Генетика, 2023, T. 59, № 3, стр. 283-293

МЕТАЛЛОШАПЕРОНЫ

Регуляция меди опосредована медь-зависимыми ферментами, которые широко экспрессируются в клетках и тканях организма. Так, лизил-оксидаза, которая является медьсодержащим белком, сшивает коллаген и эластин, что необходимо для образования соединительной ткани. Церулоплазмин – ферроксидаза, которая содержит более 65% всей меди в организме, участвует в метаболизме железа и во многих окислительно-восстановительных реакциях организма.

Известно, что у эукариот металлоферменты меди обнаружены во многих клеточных локациях, включая цитозоль, митохондрии и клеточную поверхность. В 1991 г. было открыто семейство эукариотических цитоплазматических белков, связывающих ионы металлов, которые участвуют во внутриклеточном перемещении ионов металлов [1]. Исследования in vitro показывали, что большая часть ферментов меди легко усваивает металл без вспомогательных белков, однако эксперименты in vivo показали, что требуется наличие дополнительного фактора – шаперонов [6].

Металлошапероны – небольшие растворимые белки, которые доставляют ионы металлов к месту назначения или в промежуточные положения внутри клеток, защищая при этом металлы от случайных участков связывания или вредных реакций. Первое упоминание о металлошаперонах меди датируется 1997 г., до этого не существовало установленных молекул, которые выполняли эту функцию. Металлошапероны отвечают за транспортировку ионов металлов к белкам-мишеням. Так, функция металлошаперона должна быть двойственной – связывание иона металла и перенос иона металла к белку-партнеру или от него. Для связывания иона металла необходим участок хелатирования, а перенос осуществляется посредством специфических белок-белковых взаимодействий [7].

Все выделенные к настоящему времени шапероны меди были впервые идентифицированы в пекарских дрожжах Saccharomyces cerevisiae. В работе 1999 г. M.E. Portnoy и соавт. выделяли три металлошаперона меди: дрожжевой Lys7p (человеческий CCS), который доставляет медь к супероксиддисмутазе 1 (SOD1) в цитозоле; дрожжевой и человеческий COX17, которые направляют медь в митохондрии для активации цитохромоксидазы; и дрожжевой Atx1p (человеческий HAH1 или ATOX1), который специфически переносит медь по секреторному пути для включения в ферменты меди, предназначенные для клеточной поверхности или внеклеточной среды [8].

Leo W.J. Klomp с соавт. [7] провели скрининг библиотеки кДНК печени человека и выделили гомолог Atx1p млекопитающих, который был назван HAH1 (human ATX homologue 1, сейчас ATOX1). Ген включал 113 пн 5'-нетранслируемой области, 204 пн открытой рамки считывания и 185 пн 3'‑нетранслируемой последовательности. В результате РНК-блоттинга была изучена тканеспецифическая экспрессия гена, мРНК была обнаружена во всех исследованных тканях, что подтверждало важную роль данного белка в клеточном гомеостазе меди и антиоксидантной защите [7]. Было показано, что Atox1 млекопитающих защищает клетки от окислительного повреждения, вызванного перекисью водорода, изменение его уровня влияет на воспалительную реакцию и антиоксидантную защиту, а инактивация, в свою очередь, повышает чувствительность клеток к истощению глутатиона и другим стрессовым факторам [9, 10].

Антиоксидантный протеин ATOX1 – повсеместно экспрессируемый белок, массой 7.4 кДа, состоящий из 68 аминокислот, имеет компактную структуру с ферредоксиноподобной топологией βαββαβ, содержит сайт связывания металла (MBS) и потенциальный сигнал ядерной локализации (NLS), имеет мотив последовательности MxCxxC. Две короткие α-спирали, “покоящиеся” на β-листе, содержат два функциональных остатка Cys, что обычно наблюдается для ферредоксиноподобных малых оксидредуктаз (рис. 1 ) [11]. ATOX1 доставляет медь к медным насосам, ATP7A и ATP7B, присутствующим на мембранах секреторных пузырьков и в транс-сети Гольджи, тем самым облегчая снабжение медью различных медь-зависимых оксидоредуктаз, созревающих в секреторных везикулах. ATOX1 образует стабильные гетеродимерные комплексы с медным мостиком со всеми шестью металлсвязывающими доменами ATP7B, расположенными в транс-сети Гольджи, и впоследствии транспортирует к нему медь. Предполагается, что ATOX1 регулирует присутствие меди в белке ATP7B, что, в свою очередь, влияет на внутриклеточную локализацию, посттрансляционную модификацию и каталитическую активность белка [12].

