Вопросы ихтиологии, 2023, T. 63, № 6, стр. 724-730

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Исследования проводили на биологической станции Конневеси Университета Ювяскюля (Финляндия) в августе 2018 г. Сеголетки Oncorhynchus mykiss (средняя длина по Смитту ± стандартное отклонение 10.8 ± 0.65 см) были получены с рыбной фермы, где их содержали в артезианской воде, что предотвращало их заражение паразитами до экспериментов. Рыб содержали в 150-литровом проточном бассейне при температуре 15–16°С и фотопериоде 14 : 10 ч (свет : темнота). Кормили рыб два раза в день гранулированным кормом соответствующего размера. Церкарии D. pseudospathaceum были получены от 12 моллюсков Lymnaea stagnalis из оз. Конневеси. Моллюсков содержали в темноте в холодильнике при температуре 7°C. За 3–4 ч до экспериментов моллюсков выставляли на свет при температуре 20°C, что стимулировало выделение церкарий. Всех церкарий объединяли в одной ёмкости, взвесь тщательно перемешивали и в десяти пробах по 10 мл подсчитывали под бинокуляром число паразитов. Все эксперименты проходили в пределах 5 ч, в течение которых способность паразитов к заражению оставалась высокой.

Эксперименты по влиянию продолжительности экспозиции на скорость поступления церкарий и заражённость сеголеток O. mykiss проводили в 5-литровых аквариумах с профильтрованной озёрной водой при температуре 15–16°С и освещённости 150 лк. В каждый аквариум добавляли по 200 церкарий. Одиночных рыб акклимировали к условиям экспериментального аквариума в течение 30 мин, после чего добавляли воду с церкариями.

Идея этого эксперимента возникла после знакомства с работой (Laitinen et al., 1996), в которой представлены результаты реагирования рыб на различные стрессирующие воздействия, среди которых были церкарии диплостомума. Через несколько минут после добавления паразитов в ёмкость с рыбой у неё наблюдалось резкое увеличение интенсивности вентиляции. Учитывая роль вентиляции в регулировании потока в рыбу взвешенных в воде паразитов (Mikheev et al., 2014), мы предположили, что проникающие в рыбу церкарии могут увеличивать этот поток. Однако этот эффект должен наблюдаться не сразу после добавления взвеси паразитов, а с некоторой задержкой, связанной со временем, необходимым для встречи рыбы с паразитом и его проникновения. Мы ожидали, что по крайней мере при самой короткой экспозиции (5 мин) возбуждающее воздействие проникающих в рыбу церкарий ещё не проявится. Задачи этого эксперимента – оценить продолжительность этой задержки и величину воздействия первых проникающих в рыбу паразитов на последующую скорость их поступления.

После экспериментов рыб содержали индивидуально в проточных аквариумах, где их кормили в прежнем режиме. Через двое суток, когда все паразиты достигали места локализации (хрусталики глаз) в рыбах, последних усыпляли раствором MS-222 и под бинокуляром подсчитывали число метацеркарий. При каждой экспозиции (5, 10, 20 и 30 мин) было исследовано 10 рыб, т.е. всего 40 экз.

Для предварительной оценки условий, при которых предполагаемый механизм “самоактивации” потока паразитов в рыбу может быть эффективным, были выполнены эксперименты по влиянию запаха рыбы на двигательную активность и вертикальное распределение в толще воды церкарий диплостомума. Противоречивые данные о влиянии запаха рыбы на успех передачи церкарий (Smyth, 1966; Combes et al., 2002) могут быть связаны с тем, что исследователи пытались оценить эффективность целенаправленного перемещения паразита к рыбе. Учитывая различия в локомоторных возможностях церкарий и рыб, трудно представить, что паразит может активно двигаться в направлении рыбы, даже если он почувствовал её запах. Воздействие запаха может приводить к изменению частоты стереотипных вертикальных перемещений, что в свою очередь может повлиять на вертикальное распределение церкарий и накопление их в слое воды, где встреча с рыбой более вероятна.

