Известия РАН. Серия биологическая, 2019, № 3, стр. 265-272

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для воздействия на образцы СВЧ-излучением использовали бытовую микроволновую печь максимальной мощностью 800 Вт.

Описторхоз. Для опытов использовали свежих (пойманных в течение нескольких часов) язей Leuciscus idus L., 1758, спонтанно зараженных метацеркариями O. felineus, которые были отловлены в месте впадения р. Бартак (приблизительно в 100 км от Тобольска вниз по течению Иртыша) (Пельгунов и др., 2005). Перед обработкой в СВЧ-печи рыбу чистили (снимали чешую, удаляли внутренние органы), отделяли голову и хвост. От каждой подготовленной таким образом рыбы брали пробы мышц для выделения метацеркарий, которые служили контролем. После этого от этой тушки язей отрезали кусок необходимой массы (вместе с костями) и обрабатывали в СВЧ-печи в заданном режиме. После обработки вновь брали пробы мышц для выделения метацеркарий. Всего было проведено 17 опытов.

Метацеркарий O. felineus выделяли методом искусственного переваривания (Глазков, 1977). Жизнеспособность метацеркарий описторхид определяли несколькими способами: по сохранению морфологической структуры метацеркарий; по их подвижности; по выходу личинок под действием трипсина; методом биологической пробы, для чего было проведено экспериментальное заражение золотистых хомячков. В каждом опыте использовали одного язя. В опыте с заражением у каждой рыбы вырезали центральную часть тушки, из которой методом искусственного переваривания выделяли метацеркарий описторхисов для заражения хомяков (что служило контролем). Потом кусок массой 400 г обрабатывали в СВЧ-печи в заданном режиме. После обработки также методом искусственного переваривания выделяли метацеркарий и заражали животных. Через 2 нед хомяков усыпляли эфиром и подсчитывали число описторхисов в печени и поджелудочной железе. Было проведено 3 опыта, в которых использовали 21 экз. хомяков.

Трихинеллез. Опыты проводили с двумя капсулообразующими видами трихинелл T. spiralis (Owen, 1835) и T. nativа (Britov et Boev, 1972), первоначально выделенными из мышц домашней свиньи Sus scrofa domesticus Linnaeus, 1758 и из мышц бурого медведя Ursus arctos Linnaeus, 1758 соответственно, и с одним бескапсульным видом T. pseudospiralis (Garkavi, 1972), первоначально выделенным из мышц домашней кошки Felis catus domestica Erxleben, 1777. Культуру этих видов трихинелл поддерживали на лабораторных грызунах в условиях вивария института. Экспериментально инвазированных белых крыс и мышей усыпляли диэтиловым эфиром, у тушек удаляли шкуру и внутренние органы, а мышечную ткань измельчали и подвергали биохимическому перевариванию в искусственном желудочном соке (ИЖС), содержащем 1% соляной кислоты (уд. масса 1.175) и 3% пепсина. Свежеприготовленный ИЖС нагревали до 40 ± 2°С в аппарате “Гастрос” (завод “Петролазер”, Санкт-Петербург, Россия), и в течение 2 ч осуществляли протеолиз мышечной ткани. Декапсулированных личинок трихинелл помещали в подогретый до 37°С физиологический раствор, подсчитывали их число, а затем проводили заражение per os. беспородных кроликов в дозе 2 личинки на 1 г массы тела животного. В эксперименте были сформированы 3 группы кроликов, по 5 особей в каждой. Продолжительность инвазирования составила 90 сут.

От экспериментально инвазированных кроликов брали пласт мышц (массой 150–160 г, толщиной 1.5–2 см) с бедра и подвергали его СВЧ-облучению мощностью 800 Вт в течение 2 и 4 мин в бытовой микроволновой печи. Степень деструктивных изменений внутренних органов личинок трихинелл после обработки СВЧ-излучением изучали методом световой микроскопии. Жизнеспособность личинок определяли методом биопробы, скармливая обработанное мясо белым лабораторным крысам. В каждой опытной группе было по 10 белых беспородных крыс, а в трех контрольных – по 3. Положительным контролем для каждой группы служили животные, питавшиеся сырым зараженным трихинеллами мясом. Учет результатов опыта проводили через 45 сут методом протеолиза в ИЖС мышц тушек крыс опытных и контрольных групп (Pelgunov et al., 2016).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Описторхоз. По данным руководства по приготовлению рыбы в СВЧ-печах бытового применения большое значение имеют время обработки, масса продукта и мощность излучения, причем три этих параметра не связаны линейной зависимостью. Так, например, если мы увеличиваем массу обрабатываемого продукта в 2 раза, то время обработки увеличивается только в 1.5 раза (Микроволновая…, 2002). Три параметра, связанные нелинейной зависимостью, приводят к определенным сложностям в постановке опыта, поэтому единственный критерий эффективности СВЧ-облучения при обеззараживании рыбной продукции – гибель метацеркарий.

