Известия РАН. Серия биологическая, 2022, № 1, стр. 102-107

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Половозрелых рыб отлавливали с помощью жаберных сетей по всей акватории озера в июне – августе 2013 г. Исследовали 16 особей носатого (средняя масса 383 ± 39 г, средняя длина 300 ± 17 мм), 28 – белого (410 ± 84 г, 311 ± 25 мм), 5 – длинноголового (875 ± 139 г, 425 ± 54 мм), 15 – большеротого (139 ± 12 г, 254 ± 11 мм) и 9 – малоротого (57 ± 6 г, 182 ± 5 мм) гольцов. У отловленных рыб после вскрытия в стерильные пробирки отбирали образцы иммунокомпетентных органов (почка, селезенка и печень). Затем пробы замораживали в жидком азоте. В лабораторных условиях непосредственно перед анализом пробы размораживали при комнатной температуре. Для дальнейших исследований из тканей почки, селезенки и печени с помощью гомогенизатора готовили гомогенат с физиологическим раствором в соотношении 1 : 1.

В гомогенатах исследовали содержание неспецифических иммунных комплексов (ИК), продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и уровень антиокислительной защиты (АЗ). Выбор данных показателей обусловлен тем, что они отражают реакцию рыб на заражение паразитами, антропогенное загрязнение и изменение качества среды обитания (Микряков и др., 2001; Силкина, Микряков, 2005; Силкина и др., 2012).

Содержание ИК устанавливали спектрофотометрически при длине волны 450 нм методом селективной преципитации с 4%-ным полиэтиленгликолем мол. массой 6000 (Гриневич, Алферов, 1981).

Интенсивности ПОЛ определяли по накоплению малонового диальдегида (МДА) – одного из конечных продуктов перекисного окисления. Концентрацию МДА устанавливали по количеству продуктов ПОЛ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой и дающих с ней окрашенный комплекс. Интенсивность окрашивания оценивали спектрофотометрически по изменению максимума поглощения при 532 нм (Андреева и др., 1988). Содержание МДА вычисляли с учетом коэффициента молярной экстинкции: 1.56 × 10⁵/(М см) и выражали в наномолях на 1 г ткани.

Об общей антиокислительной активности судили по кинетике окисления субстрата восстановленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола кислородом воздуха по общепринятой методике (Семенов, Ярош, 1985). Сущность метода заключается в том, что, чем выше скорость окисления субстрата в присутствии биологического материала, тем ниже содержание антиоксидантов в тканях. Константу ингибирования окисления субстрата (КОС), являющуюся показателем антиокислительной активности ткани, определяли относительно контроля по формуле: K_i = K_кон – K_оп/С, где K_кон и K_оп – константы скорости окисления субстрата соответственно в контроле и в опыте; С – концентрация биологического материала в кювете.

Статистическую обработку результатов исследования проводили по стандартным алгоритмам, реализованным в пакете программ Statistica v.6.0, с использованием t-теста. Различия считали значимыми при p ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ содержания ИК, МДА и КОС в печени, почке и селезенке гольцов, обитающих в оз. Кроноцкое, выявил межтканевые и межвидовые различия данных показателей.

Анализ полученных данных показал различия содержание ИК в разных органах у исследуемых видов гольцов (рис. 1). Высокое содержание ИК обнаружено в печени носатого (15.65 ± 6.93 ус. ед.), большеротого (5.95 ± 1.71 ус. ед.) и малоротого гольца (6.98 ± 1.63 ус. ед.), а низкое – в почке большеротого (0.58 ± 0.24 ус. ед.), печени (0.9 ± ± 0.34 ус. ед.) и почке (0.7 ± 0.1 ус. ед.) длинноголового гольца. В органах белого гольца зафиксированы незначительные отличия уровня ИК. У 3-х видов гольцов наибольшее содержание ИК обнаружено в печени, у белого – в почке (3.0 ± 0.9 ус. ед.) и длинноголового – в селезенке (2.21 ± 0.52 ус. ед.). ИК – комплексы антиген-антитело и связанные с ними компоненты комплемента, образующиеся в результате взаимодействия с низкомолекулярными чужеродными соединениями (гаптенами, растворимыми антигенами и аутоантигенами). Они играют важную роль в процессах регуляции иммунных реакций, элиминации ксенобиотиков из организма и поддержании иммунологического и биохимического гомеостаза. Клетки крови с помощью компонентов комплемента связывают растворимые ИК и доставляют к макрофагам иммунокомпетентных органов, тем самым обеспечивая клиренс крови от ИК. Нарушение этого механизма наблюдается при инфекционных, инвазионных, токсических и аутоиммунных болезнях. Избыток ИК подавляет функциональное состояние иммунной системы и может приводить к развитию патологии (Ройт и др., 2000). Содержание ИК наиболее повышено у носатого гольца, особенно по сравнению с белым и длинноголовым, что соответствует данным предыдущего исследования (Гордеев и др., 2017). Однако на этот раз высокий показатель зафиксирован только в печени, тогда как ранее – во всех органах. У впервые исследованных форм (видов), большеротого и малоротого гольцов, уровень ИК, также выше, чем у белого и длинноголового.

Рис. 1.