Двигательную активность индивидуальных церкарий D. pseudospathaceum наблюдали в 5-миллилитровой камере под бинокуляром, подсчитывая число “прыжков” за 2 мин. Наблюдения проводили в профильтрованной озёрной воде (контроль) и в такой же воде с добавлением 2 мл воды из 1-литрового аквариума, в котором в течение 15 мин находилась одна особь O. mykiss длиной по Смитту 13–15 см при температуре 15°С. В контроле и в опыте было протестировано по 20 экз. церкарий.

Влияние запаха рыбы на вертикальное распределение церкарий изучали в четырёх колонках высотой 60 см и диаметром 10 см, в которых на трёх уровнях (5, 25 и 55 см над дном) находились трубки с кранами, через которые брали пробы воды для подсчёта церкарий. Средняя концентрация церкарий в колонках составляла 17.5 экз/мл. В первой серии опытов регистрировали изменения распределения церкарий в течение 70 мин (10, 25, 40, 70 мин) в профильтрованной озёрной воде. Учитывая результаты этих экспериментов, во второй серии оценивали вертикальное распределение церкарий через 30 мин после выпуска их в колонки с озёрной водой и последующего добавления воды (100 мл): чистой озёрной (контроль) и из аквариума с рыбой (тест). Воду добавляли через 20 мин после выпуска церкарий через воронку с трубкой, плавно перемещая конец трубки по вертикали.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с применением следующих тестов: однофакторного дисперсионного анализа, теста Краскела–Уоллиса и U-теста Манна–Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В течение 5 мин после выпуска церкарий в аквариум с рыбой средняя скорость поступления паразитов в рыбу была невысокой (не более 0.3 экз/мин). Начиная с экспозиции в 10 мин скорость резко возрастала и оставалась в диапазоне 0.8–1.0 экз/мин (рисунок, а). Эффект продолжительности экспозиции был достоверным (тест Краскела–Уоллиса: H (3, n = 40) = 14.58, p = 0.002). Расчёт накопленных рыбой за 30 мин паразитов с учётом скорости поступления церкарий в рыбу, наблюдавшуюся при 5-минутной экспозиции (до активации вентиляционной активности проникающими паразитами), показал, что их численность не должна превышать 10 экз. (рисунок, б). Однако в эксперименте средняя величина достигала почти 30 экз.

Скорость поступления церкарий трематоды Diplostomum pseudospathaceum в сеголеток Oncorhynchus mykiss (а) и число метацеркарий в рыбе (б) при разной продолжительности пребывания рыб (n = 10) в среде с паразитами (продолжительность экспозиции): (), ($\bigcirc $) – средние значения; () – стандартная ошибка, (‑‑‑) – расчётные данные, полученные на основе исходной скорости поступления церкарий (до взаимодействия с паразитами) и продолжительности экспозиции.

В эксперименте по оценке влияния запаха рыбы на двигательную активность церкарий обнаружено, что при добавлении воды из аквариума с особью O. mykiss частота “прыжков” парящего в толще воды паразита достоверно возрастала более чем на 20% (U-тест Манна–Уитни, p = 0.03). Может ли такое сравнительно небольшое увеличение активности церкарий под влиянием запаха рыбы привести к существенному изменению их вертикального распределения в водной толще?

В первой серии экспериментов по вертикальному распределению церкарий было обнаружено, что со временем всё большее число церкарий погружается в придонный слой (однофакторный дисперсионный анализ, p < 0.001). В интервале от 25 до 40 мин около половины общего числа церкарий находилось на глубине. Регистрация вертикального распределения церкарий во второй серии экспериментов показала, что через 30 мин после выпуска паразитов 52% их общего числа в контроле находилось в придонном слое. Добавление воды с запахом рыбы дало существенно иную картину вертикального распределения – в придонном слое оказалось всего лишь 25% церкарий; более 60% концентрировались в среднем слое (~ 25 см ото дна). Влияние запаха на вертикальное распределение было высоко достоверным (однофакторный дисперсионный анализ, p = 0.001).

