornis находится внутри клады рода Myoxocephalus [9]. По мнению авторов, признание валидности рода Triglopsis сделало бы остальных Myoxocephalus парафилетической группой. Исследование Knope (2013) показало, что Triglopsis quadricornis и Megalocottus platycephalus объединяются в общую кладу [37]. Вместе с Myoxocephalus scorpioides и Microcottus sellaris они образуют отдельную группу, родственную с видами Myoxocephalus. Mecklenburg с соавт. (2016) определяют M. quadricornis и Megalocottus platycephalus как сестринские виды, находящиеся в кладе рода Myoxocephalus [3]. Генетические дистанции между M. quadricornis и видами Myoxocephalus (5.1–9.2%) совпадают с различиями в пределах рода Myoxocephalus (2.1–10.5%), что, по мнению авторов, не подтверждает существования рода Triglopsis. Однако авторы не обсуждают загадочное положение одного рода в кладе другого и не проводят сравнительный анализ дистанций между близкими родами семейства Cottidae. Все приведенные выше молекулярно-генетические результаты определенно свидетельствуют о близком родстве M. quadricornis с Megalocottus platycephalus, но не с видами рода Myoxocephalus, и следовательно о необходимости пересмотра таксономического статуса четырехрогого керчака.

Таким образом, сравнительный кариологический анализ M. quadricornis показал, что хромосомные наборы этого вида и керчаков трибы Myoxocephalini имеют общие признаки, доказывающие их родство. Наибольшее число общих признаков кариотипов обнаружено у M. quadricornis и Megalocottus platycephalus, что подтверждает их более значительную близость по сравнению с видами рода Myoxocephalus. Выявлен комплекс кариологических и молекулярно-генетических маркерных признаков, позволяющих проводить идентификацию вида M. quadricornis. Обнаруженные существенные различия позволяют надежно дифференцировать M. quadricornis и виды трибы Myoxocephalini. Они доказывают принадлежность M. quadricornis и видов рода Myoxocephalus к разным филогенетическим линиям. Результаты кариологического и молекулярно-генетического исследования соответствуют данным сравнительного анализа сейсмосенсорной системы и морфологических признаков, на основании которых была обоснована родовая самостоятельность четырехрогого керчака, целесообразность его выделения из рода Myoxocephalus и включения, согласно правилу приоритета, в отдельный род Triglopsis [1].

Работа выполнена при бюджетной поддержке в рамках НИР “Фауна, систематика и экология морских и пресноводных гидробионтов Северо-Востока России” (Гос. Российская Федерация, № 0290-2019-0004), Институт биологических проблем Севера ДВО РАН, Россия.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют о том, что у них нет конфликта интересов.