Дальнейшие исследования показали, что доставка меди к супероксиддисмутазе SOD1 (также известную как Cu/Zn-SOD гомодимерный цинк- и медьсодержащий фермент) осуществляется посредством фермента, который впоследствии назвали медным шапероном для супероксиддисмутазы – CCS [13]. Человеческий CCS кодируется единственной копией гена на хромосоме 11 и повсеместно экспрессируется во всех исследованных тканях и типах клеток человека. CCS представляет собой многодоменный белок (29 кДа, 274 аминокислоты), который состоит из двух доменов (I и II) [14]. Благодаря гомологичной структуре домена I с ATOX1 CCS и ATOX1 могут напрямую взаимодействовать друг с другом, что в свою очередь, возможно, увеличивает сродство меди к активации SOD1. Yuta Hatori с соавт. [15] показывают решающую роль домена I CCS в конкуренции за ограниченный цитозольный пул меди, другими словами ATOX1 способствует транспорту цитозольной меди к секреторному пути, где происходят созревание большинства медных ферментов и удаление избыточной меди, а при дефиците меди CCS активируется и обменивает медь с ATOX1, чтобы выделить металл для созревания SOD1. Домен II гомологичен SOD1, который является белком-мишенью CCS: у него есть сайты связывания металлов для меди и цинка, сходные с SOD1, но лишенные каталитически важных остатков. Домен II необходим для гетеродимеризации с SOD1 и облегчает вставку меди в SOD1. Таким образом, фермент CCS благодаря двум доменам захватывает медь и переносит к SOD1 [15].

COX17 (Cytochrome C Oxidase 17) – белок размером 7 кДа, служит медным шапероном для митохондриальной цитохром С оксидазы (CCO). Митохондриям требуется медь для созревания CCO, которая катализирует терминальную реакцию дыхательной цепи и встроена во внутреннюю мембрану митохондрий. Доставка меди осуществляется с помощью ряда митохондриальных медных шаперонов, включая SCO1 (Synthesis of Cytochrome C Oxidase 1), SCO2 (Synthesis of Cytochrome C Oxidase 2) и COX11 (Cytochrome C Oxidase Copper Chaperone COX11). Белок COX17 наблюдался как в цитозоле, так и в межмембранном пространстве митохондрий (IMS). SCO1 и SCO2 представляют собой гомологичные мембранные белки с тиоредоксиноподобным доменом, обращенным к IMS. COX17 захватывает один ион меди и переносит металл к SCO1 и COX11, которые оба участвуют во встраивании меди в CCO. Известно, что SCO1 получает медь от COX17 в реакции, связанной с переносом электрона, а затем доставляет медь в CCO посредством специфических белок-белковых взаимодействий. SCO2 также получает медь от COX17, но действует как оксидоредуктаза, восстанавливая металл, координирующий остатки Cys CCO, при этом связывание меди с SCO2 значительно облегчает окислительно-восстановительную реакцию [11].

CTR1 (Copper Transporter 1) – высокоаффинный переносчик также известный как SLC31A1, который доставляет медь через плазматическую мембрану. CTR1 существует в плазматической мембране в виде гомотримера с внеклеточным N‑концевым участком, тремя трансмембранными спиралями и внутриклеточным С-концом [16].