ОБСУЖДЕНИЕ

Рыбы, несмотря на их подвижность и защищённость от паразитов (Poulin, FitzGerald, 1989; Barber et al., 2000; Karvonen et al., 2004; Stumbo et al., 2012; Mikheev et al., 2013), часто служат окончательными или промежуточными хозяевами различным паразитам, среди которых трематоды занимают одно из ведущих мест. Не последнюю роль в освоении трематодами столь ценного ресурса играет их способность манипулировать поведением рыб (Barber et al., 2000; Seppälä et al., 2005; Mikheev et al., 2010; Poulin, 2010), что повышает успех их передачи к следующему хозяину и, следовательно, приспособленность. Подавляющее большинство исследований манипулирования в системе “рыбы–трематоды” выполнено на этапе жизненного цикла паразита, когда он передаётся следующему хозяину при поедании предыдущего. Широко распространённая трематода D. pseudospathaceum, хорошо известный манипулятор индивидуальным и групповым поведением рыб (Karvonen et al., 2004; Seppälä et al., 2005; Mikheev et al., 2010), лучше всего изучена на стадии инвазионных метацеркарий, готовых к заражению окончательного хозяина – рыбоядных птиц. Однако приспособленность паразита зависит не только от этого, безусловно, важного отрезка, но и от всех прочих этапов жизненного цикла. Например, преждевременное (для паразита) поедание любым хищником рыбы с незрелыми метацеркариями прерывает жизненный цикл паразита (Шигин, 1986). Отсутствие подходящих условий для попадания свободно плавающих церкарий в подвижных рыб может привести к столь низким показателям экстенсивности и интенсивности заражения промежуточного хозяина, что эффективность передачи диплостомума к окончательному хозяину будет слишком низкой. Для успешного манипулирования в рыбу должно попасть достаточно большое число паразитов. Чем больше паразитов окажется в рыбе, тем быстрее они достигнут инвазионного состояния и с большей вероятностью попадут в следующего хозяина (Gopko et al., 2017).

Идея о более широком диапазоне манипулирования поведением хозяина, чем только повышение его доступности хищнику, привела к гипотезе о манипулировании, направленном на предотвращение преждевременного поедания (защиту) хозяина (predation suppression) на этапе, когда паразит ещё не достиг инвазионности (Parker et al., 2009; Dianne et al., 2011; Weinreich et al., 2012). Рассматриваемая в настоящей статье гипотеза о манипулировании поведением рыбы, повышающем успех передачи паразита на этапе свободно плавающей расселительной личинки, расширяет представления о манипуляторных возможностях паразита в направлении ещё более ранних стадий его жизненного цикла.

Полученные результаты о резком повышении скорости поступления церкарий D. pseudospathaceum в рыбу после того, как в неё проникли первые паразиты, позволяют считать, что внедрившиеся в кожные покровы церкарии возбуждают рыбу и повышают её активность. Проникновение паразитов вызывает увеличение частоты движения жаберных крышек (Laitinen et al., 1996) и усиление потока воды через ротовую и жаберные полости (Mikheev et al., 2014). Этот эффект может быть связан с выделением вещества тревоги (alarm substance) (Poulin et al., 1999) при повреждении паразитом колбочковых клеток (club cells) (Chivers, Smith, 1998). Такой поведенческий механизм возник у рыб для защиты от хищников. Вещество тревоги от повреждённой хищником рыбы служит сигналом опасности для соседей, которые быстро на него реагируют. Паразиты “воспользовались” этим механизмом и, провоцируя сигнал об опасности, вынуждают рыбу усиливать свою активность. Однако больше паразитов попадает в рыбу с усилением потока воды лишь при условии, что их концентрация вблизи рыбы довольно высока. Такие условия могут возникать в прибрежье рек и озёр, где все потенциальные хозяева диплостомума – брюхоногие моллюски, рыбы и птицы – находят подходящие биотопы.

При манипулировании поведением хозяина метацеркариями, которые сначала защищают его от хищников, а затем повышают его доступность для птиц-ихтиофагов, паразиты находятся в постоянном и длительном контакте с рыбой. Для манипулирования на этапе передачи свободно плавающих церкарий должны совпасть следующие обстоятельства: 1) продолжительное нахождение рыбы на небольшом участке; 2) высокая концентрация паразитов на этом участке. Как могут возникать скопления церкарий в толще воды, обеспечивающие эффективную работу механизма “самоактивации” потока паразитов в рыбу с вентиляционными токами воды?