Проведенные опыты показали высокую эффективность СВЧ-излучения при обеззараживании рыбы от личинок описторхисов. Так, при обработке 800 г рыбы в рабочем режиме 800 Вт в течение 4 мин все метацеркарии описторхисов погибали, причем рыба еще не была готова к употреблению. При меньшей массе рыбы можно использовать меньшую мощность СВЧ-излучения или сокращать время обработки, что даст возможность далее использовать другие методы приготовления рыбы (табл. 1).

Наиболее точный критерий жизнеспособности метацеркарий O. felineus – постановка биопробы. Мы провели экспериментальное заражение золотистых хомячков метацеркариями описторхисов, полученных от спонтанно-зараженных язей. Было поставлено три опыта, во всех опытах масса обрабатываемого куска рыбы была одинаковой – 400 г, мощность СВЧ-печи – 800 Вт, время облучения – 2, 4 и 6 мин (табл. 2).

Навеска для порционного блюда, наиболее часто встречающаяся в руководствах по приготовлению рыбы в СВЧ-печах, 400–500 г рыбы.

Экспериментальное заражение животных метацеркариями описторхисов, прошедших обработку СВЧ-излучением, подтвердило высокую эффективность данного воздействия на жизнеспособность и инвазионность личинок. Так, при обработке рыбы в течение 4 мин при мощности 800 Вт рыба была не готова, но ни одно животное не заразилось описторхидами. При шестиминутной обработке и рабочем режиме СВЧ-печи 800 Вт рыба была готова к употреблению. Разброс данных по приживаемости метацеркарий описторхисов в контроле во многом объясняется тем, что для опытов брали разных язей, спонтанно-зараженных личинками описторхисов (табл. 2).

Трихинеллез. По результатам экспериментальных исследований трихинеллами заразились все крысы из контрольных групп, которым давали сырое мясо, инвазированное личинками трихинелл, с интенсивностью инвазии в среднем 725.3 (T. spiralis), 237.8 (T. Pseudospiralis), 65.1 (T. nativa) личинки на 1 г мышечной ткани. Интенсивность инвазии T. spiralis у крыс, питавшихся зараженным мясом после двухминутного его СВЧ-облучения (800 Вт), составила 0.02–0.03 личинки на 1 г, причем заразились только 3 крысы из 10. Для T. nativa был получен аналогичный результат – 0.03–0.05 личинки на 1 г, при этом заразились 3 крысы из 10, а в опыте с T. pseudospiralis зараженных трихинеллами крыс выявлено не было. Крысы из групп, питавшихся мясом после четырехминутного воздействия на него СВЧ-излучения (800 Вт), были свободны от трихинеллезной инвазии.

Морфологический анализ личинок, выделенных из мышц после обработки их СВЧ-излучением, показал следующее:

при двухминутной обработке у большинства T. spiralis были разрушены капсулы и внутренние органы, у T. pseudospiralis – кутикула и внутренние структуры, у T. nativа произошла деструкция клеточной структуры, отслоение кутикулы;

при четырехминутной обработке у T. spiralis, T. pseudospiralis и T. nativa было отмечено полное разрушение личинок (рис. 1).

Рис. 1.

Личинки трихинелл после воздействия СВЧ-излучением (микрофото). а – T. spiralis (2 мин), б – T. spiralis (4 мин), в – T. pseudospiralis (2 мин), г – T. pseudospiralis (4 мин), д – T. nativa (2 мин), е – T. nativa (4 мин).

Бескапсульная форма трихинелл T. pseudospiralis оказалась более чувствительной к СВЧ-излучению, чем капсульные формы T. spiralis и T. nativa. Можно предположить, что капсула защищает от СВЧ-излучения.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Среди электромагнитного излучения (ЭМИ) радиоволнового (неионизирующего) диапазона выраженным биологическим действием обладают сверхвысокочастотные ЭМИ или микроволны. Наиболее хорошо изучен тепловой эффект микроволн, связанный с повышением температуры облучаемой ткани. Наряду с тепловым воздействием микроволны вызывают в биологических объектах и нетепловые, например резонансные, эффекты, наблюдаемые экспериментально не только на фоне повышения температуры, но и без существенного нагрева (Исмаилов, 1987).

Наиболее наглядно нетепловое действие микроволн проявляется на организменном и частично клеточном уровне; в меньшей мере на молекулярном уровне. По мнению Пресмана, это обстоятельство объясняется тем, что действие электромагнитный полей на живую ткань носит не только энергетический, но и информационный характер (Пресман, 1968).

В механизмах поглощения СВЧ-энергии биологическими объектами существенную роль играет вода. Она вносит определяющий вклад в диэлектрические потери СВЧ-энергии в биологической ткани.

