Генетика, 2023, T. 59, № 3, стр. 356-366

Образцы биологического материала и выделение ДНК

Образцы венозной крови отбирали у анонимных доноров после получения письменного информированного согласия на проведение исследования и опубликование его результатов в открытой печати с соблюдением полной конфиденциальности полученной от участников информации. Всего исследовано 733 неродственных индивида мужского пола, проживающих в шести регионах страны: юго-запад (Брестская область) – 137; юго-восток (Гомельская область) – 111; запад (Гродненская область) – 122; восток (Могилевская область) – 118; север (Витебская область) – 100 и центральный регион (Минская область) – 145.

Забор венозной крови осуществлялся с помощью систем типа Vacutainer (Becton Dickinson International, США) при участии специалистов Республиканского научно-практического центра трансфузиологии и медицинских биотехнологий. До выделения ДНК все образцы крови хранили при температуре –20°C.

ДНК выделяли из лейкоцитарной фракции венозной крови по методу, описанному в [8], после предварительного этапа гемолиза эритроцитов. Очистку ДНК проводили с помощью органических растворителей [9]. Концентрацию ДНК измеряли на капельном спектрофотометре DeNovix (DeNovix, США) в соответствии с протоколом производителя.

Подготовка геномных библиотек

Подготовку библиотек для секвенирования аутосомных STR-маркеров осуществляли с использованием набора ForenSeq™ DNA Signature Prep Kit (Verogen, США) согласно инструкции производителя [10]. Предварительно измеряли концентрацию образцов ДНК на приборе Quantus^TM Fluorometer (Promega, США). Образцы ДНК нормализовали до конечной концентрации 0.2 нг/мкл. Для первой ПЦР использовали пул праймеров В, предназначенный для совместной амплификации 231 маркера ядерной ДНК, включая 27 аутосомных STR, 24 Y-STR, 7 X-хромосомных STR, 94 идентифицирующих SNP, 56 геногеографических SNP, 22 фенотипических SNP и амелогенин. В качестве положительного контроля реакции амплификации использовали 1 нг контрольной ДНК 2800М (Promega Corporation, США), в качестве отрицательного – деионизированную воду. Амплификацию проводили на термоциклере C1000 Touch™ Thermal Cycler (Bio-Rad, США) согласно инструкции производителя [10]. Целевое обогащение, индексирование, очистку и нормализацию геномных библиотек выполняли следуя протоколу производителя. Готовые нормализованные библиотеки смешивали в одной пробирке, проводили денатурацию и загружали на проточную ячейку MiSeq FGx® Reagents Kit (Verogen). Для всех пулов число библиотек соответствовало рекомендованному производителем числу в 32 библиотеки. Секвенирование проводили в режиме экспертного ДНК-анализа.

Секвенирование и анализ результатов

Секвенирование библиотек проводили на платформе MiSeq FGx^TM (Illumina Inc., США), обработку результатов выполняли с помощью интегрированного в систему программного обеспечения ForenSeq Universal Analysis Software (ForenSeq UAS) (Illumina Inc.). Генотипы образцов по аутосомным STR-маркерам D3S1358, vWA, D16S539, CSF1PO, TPOX, D8S1179, D21S11, D18S51, D2S441, D19S433, TH01, FGA, D22S1045, D5S818, D13S317, D7S820, D10S1248, D1S1656, D12S391, D2S1338, D6S1043, PentaD, PentaE, D4S2408, D9S1122, D17S1301, D20S482 анализировали на основе стандартных выходных данных, включавших отчет о генотипе на уровне проекта и отчет о деталях образца на уровне генотипа, сгенерированных ForenSeq UAS на листах Microsoft Excel. По умолчанию минимальные пороговые значения для анализа (АП) и интерпретации данных (ИП) принимали 10 и 30 прочтений соответственно для всех аутосомных STR-локусов.

Генотипы регистрировали как число тандемных повторов в вариабельной области микросателлита, автоматически зарегистрированное ForenSeq UAS; также анализировали первичную последовательность вариабельной области STR-маркера. Для локусов D12S317, D18S51, D19S433, D5S818, D7S820 и vWA дополнительно изучали нуклеотидную последовательность доступного для анализа небольшого фланкирующего участка, непосредственно прилегающего к тандемной области. Однонуклеотидные варианты полиморфизма, обнаруженные в области тандемного повтора и на доступных для анализа фланкирующих участках микросателлитов, регистрировали как вариант замены по отношению к референсному геному GRCh37.p13 [11]. Последовательности аллельных вариантов описывали согласно требованиям Международного общества по судебной генетике [12]; аллелям присваивали численно-буквенные назначения.