Таким образом, общая схема метаболизма меди в норме выглядит следующим образом: клетки связывают медь посредством глутатиона, который способствует проникновению меди в клетки за счет облегчения диссоциации меди от высокоаффинного переносчика меди CTR1, или переносчиком двухвалентного металла 1 (DMT1). Белок CTR1 переносит медь из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) в энтероциты. Далее медь поступает в систему воротной вены и поглощается гепатоцитами. В клетках печени медь включается в церрулоплазмин, который секретируется в кровоток для последующего распределения по всему организму. Часть меди включается в состав ферментов гепатоцитов или связывается с металлотионеинами. Примерно 30% меди, поглощенной гепатоцитами, сразу экскретируется через желчь. В клетки всех типов медь поступает через CTR1. Будучи связанной с тиоловыми лигандами, медь перемещается по различным внутриклеточным направлениям, т.е. к медь-зависимым ферментам в цитозоле, митохондриях и просвете везикулярных компартментов. В цитозоле она связывается Cu(I)-шаперонами, которые обеспечивают безопасный транспорт и доставку ионов меди к местам формирования купроэнзимов: шаперон CCS участвует в передаче меди к SOD1, шаперон COX17 – в митохондрии к цитохромоксидазе и шаперон ATOX1 – в транс-сети Гольджи к медь-транспортирующим АТФазам А- и Р-типа. В ответ на повышение меди в транс-сети Гольджи активируется фермент ATP7A, что влечет высвобождение меди через воротную вену в печень. ATP7B в свою очередь переносит связанную с церулоплазмином медь в кровь, а также выводит избыток меди в желчь (рис. 2 ).

Повсеместно экспрессируемый белок ATOX1 кодируется одноименным геном. Ген ATOX1 (NM_004045.3, NP_004036.1, antioxidant 1 copper chaperone, ранее HAH1) кодирует белок транспорта меди ATOX1, расположен на 5-й хромосоме в положении 5q33.1, содержит 4 экзона и 3 интрона. Длины экзонов гена ATOX1 составляют 59 пн – первый экзон, 76 пн – второй, 171 пн – третий и 136 пн – четвертый. Три интрона в гене ATOX1 имели длину 6764 пн (интрон 1), 5255 пн (интрон 2) и 3320 пн (интрон 3) [7, 17].

Роль гена ATOX1 в патогенезе нарушения обмена меди можно рассмотреть в двух направлениях – антиоксидантная защита от окислительных повреждений клеток (например, при канцерогенезе) или транспортное регулирование клеточного гомеостаза меди: 1) недостаточное количество поступающей меди в клетки или 2) избыток и накопление меди в клетках, тканях и органах.

ВЛИЯНИЕ ГЕНА ATOX1 В ПАТОГЕНЕЗЕ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ПРИ КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ

Рак представляет собой многофакторную совокупность заболеваний, которые включают неконтролируемый рост клеток с последующей инвазией раковых клеток, диссеминацией и образованием вторичных опухолей в локальных и отдаленных местах [18]. Медь способствует ангиогенезу опухоли, она участвует в реакциях с повышенным окислительно-восстановительным потенциалом, которые приводят к образованию продуктов окисления и окислительному стрессу [19]. Существуют данные, согласно которым раковая ткань и сыворотка раковых больных содержат повышенное количество меди. Медь активирует метаболические и пролиферативные ферменты, повышающие способность раковых клеток к метастазированию, а также может являться диагностическим/прогностическим маркером канцерогенеза [20]. Было отмечено снижение уровня меди в сыворотке во время ремиссии и повышение – при рецидивах, в контексте хронического лимфолейкоза, неходжкинской лимфоме, множественной миеломе и лимфоме Ходжкина, повышение также отмечалось при ретикулоклеточной саркоме, бронхогенном и плоскоклеточном раке гортани, раке шейки матки, молочной железы, желудка и легких [21]. Существует огромное количество исследований, направленных на разработку медь-специфических хелаторов в качестве средств для подавления этих процессов посредством контроля ангиогенеза. Хелаторы меди удаляют ионы меди из организма, что замедляло рост и метастазирование рака путем ингибирования васкуляризации поражений [22].