Полученные результаты по оценке влияния запаха рыбы на двигательную активность и вертикальное распределение церкарий показали, что без ольфакторной стимуляции церкарии довольно быстро опускаются в придонный слой. У дна церкарии при низкой активности снижают расход энергии (Sukhdeo, Sukhdeo, 2004). В придонном слое течения слабы и вероятность разноса паразитов и снижения их локальной концентрации невелика. В экспериментах также обнаружено увеличение частоты вертикально ориентированных движений церкарий под влиянием запаха рыбы, что вызывало их подъём из придонного слоя/задержку опускания и накопление в слое ~20–30 см ото дна.

Чтобы значительное число паразитов попало в рыб, запах которых повлиял на активность первых, эти рыбы должны довольно длительное время оставаться на небольшом участке. Причинами такой задержки могут быть питание в скоплении кормовых объектов или конкуренция за индивидуальную территорию с убежищем (Grant, 1997; Johnsson et al., 2000; Михеев, 2006). В последнем случае риск получить большое количество паразитов особенно велик (Mikheev et al., 2020). При определённых условиях продолжительная борьба за привлекательный участок среды, обеспечивающий победителя обильным кормом и убежищем от хищников, может привести к высокому риску заражения церкариями диплостомума. Сильно заражённые особи через 1.0–1.5 мес. становятся особенно уязвимыми для хищников (Шигин, 1986). Неудивительно, что часть рыб, обнаружив присутствие паразитов, отказывается от борьбы за территорию и, объединившись в стаю, покидает опасный участок (Mikheev et al., 2013), тогда как другие продолжают борьбу, несмотря на риски (Mikheev et al., 2010). Эти сведения об экологической роли паразитов позволяют считать их существенным фактором, вызывающим поведенческую дифференциацию в популяциях рыб.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гетерогенность среды разного масштаба и связанное с ней неоднородное распределение ресурсов и рисков могут инициировать поведенческий полиморфизм в популяциях рыб. Высокопродуктивные, но населённые многочисленными хищниками и паразитами низовья рек привлекают на нерест лишь часть популяций многих видов рыб. Другая часть, преодолевая значительные расстояния и препятствия, поднимается в верховья, где риск заразиться паразитами существенно ниже (Михеев и др., 2013). Разделение на группировки оседлых и более подвижных рыб наблюдается и в гораздо меньшем масштабе (Grant, Noakes, 1987). С точки зрения уязвимости для паразитов, личинки которых парят в толще воды, рыбы в постоянно перемещающихся стаях им почти недоступны. Даже почувствовав запах проплывающей рыбы, церкарии не в состоянии за ней угнаться (Sukhdeo, Sukhdeo, 2004). Однако, избегая одних паразитов, рыбы-кочевники могут заражаться другими, получая их при посещении новых биотопов и при питании. Они часто оказываются в незнакомых местах, где размещение ресурсов и рисков им неизвестно. Многие рыбы стремятся использовать другую тактику, поддерживая оседлый образ жизни в высокопродуктивных гетерогенных биотопах, где, конкурируя за участки с кормом и убежищами, они рискуют получить солидный груз паразитов. В такой ситуации даже парящие в воде церкарии трематод со слабыми сенсорными и локомоторными возможностями способны успешно проникать в рыбу вместе с вентиляционными токами. В настоящей работе приведены экспериментальные результаты, подтверждающие гипотезу о манипулировании поведением рыбы проникающими в неё церкариями. Возбуждая рыбу, первые внедрившиеся церкарии усиливают вентиляцию и повышают скорость проникновения в рыбу других церкарий. Подобная “кооперация” и манипулирование, вероятно, способствуют агрегированному распределению паразитов среди рыб.

Трематоды D. pseudospathaceum в качестве второго промежуточного хозяина используют рыб разных видов, но их показатели заражённости сильно различаются. Некоторые виды рыб совсем не заражаются диплостомумом (Шигин, 1986). Причины такой изменчивости могут быть связаны с защитными механизмами, включающими морфологические, физиологические и поведенческие адаптации рыб. Какую роль в этом играют рассмотренные в настоящей работе механизмы, предстоит выяснить в будущих исследованиях.