Верификация с данными капиллярного электрофореза

Для верификации полученных МПС-генотипов контрольную ДНК 2800М и 165 образцов ДНК популяционной выборки, отобранных случайным образом, генотипировали с использованием набора PowerPlex® Fusion 6C System (Promega Corporation), который включает 22 общих с ForenSeq™ DNA Signature Prep Kit аутосомных локуса: D3S1358, vWA, D16S539, CSF1PO, TPOX, D8S1179, D21S11, D18S51, D2S441, D19S433, TH01, FGA, D22S1045, D5S818, D13S317, D7S820, D10S1248, D1S1656, D12S391, D2S1338, PentaD, PentaE. Все эксперименты проводили в соответствии с протоколами производителя реагентов. Продукты ПЦР разделяли методом КЭ на генетическом анализаторе АВ3500 (Thermo Fischer Scienific). Генотипы образцов определяли с использованием программного обеспечения GeneMapper ID-X 1.4 (Thermo Fisher Scientific). Результаты генотипирования, полученные методами МПС и КЭ, сравнивали, дискордантность определяли как любой случай, когда аллель, обнаруженный с помощью одного метода, не обнаруживался с помощью другого. В случаях, когда глубина прочтения для одного из аллелей профиля была ниже ИП и аллель не регистрировался программным обеспечением, несоответствие считали обусловленным “выпадением” аллеля (allele drop-out) [13].

Популяционные данные и криминалистические параметры информативности

Изменение уровня генетического разнообразия и криминалистических параметров оценивали сравнивая значения наблюдаемой гетерозиготности (H_О) и вероятности случайного совпадения (MP), рассчитанные для двух массивов МПС-генотипов, включающих: 1) аллели, определенные по числу тандемных повторов (КЭ-аллели) и 2) аллели, определенные по нуклеотидной последовательности (МПС-аллели).

Частоты аллелей для 27 аутосомных STR-локусов и наблюдаемую гетерозиготность (H_О) рассчитывали на основе результатов МПС-генотипирования 733 популяционных образцов средствами программного пакета GenAlEx 6.5 [14].

Криминалистические параметры информационной значимости: силу различения двух генотипов (PD), силу исключения (PE), типичный индекс отцовства (ТРI) и их комбинированные значения рассчитывали с использованием алгоритмов FORSTAT v1.0 [15].

Оценку уровня генетической подразделенности популяции (F_ST) проводили методом анализа молекулярной дисперсии (Analysis of Мolecular Variance, AMOVA) в программном пакете Arlequin 3.5 [16].

Исследование на конкордантность генотипирования

Соответствие между генотипами, установленными капиллярным электрофорезом (КЭ-генотипами) и генотипами, полученными методом МПС (МПС-генотипами), было исследовано для 165 образцов популяционной выборки. Для трех образцов ДНК МПС-генотипы в локусах D1S1656, PentaE и PentaD не регистрировались, эти образцы были исключены из сравнительного анализа. Результаты исследования конкордантности МПС- и КЭ-генотипирования для 162 образцов ДНК представлены в табл. 1.

Дискордантность результатов генотипирования наблюдали в 16 из 3564 сравнений (0.45%), при этом все случаи несоответствия были установлены для пяти локусов: D1S1656, D22S1045, D5S818, D7S820, PentaE. Для локусов D1S1656, D22S1045, PentaE все случаи несовпадения генотипов были связаны с “выпадением” более длинного аллеля гетерозиготного МПС-профиля, в локусе D5S818 во всех случаях выпадал более короткий аллель. При анализе файлов отчетов ForenSeq UAS “выпадающие” аллели обнаруживали, однако уровень прочтений для них был ниже установленного ИП (<30 ридов) (рис. 1,a). Больше всего случаев “выпадения” аллелей зарегистрировано для локуса D1S1656 (7 образцов), при этом в пяти из семи случаев это были аллели вида X.3, включающие тринуклеотид [TCA]. Согласно [17] аллели X.3 в локусе D1S1656 значительно хуже секвенируются по сравнению с аллелями без тринуклеотида, что приводит к высокой несбалансированности гетерозигот вида X/X.3.

Рис. 1.