Белок ATOX1 обладает активностью фактора транскрипции и играет жизненно важную роль в пролиферации раковых клеток посредством участия в процессах ангиогенеза. Сообщалось, что ATOX1 способствует экспрессии циклина D1 и NADPH-оксидазы p47 phox, что приводит к усилению пролиферации и генерации активных форм кислорода [23]. Jana Arundhati с соавт. указывают на увеличение экспрессии гена ATOX1 у пациентов с колоректальным раком, а также его значение на метастазирование, и предлагают этот ген в качестве терапевтической мишени в лечении рака прямой кишки [24]. Аналогичные данные показывают исследования в области рака молочной железы, в которых была показана роль гена в метастазировании опухоли. Авторы предлагают использовать анализ уровня экспрессии гена ATOX1 в качестве потенциального прогностического биомаркера для ER-позитивных подтипов и ранних стадий рака молочной железы [18, 25]. Ген ATOX1 значительно экспрессировался в образцах пациентов с меланомой, вызванной мутацией в гене BRAF. Было установлено, что ATOX1 необходим для роста меланомы с положительной мутацией BRAF, а его генетическая делеция или фармакологическое ингибирование связаны с подавлением активации онкогенного митоген-активируемого протеинкиназного пути (MAPK) [26].

ГЕН ATOX1 И ДЕФИЦИТ МЕДИ В КЛЕТКАХ ПРИ БОЛЕЗНИ МЕНКЕСА

Болезнь Менкеса (OMIM 309400, болезнь курчавых волос, синдром затылочных рогов, БМ) представляет собой сцепленное с Х-хромосомой мультисистемное летальное нарушение метаболизма меди, связанное с мутациями в гене ATP7A, характеризующееся ранней задержкой роста, своеобразным оволосением и фокальной мозговой и мозжечковой дегенерацией. Частота заболевания по некоторым исследованиям варьирует от 1 на 40 000 до 1 на 354 507 населения [27].

Описан широкий спектр клинических проявлений, связанный с нарушением гомеостаза меди вследствие мутаций в гене ATP7A. Наиболее часто описывают три клинические группы – болезнь Менкеса, синдром затылочного рога и Х-сцепленная дистальная спинальная мышечная атрофия 3-го типа. Помимо основных групп существуют промежуточные формы болезни Менкеса – длительно сохраняющаяся классическая болезнь Менкеса (Long Surviving Menkes), умеренная (Moderate Menkes) и мягкая (Mild Menkes) формы [28].

За счет неспецифических клинических и биохимических признаков в первые дни жизни болезнь Менкеса чаще всего диагностируют после появления выраженных симптомов в возрасте от 6–10 недель. Ярким признаком заболевания является наличие структурных изменений волос – так называемые “курчавые волосы”, представленные повышенной ломкостью волос (trichorexis nodosa) и монилетриксом (веретенообразные волосы). Поздними проявлениями болезни являются слепота, субдуральная гематома, дыхательная недостаточность. Большинство пациентов умирают к трем годам жизни вследствие инфекционных, сосудистых осложнений или от самой неврологической дегенерации.

Патогенный механизм – аномальный метаболизм меди, вызванный мутацией в гене ATP7A. Ген ATP7A длиной 8.5 тпн расположен в регионе Xq13.3, имеет 23 экзона, кодирует 1500 аминокислот и широко экспрессируется в головном мозге, почках, легких и мышцах [29]. Ген кодирует энергозависимый транспортирующий Cu++ альфа-полипептид, который циклически переключается между транспортной сетью Гольджи и плазматической мембраной. Мутации в гене ATP7A приводят к накоплению меди в кишечнике и нарушению всасывания меди, что ведет к дефициту меди в организме, в том числе в головном мозге. Мутации могут влиять на синтез белка, стабильность белка, доставку и локализацию, каталитическую активность и посттрансляционные модификации. Предполагается, что в трети случаев болезни Менкеса обнаруживаются новые мутации. На сегодняшний день известно около 170 различных мутаций, влияющих на ATP7A [30]. Дефицит меди приводит к снижению активности дофамин-β-гидроксилазы (DBH), которая превращает дофамин в норадреналин (важный нейротрансмиттер в норадреналинэргических нейронах), пептидил-α-амидирующая (PAM) монооксигеназы (необходима для нейрогенеза и выживания нейронов) и приводит к активации N-метил-D-аспартатного рецептора (NMDAR), вызывая дегенеративную потерю нейронов у пациентов с БМ [31].