Релаксация дипольных молекул воды и колебания свободных зарядов в СВЧ-поле наиболее наглядно определяют тепловой эффект ЭМИ. При этом в результате нагревания клеток и тканей организма происходит изменение физико-химических свойств биологических структур. В мощных полях эти изменения приобретают необратимый характер и вызывают гибель организма.

По нормам СанПиН 3.2.3215-14 (2015), созданных на основании результатов многочисленных работ разных авторов, карповые рыбы из неблагополучных по описторхозу районов должны проходить определенную обработку. Это промораживание рыбы (минимальная температура – 28°С в течение 32 ч), горячая термическая обработка рыбопродуктов (проваривание порционных кусков рыбы не менее 20 мин с момента закипания, крупные куски рыбы необходимо жарить в распластованном виде не менее 20 мин), просаливание рыбы при условии достижения массовой доли соли в мясе рыбы 14%. В домашних условиях это, в частности промораживание, выполнить практически невозможно. Более того, рыбопродукция из карповых видов рыб, прошедшая технологическую обработку на рыбозаводах и официально реализуемая населению, в ряде случаев содержит жизнеспособные личинки описторхид (Гузеева, Ключников, 2002). Поэтому актуальной остается разработка новых методов обеззараживания рыбы в домашних условиях от метацеркарий описторхиса и других личинок паразитов.

Личинки T. nativa сохраняют жизнеспособность и инвазионность в трупах плотоядных животных в природных условиях длительное время. Так, в замороженном состоянии личинки остаются инвазионными в течение 4–5 лет. В естественных условиях при нахождении трупа инвазированного животного в зоне морской литорали личинки трихинелл сохраняют жизнеспособность в течение года и более, перенося условия арктической зимы. Проведенные эксперименты показали, что в традиционном на Чукотке продукте “Копальхен” при –12…–14°С трихинеллы сохраняют инвазионность на протяжении 4.5 лет (Букина и др., 2013). В мясе, подвергнутом традиционному вялению (высушиванию при потере массы 60–70%), часть инкапсулированных личинок трихинелл также сохраняют свою жизнеспособность. Слабое соление, горячее и особенно холодное копчение мясных продуктов не гарантируют обеззараживания мяса от трихинелл.

Ранее были выполнены большие объемы работ по влиянию СВЧ-излучения при приготовлении в бытовых микроволновых печах мяса, зараженного личинками трихинелл (Carlin et al., 1982; Kotula et al., 1982, 1983; Zimmermann, 1983, 1984; Редькин, Боровков, 2007). В основном авторы уделяли внимание степени готовности мяса, температуре внутри обрабатываемого мяса и влиянию температуры на жизнеспособность личинок. При этом они не учитывали влияние СВЧ-излучения на самих личинок трихинелл и часто не указывали мощность СВЧ-печи, при которой работали.

Эффект воздействия СВЧ-излучения на биологические объекты определяется количеством проникающей и поглощаемой ими электромагнитной энергии. Значительная часть энергии микроволн превращается в тепло, а колебания ионов и дипольных молекул воды в тканях приводят к разрушению внутренних органов и даже разрыву тела личинок трихинелл. При обработке зараженного трихинеллами мяса и рыб, пораженных метацеркариями описторхисов, необходимо учитывать проникающую способность СВЧ-излучения, время и мощность облучения, массу облучаемого объекта. Температурный фактор нагревания окружающей среды (мышечная ткань) вокруг паразита носит вторичный характер. Это полностью согласуется с ранее опубликованными данными (Пресман, 1968; Рогов, Адаменко, 1971) о влиянии СВЧ-излучения на микроорганизмы.

Важно отметить, что капсульные трихинеллы более устойчивы к СВЧ-излучению, чем бескапсульные, но это предположение нуждается в дальнейшей проверке.

По нормам СанПиНа термическая обработка рыб карповых пород из неблагополучных по описторхозу районов – проваривание не менее 20 мин с момента закипания небольшими кусками (СанПиН 3.2.3215-14, 2015).

Сравнивая время обработки (4 и 20 мин), мы предполагаем, что эта разница обусловлена тем, что при проваривании метацеркарии нагреваются снаружи (от окружающей ткани), а при СВЧ-облучении нагревается сам организм метацеркарий (изнутри), что и приводит к такой разнице в длительности обработки.

Таким образом, бытовые микроволновые печи могут эффективно обеззараживать продукты животного происхождения от возбудителей инвазионных болезней, и прежде всего таких актуальных зоонозных гельминтозов, как описторхоз и трихинеллез, а следовательно, могут быть эффективным средством профилактики этих гельминтозов у человека. Данные исследования нуждаются в продолжении.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН № 41 “Биоразнообразие природных систем и биологические ресурсы России”.