Результаты генотипирования локусов D1S1656 и D22S1045 методами КЭ (вверху) и МПС (внизу) при исследовании конкордантности. а – локус D1S1656, КЭ-генотип “14/15”, МПС-генотип “14/14”); б – локус D22S1045, КЭ-генотип “14/19”, МПС-генотип “15/15”.

В локусе D22S1045 наблюдали дискордантность КЭ- и МПС-генотипов для четырех образцов: три образца имели гомозиготные МПС-генотипы “15/15” и один – “11/11”, тогда как по данным генотипирования тест-системой PowerPlex® Fusion 6C для этих образцов были установлены гетерозиготные профили “15/19” и “11/15” соответственно (рис. 1,б). Несбалансированная амплификация локуса D22S1045 является известной особенностью тест-системы ForenSeq™, и производитель прямо указывает на необходимость с осторожностью интерпретировать гомозиготные профили по этому маркеру [10].

В локусе D7S820 для одного из образцов был зарегистрирован КЭ-генотип “10/10.3” и МПС-генотип “10/11”. В локусе D5S818 несоответствие генотипов обнаружено в двух образцах (КЭ-аллели: “9/11”, МПС: “11” и КЭ: “12/13”, МПС: “13”) и в обоих случаях для незарегистрированных программным обеспечением аллелей (9 и 12) обнаруживались прочтения ниже ИП (<30 ридов).

Наблюдаемые случаи несовпадения генотипов для локусов D5S818 и D7S820 были аналогичны описанным ранее наблюдениям [13, 18, 19]. Например, L. Devesse et al. [13] для локуса D7S820 наблюдали КЭ-аллель 9.2, состоящий из 10 тетрануклеотидных повторов, и аллель 7, который был генотипирован как 6.3 на основе методов КЭ. Авторами установлено, что в обоих случаях расхождения связаны с делециями во фланкирующей области – двух оснований на фланке аллеля 10 и одного основания на фланке аллеля 7 (редкая делеция rs540346880, [T/–], обнаруженная в европеоидной популяции с частотой менее 0.01%) (рис. 2,а). В этом же исследовании описан случай “выпадения” короткого аллеля в локусе D5S818 (по данным КЭ: “9/11”; по данным МПС: “11”). Путем секвенирования более длинного ампликона L. Devesse et al. [13] удалось обнаружить редкую, не описанную ранее однонуклеотидную замену G>C, расположенную в сайте связывания обратного праймера, которая снижала успешность амплификации короткого аллеля 9 (рис. 2,б).

Рис. 2.

Мутации фланкирующих последовательностей, приводящие к возникновению “нулевых аллелей” при МПС-генотипировании локусов D7S820 и D5D818. Адаптировано из [13]. а – локус D7S820 (rs540346880); б – локус D5S818.

Таким образом, нами показано, что между генетическими профилями 162 образцов, установленными параллельно двумя методами, отсутствуют серьезные несоответствия − конкордантность данных составляет 99.96% (табл. 1). Во всех случаях для незарегистрированных аллелей МПС-профилей имелись прочитанные последовательности, размер которых соответствовал данным КЭ-генотипирования, за исключением одного описанного выше случая для локуса D7S820. Вместе с тем результаты исследования позволяют акцентировать внимание на особенностях интерпретации данных, получаемых методом МПС с использованием коммерческого набора ForenSeq DNA Signature Prep Kit [10]. В частности, исследователи должны с особой осторожностью интерпретировать результаты секвенирования не только для локуса D22S1045, на что указывает производитель набора, но и для локусов D5S818, D1S1656 и D7S820. В соответствии с рекомендациями Национального исследовательского совета США (NRC II Recommendations for Estimating Random-Match Probabilities) [20] чтобы компенсировать эффекты возможных нулевых аллелей в локусах D5S818, D1S1656, D22S1045 при оценке вероятности случайного совпадения генотипов может применяться высококонсервативный подход, при котором частоту (f) для гетерозигот рассчитывают как f = 2pq, а для гомозигот – как f = p вместо f = p². Более точная, но также консервативная процедура расчета заключается в использовании уравнения f = p²+ p(1 − p) × θ со значением θ = 0.003 [20].

Генетическое разнообразие и криминалистическая информативность секвенированных аутосомных STR-локусов

Из 39 534 аллелей, секвенированных у 733 индивидов в 27 локусах, был идентифицирован 301 вариант различной длины и 517 изометрических вариантов (аллелей одинаковой длины, но разной последовательности).