ATP7A имеет шесть металлосвязывающтх доменов, посредством которых происходит связь с медью, домены 1–4 выполняют регуляторную функцию, а также через эти домены происходит взаимодействие между ATP7A и ATOX1. На мышиных моделях было показано, что разрушение мышиного гомолога Atox1 приводит к перинатальной смертности и биохимическим аномалиям, сходным с мышиными моделями БМ. Клетки с дефицитом Atox1 накапливали высокие уровни внутриклеточной меди, и метаболические исследования показали, что этот дефект был вызван нарушением клеточного оттока меди. Таким образом, авторы пришли к выводу, что продукты генов ATOX1 и ATP7A являются неотъемлемой частью транспорта меди у млекопитающих и что мутации в любом из них могут вызывать сходные клинические и биохимические фенотипы [32, 33].

ГЕН ATOX1 И ИЗБЫТОЧНОЕ НАКОПЛЕНИЕ МЕДИ В КЛЕТКАХ ПРИ БОЛЕЗНИ ВИЛЬСОНА–КОНОВАЛОВА

Одним из примеров нарушения метаболизма меди по причине избыточного накопления меди в клетках и тканях является такое заболевание как болезнь Вильсона–Коновалова.

Болезнь Вильсона–Коновалова (OMIM 277900, гепатолентикулярная дегенерация, гепатоцеребральная дистрофия, БВК) – тяжелое прогрессирующее наследственное заболевание, передающееся по аутосомно-рецессивному типу. В основе патогенеза БВК лежит нарушение выведения меди из организма, приводящее к избыточному накоплению этого микроэлемента в тканях и сочетанному поражению паренхиматозных органов и головного мозга [34].

Заболевание может быть диагностировано в любом возрасте, чаще это 5–35 лет. У большинства пациентов детского или подросткового возраста с БВК обычно наблюдаются печеночные проявления (небольшие изменения биохимических показателей, печеночная недостаточность). По мере прогрессирования заболевания у пациентов могут проявляться признаки и симптомы хронического заболевания печени, гепатоспленомегалии или цирроза печени [35].

В возрасте до 10 лет нервно-психические симптомы редко наблюдаются у детей, однако у 5–15% детей с печеночными проявлениями также могут быть неврологические симптомы. БВК влияет на ЦНС в основном через дисфункцию экстрапирамидной системы и бульбарный синдром. На ранних стадиях заболевания наиболее частым симптомом является дизартрия (73–91% случаев неврологических проявлений) [36]. Впоследствии появляются двигательные расстройства, такие как тремор, паркинсонизм или непроизвольные движения, возможны дисфункция мозжечка, хорея и гиперрефлекция. Психиатрические симптомы могут варьироваться от поведенческих изменений и расстройств настроения до психозов; кроме того, аффективные расстройства встречаются чаще, чем расстройства психотического спектра [35].

Наиболее известным диагностическим симптомом БВК является кольцо Кайзера–Флейшера, поражающее десцеметову мембрану роговицы. У пациентов с неврологическими проявлениями в 95% случаев наблюдается кольцо Кайзера–Флейшера, у пациентов с печеночными проявлениями – в 50% [34].

Заболевание вызывается гомозиготными или сложными гетерозиготными мутациями (наличие двух разных мутантных аллелей) в гене ATP7B, кодирующем трансмембранную транспортирующую медь АТФазу, которая обеспечивает экскрецию меди в желчь и доставляет медь для функционального синтеза церулоплазмина. В результате мутаций в гене ATP7B происходит снижение функциональности фермента и АТФаза теряет способность переносить медь к церулоплазмину. Вследствие этого происходит уменьшение экстракции меди в желчь, перегрузки гепатоцитов и головного мозга медью, что влечет за собой печеночные и неврологические расстройства. В настоящее время выделяют более 800 мутаций в гене ATP7B. Большинство из них представляют собой миссенс-мутации, небольшие делеции/инсерции в кодирующей области или мутации сплайс-соединения. “Горячие точки” мутаций существуют, но значительно разнятся среди популяций. Среди европеоидов наиболее распространенной мутацией у пациентов с БВК является мутация H1069Q (встречается в 30–73% случаев) [37].