Содержание ИК в печени, почке и селезенке гольцов Salvelinus sp. Кроноцкого озера. Примечание. Здесь и на рис. 2 и 3: 1 – белый, 2 – носатый, 3 – длинноголовый, 4 – большеротый, 5 – малоротый голец; а – значимые различия от белых гольцов; б – значимые различия от носатых гольцов; в – значимые различия от длинноголовых гольцов; г – значимые различия от большеротых гольцов при p ≤ 0.05.

Максимальные значения МДА отмечены в почке (5.95 ± 1.71 нмоль/г) и селезенке большеротого (5.75 ± 1.65 нмоль/г) и печени (4.32 ± 1.35 нмоль/г) белого гольца (рис. 2). Минимальные значения зафиксированы в почке белого (1.98 ± 0.18 нмоль/г) и длинноголового (2.05 ± 0.28 нмоль/г), печени носатого (1.99 ± 0.33 нмоль/г) и большеротого (2.01 ± 0.4 нмоль/г) и селезенке малоротого (1.81 ± ± 0.51 нмоль/г) гольца. Сравнение содержания МДА у разных форм показало, что большие отклонения выявлены в почке и печени, а небольшие – в селезенке. Ранее значительное изменение показателя уровня ПОЛ у исследуемых форм (видов) было зафиксировано в почке, а в других тканях и органах – незначительное (Гордеев и др., 2017). На наш взгляд, полученные результаты указывают на наличие зависимости между окислительными процессами и особенностями структурно-функциональной организации исследуемых органов, а также содержанию гранулоцитов, наиболее интенсивно образующих АФК. Например, в почке, богатой гранулоцитами, процессы ПОЛ происходят более интенсивно, чем в печени и селезенке с низкой долей содержания этих клеток (Zapata et al., 1996; Van Muiswinkel, Van der Wal, 2006; Грушко и др., 2009).

Рис. 2.

Уровень МДА в печени, почке и селезенке гольцов Salvelinus sp. Кроноцкого озера.

Следует отметить, что в стационарных условиях во всех клетках живого организма в небольших количествах постоянно образуются АФК. Они участвуют в процессах клеточного метаболизма и их негативное влияние на клетки и ткани нейтрализуется системой АЗ (антиоксидантными ферментами: супероксиддисмутазой, каталазой, глутатионпероксидазой, глутатион-s-трансферазой) и низкомолекулярными антиоксидантными соединениями (б-токоферолом, восстановленным глутатионом, фенольной формой коэнзима Q₁₀, в-каротином, аскорбиновой кислотой и др.). В отличии от МДА наибольшее колебание показателя КОС, фиксирующего уровень АЗ, отмечены в селезенке (рис. 3). В этом органе минимальные значения КОС характерны для белого гольца (0.57 ± 0.29 л/мл ⋅ мин), а максимальные – для большеротого (5.75 ± 1.65 л/мл ⋅ мин). Низкие значения КОС в исследуемых органах указывают на высокую активность АЗ.

Рис. 3.

Уровень КОС в печени, почке и селезенке гольцов Salvelinus sp. Кроноцкого озера.

Проведенное исследование показало высокий уровень межтканевых различий липидопереокислительных и антиокислительных процессов, происходящих в организме гольцов оз. Кроноцкое. Установленные различия показателей МДА и КОС, отражающие изменение окислительно-восстановительного баланса, видимо, обусловлены разным уровнем содержания антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных соединений, обеспечивающих динамическое равновесие в прооксидант-антиоксидантной системе.

Нарушение баланса в системе “прооксидант–антиоксидант” в сторону активации перекисеобразовательных процессов установлено у зараженных паразитами рыб (Силкина, Микряков, 2005; Силкина и др., 2012). Интенсивность уровня заражения также зависит от функционального состояния иммунной системы (Микряков и др., 2011; Микряков, Микряков, 2015). У носатого гольца отмечены пиковые значения ИК в печени. Возможно, это связано с высокой инвазией нематоды Cystidicola farionis, паразитирующей в плавательном пузыре, индекс обилия которой составляет 169 экз/рыбу, а также гиперинвазией трематодами рода Crepidostomum (индекс обилия = 3461.3) (Бусарова и др., 2016). Патогенность C. farionis проявляется в изменении функций плавательного пузыря (Willers et al., 1991; Faisal et al., 2010), что может приводить к элиминации слабых рыб (Giaever et al., 1991). Показатели ИК, МДА и КОС у других форм гольцов не позволяют однозначно соотнести их с показателями зараженности паразитами.

Таким образом, полученные нами различия в уровнях исследуемых показателей в печени, почке и селезенке у носатого, белого, длинноголового, большеротого и малоротого гольцов из оз. Кроноцкое, по-видимому, связаны с видовыми и экологическими особенностями рыб, такими как образ жизни, тип питания, локальный уровень зараженности паразитами и т.д. Дальнейшие исследования c большей выборкой помогут понять уровень физиологических различий между формами, а также могут быть использованы для мониторинга состояния здоровья популяции и сравнения с близкородственными видами.

Благодарности. Авторы выражают благодарность Е.В. Есину (ИПЭЭ РАН, ФГБНУ “ВНИРО”) за помощь в подготовке рукописи и ценные замечания.

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания № 121050500046-8.