Число аллелей увеличилось более чем в 2 раза (×2) у восьми локусов: D12S391 (×4.24), D21S11 (×3.43), D2S1338 (×3.07), vWA (×2.63), D3S1358 (×2.44), D8S1179 (×2.0), D13S317 (×2.11), D9S1122 (×2.0). Всего из 27 аутосомных STR-локусов изоаллели наблюдались в 19 (70.37%). Для восьми локусов не зафиксировано дополнительных МПС-аллелей (PentaE, PentaD, D20S482, CSF1PO, TPOX, D10S1248, TH01, D16S539) (табл. 2). Полученные в нашем исследовании результаты хорошо согласуются с данными других авторов, полученными при исследовании европейских и азиатских популяций [13, 17–19, 21–24].

Для шести локусов (D19S433, D7S820, D18S51, D5S820, D13S317 и vWA) дополнительно были проанализированы предоставляемые ForenSeq UAS данные о последовательности небольших фланкирующих участков, непосредственно прилегающих к тандемной области. Для двух локусов D7S820 и D18S51 не показано увеличения количества аллелей за счет фланков – вариабельность отмечалась исключительно в области повтора. С учетом информации о фланкирующих последовательностях в локусе D19S433 был идентифицирован редкий изоаллель 13.2 − D19S433[CE13.2]-Chr19 GRCh37p.13 30417142-30417205 [CCTT]12 ccta CCTT cttt CCTT rs745607776-del; в локусе D13S317 – восемь изоаллелей с описанными частыми мутациями А>Т в первой и пятой позициях на 3'- фланкирующей области повтора (rs9546005, rs202043589); в локусе vWA – четыре изоаллеля: 14 и 15 (rs75219269 A>G), 16, 17 (rs199970098 G>A) с полиморфизмом во фланкирующей области. Тогда как для локуса D5S818 вся вариабельность обеспечивалась известной мутацией во фланкирующем участке (rs73801920 C>A) [24] и только в одном случае был обнаружен описанный ранее вариант аллеля 12, несущий мутацию (rs1171357623, T>G) в четвертом тандеме [24] (табл. 3).

Из 517 различных аллелей, идентифицированных в белорусской популяции, 13 ранее не были описаны (табл. 4). Среди впервые обнаруженных аллелей семь были обусловлены новой комбинацией повторяющихся блоков в тандемной области, пять имели однонуклеотидные замены внутри тандемного повтора и один аллель − 15 в локусе D5S818 имел на фланке мутацию rs73801920, описанную ранее, но в комбинации с этим вариантом аллеля не встречавшуюся в других исследованных популяциях, согласно сведениям STRBase 2.0 [7]. Все ранее неописанные аллели зарегистрированы в базе данных Nucleotide NCBI под номерами ON248964, ON359896–ON359907.

При оценке уровня генетического разнообразия белорусской популяции с учетом данных МПС-генотипирования показано увеличение значений наблюдаемой гетерозиготности (H_О) для всех локусов с выявленными изоаллельными вариантами, кроме локусов FGA, D17S1301, D18S51, D22S1045. В наибольшей степени H_О увеличивалась для локуса D4S2408 – в 1.32 раза. Для этого локуса выявлен полиморфизм нуклеотидной последовательности области тандемного повтора только для аллеля 9, имеющего максимальную частоту встречаемости в популяции (59.5%), при этом частота встречаемости двух выявленных изоморфных вариантов оказалась практически одинаковой − 0.2196 и 0.1869. Таким образом, из 261 образца, имевшего по данным КЭ-анализа гомозиготный генотип “9/9”, 137 образцов, т.е. более половины, имеют гетерозиготный генотип. Похожая картина наблюдалась для локусов D9S1122 и D13S317, для которых увеличение гетерозиготности по сравнению с данными КЭ-генотипирования также было значительным (табл. 5).

Вероятность случайного совпадения генотипов двух неродственных индивидов (MP) снижалась для всех локусов, для которых были зарегистрированы изоаллельные варианты (кроме локуса FGA), что свидетельствует об увеличении идентификационной значимости результатов генотипирования, получаемых методом МПС. В наибольшей степени МР снижалась для локусов D9S1122, D8S1179, D13S317 и D21S11 – в 2.7 раза; в наименьшей степени – для локусов D22S1045 и D17S1301 (в 1.1 раз). Рассчитанная по данным МПС средняя вероятность того, что два случайно выбранных из популяции индивида будут иметь один и тот же генотип по совокупности всех 27 STR-локусов, составила 2.89 × 10^–35 (это означает, что случайное совпадение генотипа возможно с одним из 3.5 × 10³⁴ человек). Этот результат на четыре порядка превышает значение, получаемое с использованием данных фрагментного анализа (1.43 × 10^–31, один из 7 × 10³⁰ человек).