На данный момент ген ATP7B является единственным идентифицированным геном, мутации в котором приводят к развитию болезни Вильсона–Коновалова. Однако в некоторых исследованиях у пациентов с яркой клинической симптоматикой БВК и с отсутствием двух выявленных мутаций в гене ATP7B предполагают существование другого причинного гена, кроме ATP7B [38]. Недавние исследования показали, что на клиническую картину БВК помимо мутаций в гене ATP7B могут оказывать влияние мутации в так называемых генах-модификаторах. Гены-модификаторы – это группа генов, которые участвуют в патогенезе заболевания и могут как усугублять, так и облегчать фенотипическое действие причинного гена. Среди генов-модификаторов БВК выделяют гены ATP7A и APOE. Известен спектр генов, которые продуцируют белки, участвующие в метаболизме меди, что приводит к предположению вовлеченности этих генов и в патогенез такого заболевания как БВК, но уже в роли генов-модификаторов – это такие гены как HFE, COMMD1, XIAP, PRNP, MTHFR, ESD, INO80 [39]. Кроме перечисленных к генам-модификаторам также можно отнести ген ATOX1.

Важным аспектом остается идентификация генетических вариантов ATOX1 при болезни Вильсона–Коновалова. Все больше появляется публикаций, посвященных поиску полиморфных вариантов или мутаций, которые могут привести к изменению функции гена ATOX1. Существует предположение, что возникновение мутаций в гене ATP7B у больных БВК, которые влияют на его взаимодействие с ATOX1 (c.254G>T (p.Gly85Val); c.1475T>C (p.Leu492Ser) и c.1772G>A (p.Gly591Asp)), предполагают важную роль шаперона в патогенезе заболевания [40]. Также прогнозируется, что мутации, приводящие к снижению функции белка ATOX1, будут влиять на гомеостаз меди и патогенез БВК, вызывая различные клинические проявления болезни.

Некоторые исследования опровергают связь определенных замен с патогенезом или клиническим полиморфизмом БВК. Так, авторы исследования 2008 г. выдвинули предположение о возможной модифицирующей роли двух полиморфных вариантов (5'UTR-99T>C и 5'UTR-68C>T) в гене ATOX1, однако более позднее исследование другого коллектива авторов, проведенное для 112 пациентов с БВК, не показало значимой ассоциации с вариантом 5'UTR-99T>C в гене ATOX1 [41, 42]. В 2019 г., в Индии был проведен поиск мутаций в гене ATOX1 у 50 человек с БВК и 60 человек из контрольной группы, и в опубликованных материалах было выдвинуто предположение о выявлении нового кандидатного полиморфизма гена ATOX1 в качестве модификатора при БВК [43]. Исследователями было идентифицировано четыре новых полиморфизма в гене ATOX1, среди которых был и вариант кодирующей области c.40G>A, p.(Gly14Ser). Выявленный вариант p.(Gly14Ser) наблюдался у пациента с БВК с ранним началом заболевания, сниженным уровнем церулоплазмина в сыворотке и поражением печени и головного мозга, при этом такая клиника отсутствовала у другого пациента с БВК и идентичной мутацией ATP7B, но с нормальным ATOX1. Кроме того, компьютерный анализ предсказал, что замена p.(Gly14Ser) в критическом мотиве связывания меди (MXCXG14C) белка влияет на белок-белковое взаимодействие, связанное с обменом и переносом меди между ATOX1 и ATP7B-MBD4. К сожалению, нет данных о дальнейших экспериментах проверки влияния данной мутации на патогенез меди, из-за чего сложно сделать однозначный вывод о подтвержденной модифицирующей роли варианта p.(Gly14Ser).

МОДЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТОГЕНЕЗА МЕДИ НА ЖИВОТНЫХ

В настоящее время доступно несколько естественных и генетически модифицированных моделей животных для исследования патогенеза и последующей адресной терапии болезни Вильсона–Коновалова. Так, описаны четыре животных модели БВК с дефектами гена ATP7B: 1) крысы линии “Long-Evans cinnamon” (LEC), 2) мыши линии “Toxic milk” (tx), 3) трансгенные мыши с нокаутом Atp7b и 4) лабрадор-ретривер [44]. Все животные модели обладают высокой гомологией гена Atp7b с геном ATP7B человека, что позволяет использовать данных животных в качестве модельных для изучения БВК.