Информационная значимость данных МПС-генотипирования при установлении родства также значительно увеличивается по сравнению с данными КЭ, о чем свидетельствует рост значений вероятности исключения индивида по заданному генотипу (PE) и индексов родства (TPI) для локусов тест-системы. Так, PE увеличивалась в наибольшей степени для локуса D4S2408 − в 2 раза, для локусов D9S1122, D13S317, D5S818 и D8S1179 – в 1.3–1.5 раза. Максимальный рост значений TPI зафиксирован для локусов D12S391 (с 4.89 до 10.18) и D21S11 (с 3.89 до 6.2), т.е. для локусов с наибольшим количеством зарегистрированных по данным МПС аллельных вариантов. Комбинированный индекс родства, получаемый с учетом наличия МПС-аллелей, достигал значения 3.25 × 10¹², что на два порядка выше значения, получаемого на основе данных фрагментного анализа – 2.08 × 10¹⁰.

Анализ генетической подразделенности резидентного населения Республики Беларусь, проведенный методом молекулярной дисперсии (AMOVA) с учетом различий в частотах МПС-аллелей, не выявил статистически значимых генетических различий между исследованными региональными популяциями. Все население республики характеризуется общностью генного пула по изученным 27 аутосомным STR-маркерам. Анализ матриц парных расстояний также не позволил выявить статистически достоверные различия между парами популяционных выборок, сформированных по региональному признаку. Применительно к экспертному ДНК-анализу полученные данные указывают на возможность использования частотных характеристик 27 аутосомных локусов, установленных методом МПС, для всего населения Беларуси и формирования единой республиканской референсной базы данных.

Частоты аллелей аутосомных STR-локусов для населения Республики Беларусь по данным массового параллельного секвенирования приведены в дополнительных материалах к настоящей статье и могут быть использованы для вероятностных расчетов при идентификации личности и установлении родства в криминалистике, а также в популяционно-генетических сравнительных исследованиях.

В рамках настоящего исследования с использованием технологии МПС и набора ForenSeq DNA Signature Prep Kit впервые у населения Республики Беларусь изучена внутренняя структура нуклеотидной последовательности 27 аутосомных STR-локусов. Проведена оценка соответствия результатов генотипирования, получаемых методом капиллярного электрофореза и массовым параллельным секвенированием. Показано, что генотипы PowerPlex® Fusion 6C и ForenSeq DNA Signature Prep Kit конкордантны для всех перекрывающихся локусов, за исключением D7S820 − соответствие составило 99.96%. Вместе с тем следует отметить, что для отдельных образцов в некоторых локусах обнаружены ложные гомозиготные генотипы, один из аллелей в которых присутствовал, но не детектировался программным обеспечением ForenSeq UAS. В связи с этим при проведении исследования с использованием набора ForenSeq DNA Signature Prep Kit рекомендовано: 1) особое внимание обращать на результаты генотипирования локусов D22S1045 и D7S820; также требуется осторожность в отношении локусов D5S818, D1S1656, PentaE и PentaD, особенно при исследовании малых количеств ДНК или ДНК плохого качества; 2) на основе анализа эмпирических данных определить минимальные пороговые уровни прочтения маркеров, преимущественно маркеров с высоким гетерозиготным дисбалансом; 3) установить оптимальные требования к качеству исследуемых образцов.

С учетом полиморфизма тандемных и фланкирующих участков исследованных локусов в белорусской популяции суммарно идентифицировано 216 дополнительных аллельных вариантов, 13 из которых обнаружены впервые. Для всех локусов рассчитаны частоты встречаемости аллелей и криминалистические параметры идентификационной информативности. Для имплементации новых сведений в экспертную практику сформирована референтная база данных частот аутосомных STR-локусов для населения Республики Беларусь по данным массового параллельного секвенирования.

Полученные в настоящей работе сведения предоставляют для экспертного сообщества Республики Беларусь возможность проведения вероятностной оценки результатов идентификации личности и установления родства, основанную на исследовании МПС-профилей ДНК, что обеспечит эффективное и корректное использование методов массового параллельного секвенирования в экспертной практике.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.