Крысы линии LEC достаточно широко и долго использовались в качестве основных животных моделей БВК. У этих крыс известна сходная делеция гена Atp7b, который очень похож на человеческий ген ATP7B, что приводит к накоплению избытка меди в печени и одновременному снижению выхода меди в желчь [44–47].

Для мышей линии “Toxic milk” известна только одна точечная мутация Met1386Val в гене Atp7b, что приводит к неправильной локализации и потере активности транспорта меди [48–50]. Наблюдаемые биохимические изменения (низкий уровень меди в сыворотке и церулоплазмина) при данном генетическом дефекте подобны биохимическим изменениям у людей с БВК, в связи с чем долгое время именно мыши линии “Toxic milk” служили модельными животными для разработки хелатной терапии, направленной на коррекцию уровня меди [51].

У лабрадора-ретривера мутация Atp7b (замена аргинина на глутамин на С-конце) также приводит к избытку накопления меди в печени, что представляет собой еще одну несомненно важную животную модель изучения БВК [52, 53].

Однако крысы линии “Long-Evans cinnamon”, мыши линии “Toxic milk” и лабрадор-ретриверы не использовались в качестве модельных животных для изучения изолированной роли гена ATOX1 в патогенезе БВК, но использовались как модель in vivo для клинических испытаний тех хелаторов, точкой приложения которых является взаимодействие с металлошаперонами, в том числе и ATOX1.

Известно, что именно трансгенные мыши являются основным инструментом для изучения физиологической роли переносчиков меди: Ctr1, Atox1, медного шаперона для Cu/Zn superoxide dismutase (Ccs) и Cox17. Так, в 2001 г. I. Hamza с соавт. [32] проанализировали линию мышей с нокаутом гена Atox1. Мыши Atox1(-/-) не развивались сразу после рождения: 45% детенышей умирали до отлучения от груди. У выживших животных наблюдались такие симптомы как задержка роста, дряблость кожи, гипопигментация и судороги из-за перинатального дефицита меди. Дефицит Atox1 у матери заметно увеличивал тяжесть фенотипа Atox1(-/-), что приводило к увеличению перинатальной смертности, а также к серьезной задержке роста и врожденным порокам развития среди выживших потомков Atox1(-/-). Кроме того, клетки с дефицитом Atox1 накапливали высокие уровни внутриклеточной меди, и метаболические исследования показали, что этот дефект был вызван нарушением клеточного оттока меди [32].

Кроме того, проведенное в 2009 г. исследование гомеостаза меди на фибробластах мышей, обработанных siRNA Atox1, показало аномальное повышение концентрации меди в клетках [54].

РОЛЬ ГЕНА ATOX1 ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С НАРУШЕНИЕМ МЕТАБОЛИЗМА МЕДИ

Существующее патогенетическое лечение БВК становится более персонализированным при появлении новых данных о мутациях не только в гене ATP7B, но и в генах-модификаторах, таких как ATOX1. Основным подходом к лечению БВК является комбинированная терапия, состоящая из выведения повышенного количества меди с использованием хелаторов и последующего ограничения поступления меди с помощью диетотерапии. На сегодняшний день к хелаторам при БВК относят: соли цинка, D-пеницилламин, триентин или триэтилентетрамин (ТЭТА), димеркаптоянтарную кислоту и димеркаптопропансульфоновую кислоту, а также тетратиомолибдаты (ТТМ): тетратиомолибдат аммония и тетратиомолибдат бисхолина. Однако большинство применяемых хелаторов неспецифичны для меди и могут связывать другие металлы даже с более высокой авидностью. Например, триентин предположительно образует комплексы с железом и таким образом может вызывать побочные эффекты, такие как сидеробластная анемия.

Препарату ТТМ уделяется больше внимания, чем другим препаратам, хелатирующим медь, поскольку известна его двойная роль: во-первых, предотвращение образования АФК, происходящих из стабильного неокислительно-активного кластера Cu/ТТМ, и, во-вторых, ингибирование переноса меди в места мишени или инактивация многих медь-зависимых ферментов, важных для клеточного метаболизма (поддержание и пролиферация), путем образования тройных комплексов белок–Cu–TTM [55–57].

Ярким примером является связь ТТМ с цитоплазматическим транспортным белком меди Atox1 с образованием стабильного комплекса ТТМ–Atox1. Полученный продукт ингибирует перенос меди в раковые клетки, что требует избытка меди и значительно снижает пролиферацию раковых клеток [20].

Впервые препарат ТТМ использовался в качестве потенциального препарата против меди для лечения БВК еще в 1984 г. [58, 59]. ТТМ известен как Cu-хелаторный препарат на основе серы, который в первую очередь разработан для лечения БВК, а в настоящее время также для лечения нескольких типов рака [60–62].

Несколько моделей на животных и исследования на людях показали, что ТТМ является безопасным, хорошо переносимым, антиоксидантным и менее токсичным препаратом [63, 64].

Кроме того, была исследована связь между медью, раком и/или ангиогенезом [65–67]. Основываясь на экспериментальных данных, медь является важным элементом для ангиогенеза во время образования новых кровеносных сосудов, в которых развиваются опухолевые/раковые клетки. И так как повышенный уровень меди является признаком рака, поэтому медь-зависимые ферменты, а также ангиогенные факторы считаются многообещающими терапевтическими мишенями для лечения рака [20, 57, 67].

ПЕРСПЕКТИВЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНА ATOX1 В ПАТОГЕНЕЗЕ НАРУШЕНИЙ МЕТАБОЛИЗМА МЕДИ

Наблюдаемое малое количество исследований роли гена ATOX1 на модельных системах, как in vitro, так in vivo, дают определенный задел для дальнейшего изучения гомеостаза меди в норме и патологии. В эпоху развития молекулярно-генетических и цитогенетических технологий наиболее перспективным направлением нам представляется изучение функций гена ATOX1 на индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК), с возможностью не просто “внести” мутацию в данный ген, но и создать определенные условия для исследования метаболизма меди. Например, изучить изменение функции гена ATOX1 при создании определенных экстремальных условий, таких как недостаток или избыток меди в клетке. Существующие единичные работы с использованием подобной модели базировались на работе “здорового” гена ATOX1, без учета генетических вариаций как в самом металлошапероне, так и в генах – акцепторах меди. Так, в 2013 г. E.B. Maryon и др. провели эксперимент по захвату меди шаперонами in vivo, изучая роль глутатиона как связывающего медь посредника [68]. Выдвинутая ими гипотеза гласила, что если шапероны связывают доставленную в клетки медь, то нокаут или сверхэкспрессия шаперонов должны повлиять на начальную скорость поглощения меди, обусловленную переносом в клетки с помощью трансмембранного белка-импортера CTR1. Однако, изучив нокаут и сверхэкспрессию таких шаперонов меди как ATOX1 и CCS, влияния на начальную скорость меди в клетках линии HEK-293 обнаружено не было.

Кроме того, например, отмечено явление синергичности генов ATOX1 и ATP7B при таком вирусном заболевании как лихорадка Зика (вирус Зика из рода Flavivirus). Исследование 2021 г. показало, что вирус Зика у человека приводит к подавлению белка ATP7B, что опосредует высвобождение меди и при этом также наблюдается активация механизмов, которые противодействуют высоким уровням меди, включая синтез медных шаперонов, в том числе ATOX1 [69]. Наблюдаемое явление наглядно демонстрирует эффект самоорганизации клетки в распределении меди при неблагоприятных обстоятельствах.

Неоднозначность роли гена ATOX1 в патогенезе медь-зависимых патологий может быть обусловлена недостаточной изученностью данного гена. Нами были собраны все доступные данные на сегодняшний день, которые свидетельствуют о возможной роли этого гена в развитии заболеваний, обусловленных нарушениями метаболизма меди. Кроме того, накопленные данные указывают на перспективность дальнейших исследований металлошаперонов и их роли в патогенезе обмена меди, в том числе в рамках персонализированной медицины.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ № МК-6225.2021.1.4.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.